CN106434537A - 一种培养、诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法及培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培养及诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法，包括如下步骤：a)用含10％～15％胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养，培养7天时间；b)更换诱导培养基继续培养，诱导7‑14天后，对细胞进行油红O染色，显微镜下可见细胞膜边缘较为模糊，胞内被染为红色的脂滴；本发明还提出了对罗非鱼腹腔前脂肪细胞进行传代的方法，用增殖培养基培养前脂肪细胞14～20天后，以2～3×105个/ml接种，培养2～3天，细胞可长满细胞板。本发明的方法可以成功地对罗非鱼腹腔前脂肪细胞进行体外培养、诱导及传代，为罗非鱼脂代谢的研究提供了技术参考。

Description

一种培养、诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法及培养基
技术领域
本发明涉及水生动物营养技术领域，具体涉及一种培养及诱导罗非鱼腹腔前脂肪细胞的方法。
背景技术
自1962年Wolf等人建立了第一个鱼类细胞系，即虹鳟鱼(Oncorhynchusmykiss)生殖腺细胞系RTG-2以来，鱼类细胞培养技术不断发展成熟，从最初的用于鱼类病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备到目前环境毒理学、鱼类肿瘤学、生理学、内分泌学、遗传学和资源保护等方面的应用，鱼类细胞培养技术得到了广泛的应用。其主要原因在于，鱼类细胞培养作为一种新兴技术有着活体鱼养殖无法比拟的独特优势：(1)成本低；细胞系培养和保存无需较多的人力资源，且细胞培养标准化程度高，变异程度低(2)真实性与快速性；离体培养的原代细胞其生理功能接近在体状态，且实验周期短，不受实验动物生长周期的影响，可短期内快速得到实验结果。(3)可重复性好；离体培养细胞，可以精确控制实验条件，排除其他因素对实验结果的干扰，可以有针对性的开展实验研究。
鱼类中脂肪组织是主要的储能部位，脂肪组织在调控能量平衡中发挥了重大作用：既可以作为储能场所储存多余的能量，也可以在能量供应不足的情况下作为能量来源，释放脂肪酸提供能量。和哺乳动物类似的是，在鱼类中，脂肪组织的产生和脂质沉积是受基因，环境以及饮食因素的共同影响，由此引发脂肪细胞增殖和分化，从而导致脂肪组织肥大。因此，构建脂肪细胞体外培养体系，研究脂肪细胞分化过程，是探讨生物体脂质代谢规律的重要手段。而与细胞系相比，原代脂肪细胞是直接从生物体内获得且生长在一个相对简单的环境中，更能反映生物体的状态。
目前，哺乳动物方面已经构建了大鼠、人、牛和猪的前体脂肪模型，而鱼类脂肪细胞体外培养的研究工作刚开始不久。国外已开展了虹鳟、大西洋鲑、真鲷脂肪细胞培养的研究，而国内的工作仍处于起步阶段。
罗非鱼(Tilapia)原产于非洲，是一种热带内陆性鱼类。其生长快，产量高，耐低氧，适应性和抗病力强，在淡咸水中均能生存。目前已成为世界性的主要养殖鱼类。随着罗非鱼的市场需求增大，水产养殖也朝着集约化方向发展，而淡水养殖过程中，养殖户为了提高罗非鱼产量，大量投喂高脂饲料，造成鱼类脂肪大量沉积，鱼类抗病能力下降，因此，研究罗非鱼脂肪组织的发生和代谢就尤为重要。到目前为止，罗非鱼的脂肪细胞培养体系的建立尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一种培养罗非鱼前脂肪细胞，并诱导其分化为成熟的脂肪细胞的方法。该方法具有快速、可有效保留前细胞活性等优点，为研究罗非鱼脂代谢提供了新的研究思路和技术手段。
本发明中所采用的DMEM/F12培养基的成分为：
本发明提出了一种增殖培养基，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。
优选地，加入胎牛血清的体积百分比为15％。
优选地，所述增殖培养基可以进一步加入1％(体积百分比)双抗，其中所述双抗为100单位的青霉素和100μg链霉素。
本发明提出了一种诱导培养基，包括：在DMEM/F12培养基中加入10～15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％～1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)。
优选地，所述诱导培养基，包括：在DMEM/F12培养基中加入15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)。
本发明还提出了一种对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养的方法，包括：
用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天。
其中，所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；
优选地为，每4天换液一次；
接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml
培养5～7天时，细胞长至汇合阶段；优选地，所述培养的时间为7天。
本发明还提出了一种诱导罗非鱼前脂肪细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
a)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天；
b)更换上述诱导培养基，诱导7～14天。
其中，所述步骤a)中，
所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；
优选地为，每4天换液一次；
接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml
培养5～7天时，细胞长至汇合阶段；优选地，所述培养的时间为7天。
其中，所述步骤b)中，
所述诱导的温度优选地为28℃；
所述诱导的时间优选地为12天；对细胞进行油红O染色，显微镜下观察油红染色结果，可见诱导成功的罗非鱼前脂肪细胞的细胞膜边缘较为模糊，胞内脂滴被染为红色。
本发明还提出了一种对罗非鱼前脂肪细胞传代的方法：
1)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养14-20天。
2)用上述增殖培养基将步骤1)培养的前脂肪细胞，用0.12％的胰蛋白酶消化，重悬，以2～3×105个/ml接种，在上述增殖培养基中，20～30℃条件下培养2～3天。
其中，所述步骤1)中，
所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；
优选地为，每4天换液一次；
接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml
优选地，所述培养的时间为2～3，优选地为，3天。
本发明步骤1)中对罗非鱼增殖培养的时间为14-20天，若培养低于14天，细胞传代后无法正常增殖，最终细胞全部死亡。
其中，所述步骤2)中，
所述增殖培养基与步骤1)中增殖培养基组成相同；
所述培养的温度优选地为28℃；培养的CO2浓度为5％；
优选地为，每4天换液一次；
接种细胞的浓度范围为2～3×105个/ml；优选地，为2.5×105个/ml，所述培养2～3天时，细胞长至汇合阶段，细胞可长满细胞板。
本发明的一个具体实施例包括如下步骤：
(1)将刚刚死亡的罗非鱼(700～900g)，剪断鳃弓；
(2)无菌条件下，快速分离出肠系膜周围的脂肪组织，直接放入Krebs-Henseleit缓冲液中，清洗三次，剪碎置于离心管中，再加入等体积的消化酶于28℃水浴震荡消化1h；
(3)用100目的尼龙膜过滤悬浮的脂肪细胞，除去***，清洗三次；
(4)加入红细胞裂解液除去血细胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞。接种于细胞板中，28℃，5％CO2条件下进行培养，每4天换液一次，待细胞长至汇合阶段，更换诱导培养基继续培养。
(5)诱导12天后对细胞进行油红O染色，显微镜下观察油红染色结果。
在本发明的实验方案中，所述的消化酶是II型胶原酶，浓度是1％。
本发明的另一个实施例包括，将上述步骤(4)的前脂肪细胞培养14-20天后，用0.12％的胰蛋白酶消化，重悬，以2～3×105个/ml接种，培养2～3天，细胞可长满细胞板。
本发明还提出了将所述增殖培养基用于对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养的应用。
本发明还提出了将所述增殖培养基用于对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养和诱导中的应用。
本发明还提出了将所述增殖培养基在对罗非鱼前脂肪细胞传代中的应用。
本发明提出了将所述诱导培养基用于对罗非鱼前脂肪细胞诱导的应用。
另外，本发明所述的实验方案中，所用的油红O母液的配制方法为：称取油红O粉末350mg，溶于100ml异丙醇中，磁力搅拌过夜，之后通过孔径大小为0.22μm的滤膜过滤后4℃保存。油红O染液工作液的配制方法为：油红O染料母液与超纯水按体积比3：2的比例混合，室温静置10min，采用孔径大小为0.22μm的滤膜过滤。
本发明的有益效果在于：(1)目前，脂肪细胞体外培养模型的研究主要集中在哺乳动物上(例如：大鼠、人和猪)，而鱼类脂肪细胞体外培养的工作则处于起步阶段；(2)建立了培养罗非鱼前脂肪细胞，并诱导其分化为成熟的脂肪细胞，排除了外界环境和内部因素对脂肪细胞脂代谢的影响，为研究罗非鱼脂代谢提供了新的研究思路和技术手段；(3)本发明通过提取和培养罗非鱼腹腔脂肪细胞，建立了热带鱼脂肪细胞模型，推广应用方便，应用前景广泛；(4)本发明的方法可以成功地对罗非鱼腹腔前脂肪细胞进行体外培养及诱导，并实现体外传代培养。
附图说明
图1为实施例1中将提取的罗非鱼腹腔脂肪细胞接种于细胞板中，28℃，5％CO2，刚贴壁的前细胞呈现透明圆形，胞内无明显脂滴，均匀分散在细胞板底部，具有增殖和分化功能。中性脂肪细胞中有较为明显的脂滴，无增殖功能，在培养过程中，可通过细胞换液分离出去。
图2为实施例1中罗非鱼腹腔脂肪细胞培养7天的细胞状态，细胞呈梭形并铺满整个细胞板板底，中性脂肪细胞大量减少
图3为实施例1中诱导培养12天，脂肪细胞内产生明显的脂滴，在细胞中呈圆形分布。细胞边缘模糊化，通过油红染色可观察被染色的脂滴，中性脂肪细胞几乎消失。
图4为高倍镜下观察诱导培养12天的脂肪的细胞形态，细胞膜边缘模糊化，可见胞内被油红染为红色的脂滴，数量较多，体积较大。
图5为将长满的细胞传代至新的细胞板中，培养2～3天，细胞可铺满整个细胞板底。
图6为使用草鱼脂肪细胞诱导剂(草鱼诱导培养基)处理12天，细胞分化情况。通过油红染色，可见细胞中出现的脂滴模糊，无清晰的形态。中性脂肪细胞几乎消失。
图7为使用哺乳动物脂肪细胞诱导剂(哺乳动物诱导培养基)诱导处理12天，细胞分化情况。细胞中出现较为清晰的脂滴，围绕细胞中心呈圆形分布，但数量和体积较少。
图8为用含10％胎牛血清的增殖培养基，培养7天，细胞增殖速度较慢，且无法铺满整个板底。
图9为细胞接种密度低于2～3×105个/ml，培养7天，细胞无法铺满整个板底，且细胞数量不断减少。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
在本发明中，脂肪组织或脂肪原料均来源于700～900g的罗非鱼，若罗非鱼体型偏小或是偏瘦，前脂肪细胞的增殖能力会受抑制。实验时间，选在春秋季节较佳，冬季气温低，罗非鱼的脂肪细胞增殖能力也会受抑制。
脂肪细胞诱导分化及检测
由于前脂肪细胞具有增殖和分化的能力，在一定的条件下对前脂肪细胞进行诱导分化，能得到功能稳定的成熟脂肪细胞。
对前脂肪细胞进行诱导的方法是向培养液中加入地塞美松(DEX)、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)、吲哚美辛(Indo)以及胰岛素(insulin)。因为前细胞膜上胰岛素受体很少，所以需加超过生理浓度的胰岛素，以其激活细胞膜上的IGF1受体，通过IGF1通路来诱导分化，前脂肪细胞诱导成脂进行检测。
本领域内的技术人员可以使用通用的方法和染料对前脂肪细胞诱导成脂进行检测。最常用的染料是Oil Red(O)，即油红O。油红O是一种红色粉末，分子式为C26H24N4O。油红O属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三酯结合呈小脂滴状。脂溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当对组织或细胞与染料接触时，染料则离开染液而溶于组织或细胞内的脂质(如脂滴)中，使组织或细胞内的脂滴呈橘红色。在显微镜下可以清楚地进行成脂染色观察。用异丙醇将细胞内的油红O溶出，通过检测OD值，可以将成脂结果进行定量分析。
实施例1
本实施例以“体外提取和培养罗非鱼(Tilapia)腹腔脂肪细胞”示例
1、实验动物：
刚刚死亡的(也可以是从市场买回的，健康且无体表无损伤)的罗非鱼(700～900g)
2、实验步骤：
(1)剪断鳃弓放血(若是健康的罗非鱼，则需将罗非鱼用MS-222麻醉)；
(2)无菌条件下，快速分离出肠系膜周围的脂肪组织，直接放入Krebs-Henseleit缓冲液中，清洗三次，剪碎置于离心管中，再加入等体积的1％II型胶原酶于28℃水浴震荡消化1h；
(3)用100目的尼龙膜过滤悬浮的脂肪细胞，除去***，清洗三次；
(4)加入红细胞裂解液除去血细胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于细胞板中，28℃，5％CO2条件下进行培养，每4天换液一次，待细胞长至汇合阶段，更换诱导培养基继续培养。
(5)诱导12天后对细胞进行油红O染色，显微镜下观察油红染色结果。
本实施例中，步骤(4)中增殖培养基为含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基。
本实施例中，步骤(4)中所述的诱导培养基由含有15％胎牛血清和0.1％牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基，然后加入15μg/ml胰岛素(insulin)，0.2mM吲哚美辛(Indo)，1μM地塞美松(DEX)，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(IBMX)组成。
本实施例中，所用的油红O母液的配制方法为：称取油红O粉末350mg，溶于100ml异丙醇中，磁力搅拌过夜，之后通过孔径大小为0.22μm的滤膜过滤后4℃保存。油红O染液工作液的配制方法为：油红O染料母液与超纯水按体积比3：2的比例混合，室温静置10min，采用孔径大小为0.22μm的滤膜过滤。该工作液不能长效保存，宜现配现用。
本实施例中，生长状态良好的细胞外观透明，立体感强，且有触足伸出。
本实施例中，诱导分化成功的细胞，其内部出现大量脂滴，其他细胞器几乎消失，细胞膜模糊化。
3、实验结果
(1)如图1所示，将提取的罗非鱼腹腔脂肪细胞接种于细胞板，于28℃，5％CO2培养。此时提取的前脂肪细胞刚贴壁时间短，镜下显示的为圆形细胞。
(2)如图2所示，罗非鱼腹腔脂肪细胞培养7天，前脂肪细胞可铺满整个细胞板。脂肪细胞在生长过程中，不断伸展迁移，呈现出梭形结构。
(3)如图3所示，诱导培养12天，脂肪细胞内产生明显脂滴，油红染色后，镜下可观察到细胞内被染为红色的脂滴。
(4)图4为高倍镜下观察诱导培养12天的脂肪细胞的细胞形态，被油红染成红色的即为胞内脂滴。
本发明通过提取和培养罗非鱼腹腔脂肪细胞，体外诱导为成熟脂肪细胞，以研究罗非鱼脂肪细胞增殖分化过程。为研究罗非鱼脂代谢提供一个新的技术手段。
实施例2
实验步骤(1)～(3)同实施例1；
步骤(4)中，加入红细胞裂解液除去血细胞，用含胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于细胞板中，28℃，5％CO2条件下进行培养，每4天换液一次，培养14～20天；
(5)将所述培养的前脂肪细胞，用0.12％的胰蛋白酶消化，重悬，以2～3×105个/ml接种在增殖培养基中，培养2～3天，细胞可长满细胞板。
本实施例中，传代成功的细胞，可不断增殖，2～3天即可长满整个细胞板底。
图5为将步骤(4)培养的细胞传代至新的细胞板中，以2～3×105个/ml接种，培养2～3天，细胞可铺满整个细胞板底。
实施例3
其他条件同实施例1，当步骤(4)～(5)中诱导培养基为草鱼诱导培养基时，细胞产生的脂滴不明显，如图6所示为草鱼诱导培养基诱导培养12天时，通过油红染色，可见细胞中出现的脂滴模糊，细胞中几乎看不到清晰的脂滴产生。中性脂肪细胞几乎消失。
所述草鱼诱导培养基的组成为15％胎牛血清的DMEM/F12培养基，胰岛素20μg/ml，***1μmol/L，三碘甲腺原氨酸10nmol/L。
实施例4
其他条件同实施例1，当诱导培养基为哺乳动物诱导培养基时，诱导处理12天，其结果如图7所示，细胞中产生脂滴，较为明显，围绕细胞中心在胞内呈圆形分布，但脂滴体积和数量较少。
其中，所示哺乳动物诱导培养基为DMEM培养基，其组成为：10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，15μg/ml胰岛素，0.2mM吲哚美辛，1μM DEX，0.5μM IBMX。
实施例5
其他条件同实施例1，步骤(4)中增殖培养基为10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，培养7天，细胞增殖状况如图8所示；细胞增殖速度较慢，且无法铺满整个板底。
图2为含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基培养7天时，细胞的增殖状况。由图8和图2相比可知，含15％的胎牛血清的DMEM/F12培养基培养的细胞增殖速度比含10％胎牛血清时的DMEM/F12培养基培养的细胞快。
实施例6
其他条件同实施例1，步骤(5)中接种密度低于或高于2～3×105个/ml，细胞的增殖受到抑制。图9为接种密度低于2～3×105个/ml的密度接种的细胞，培养7天的结果。细胞稀疏，细胞无法持续增殖而铺满整个板底，且细胞数量不断减少。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

Claims (10)

1.一种增殖培养基，其特征在于，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。
2.如权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，加入胎牛血清的体积百分比为15％。
3.如权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基可以进一步加入1％(体积百分比)双抗，其中所述双抗为100单位的青霉素和100μg链霉素。
4.一种诱导培养基，其特征在于，在DMEM/F12培养基中加入10～15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％～1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素，0.2mM吲哚美辛，1μM地塞美松，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤。
5.一种对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养的方法，其特征在于，用上述增殖培养基重悬细胞；以2～3×105个/ml的密度接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天；
其中，所述增殖培养基为，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。
6.一种诱导罗非鱼前脂肪细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养5-7天；
b)更换上述诱导培养基，诱导7～14天；
其中，所述增殖培养基为，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清；
所述诱导培养基为，在DMEM/F12培养基中加入10～15％(体积百分比)胎牛血清和0.1％～1％(质量百分比)牛血清白蛋白，15μg/ml胰岛素，0.2mM吲哚美辛，1μM地塞美松，0.5μM1-甲基-3-异丁基黄嘌呤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤b)中，所述诱导培养基的时间为12天。
8.一种对罗非鱼前脂肪细胞传代的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)用上述增殖培养基重悬细胞；接种于细胞板中，20～30℃、5％CO2条件下进行培养14-20天；
2)用上述增殖培养基将步骤1)培养的前脂肪细胞，用0.12％的胰蛋白酶消化，重悬，以2～3×105个/ml接种，在上述增殖培养基中，20～30℃条件下培养2～3天；
其中，所述增殖培养基为，在DMEM/F12培养基中加入10％～15％(体积百分比)的胎牛血清。
9.如权利要求1～3之任一项所述的增殖培养基用于对罗非鱼前脂肪细胞增殖培养、诱导、传代中的应用。
10.如权利要求4所述的诱导培养基在对罗非鱼前脂肪细胞诱导中的应用。
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