CN106434479B - 一种副猪嗜血杆菌5型500l发酵罐的高密度培养方法 - Google Patents

一种副猪嗜血杆菌5型500l发酵罐的高密度培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法。该方法步骤如下：A、将冻干副猪嗜血杆菌5型用TSA平板活化18～24h，至单菌落长出；B、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养6～14h至OD600值达到0.8～1.6；C、以1％～5％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养8～14h至OD600值达到2.0～3.5；D、将二级种子液以1％～5％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，发酵罐中盛有发酵罐培养基，培养条件为：温度35～39℃、罐压0.02～0.1Mpa、溶氧20～50％、pH7.3～7.8，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌得到。该方法原料制备简单，成本低廉，既能保证副猪嗜血杆菌生长旺盛，进行正常代谢，又能提高生长速度，生产周期短，活菌数较高，一般活菌数为72～80亿/毫升，完全能适应于副猪嗜血杆菌5型疫苗生产。

Description

一种副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法及应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPs)是常规饲养猪群上呼吸道的一种常在菌，但在特定条件下可以侵入机体并引起严重的全身性疾病，以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征，该病又称为革拉瑟氏病(Oliverira et al.,2004)。早期采用抗生素进行治疗，但是该菌耐药现象越来越常见，常用药物对该病已无明显的疗效，而且，随着人们对无药物残留、绿色食品需求的期望越来越高，目前许多国家对抗生素在动物饲料中应用的限制也越来越严格，抗生素在本病预防和控制等方面的应用必将受到严格限制和逐步禁止，因此，疫苗接种己成为预防和控制该病的主要措施。
TSB培养基作为副猪嗜血杆菌5型的传统的培养基，该培养基的基本成分为：葡萄糖2.5g/L，干酪素17g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，胰液大豆蛋白胨3g/L。该培养基的优点在于配制容易，且是复合的培养基。但成本较高，最后所得的活菌数较少，一般活菌数在15～20亿，且生产周期长，不适合公司大规模生产。
在本发明申请之前，武汉科前动物生物制品有限责任公司2011年6月1日已经申报一种高密度培养副猪嗜血杆菌用于疫苗制备的方法专利(专利申请号：201110145940.6)，该专利提供了一种适于副猪嗜血杆菌5型高效的培养方法，保护内容为一种高密度培养副猪嗜血杆菌的方法，该专利适用范围仅限于3-100L发酵罐。
本发明通过进一步优化培养基组成，同时通过在培养基、pH值、最适温度、通气量、罐压、溶氧浓度(DO)等方面进行探索，优化高密度培养的各种条件，进行工业放大研究，获得了一种适用于500L发酵罐副猪嗜血杆菌5型常规培养的培养方法，且可进一步提高菌体密度，最终可实现高密度培养的工艺控制参数的成套技术定型和规模化示范生产线。
参考文献：
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[2]Oliveira S,Pijoan C.Haemophilus parasuis:new trends on diagnosis,epidemiology and control.Vet Microbiol,2004b,99:1-12
发明内容
本发明的目的在于克服副猪嗜血杆菌5型难以放大培养和大规模工业生产的缺陷，针对副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐高密度发酵培养的需要而创造性地筛选的一种高性能的培养方法，该培养方法的原料制备简单，成本低廉，较常规的培养方法既能保证副猪嗜血杆菌生长旺盛，进行正常代谢，又能提高生长速度，生产周期短，活菌数较高，一般活菌数为72～80亿/毫升，节省劳动力成本，完全能适应于副猪嗜血杆菌5型疫苗生产。
本发明通过下列技术方案实现：
一种适用于副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法，步骤如下：
A、将冻干副猪嗜血杆菌5型用TSA平板活化18～24h，至单菌落长出；
B、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养6～14h至OD600值达到0.8～1.6；
C、以1％～5％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养8～14h至OD600值达到2.0～3.5；
D、将二级种子液以1％～5％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，发酵罐中盛有发酵罐培养基，培养条件为：温度35～39℃、罐压0.02～0.1Mpa、溶氧20～50％、pH7.3～7.8，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体；
所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：胰蛋白胨1～20g/L、酵母粉5～50g/L、酵母浸膏1～10g/L、氯化钠1～10g/L、醋酸铵1～10g/L、pH为7.4的1M磷酸缓冲液1％～30％V/V及添加一定量的牛血清5％～30％V/V和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.01～0.1mg/L。
上述方案中，发酵罐培养基装液量为250-350L。
上述方案中，发酵培养过程中搅拌转速与溶氧串联，当溶氧高于设定值时，搅拌转速自动调低，当溶氧低于设定值时，搅拌转速相应调高。
上述方案中，发酵培养条件中:通气量5～20m3/h。
上述方案中，二级种子培养基和发酵罐培养基的配制方法为：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的pH为7.4的1M磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
上述在培养过程中pH控制手段为：在培养过程中在线流加氨水溶液控pH值在7.3～7.8。
本发明的特点是：
培养基成分中以胰蛋白陈、酵母粉和酵母浸膏做为复合氮源,较以往专利培养基中单一氮源，营养更丰富,更有利于副猪嗜血杆菌5型生长繁殖；添加无机氮源醋酸铵,能迅速为副猪嗜血杆菌5型所吸收；缓冲盐体系的磷酸根不仅是核酸和辅酶的组成成分,而且缓冲体系可以起到一个很好的调节pH作用。副猪嗜血杆菌杆菌为兼性厌氧菌，发酵罐溶氧范围的控制对菌体生长起着重要作用。培养基的PH也是一个关键因素，通过前期pH优化实验，筛选出适合副猪嗜血杆菌5型生长的pH范围，最终该发明通过发酵培养基配方，pH控制，溶氧度等条件控制最终实现了副猪嗜血杆菌5型工艺在500L发酵罐上放大优化，从而解决了副猪嗜血杆菌5型难以大规模生产的技术难题。
本发明的有益效果：适用于副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度大规模培养，可以直接用于规模化生产，菌体生长快、菌体密度高，较以往发酵培养方法相比，可进一步提高发酵终点的活菌密度，并可以缩短发酵周期；且原料简单，成本低廉。
附图说明
图1是在500L发酵罐中，副猪嗜血杆菌5型在本发明的最佳实施例6制备的培养条件下的生长曲线。
具体实施方式
实施例1：培养方法的制备：
A、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养8h至OD600值达到0.8；
B、以1％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养8h至OD600值达到2.0；
C、将二级种子液以1％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装液量为300L，培养条件为：温度35℃、罐压0.02Mpa、通气量5m3/h、搅拌转速与溶氧串联、溶氧20％、pH7.3，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体，活菌数最高为78亿/毫升；
D、所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：胰蛋白胨(10g/L)、酵母粉(5g/L)、酵母浸膏(5g/L)、醋酸铵(5g/L)、氯化钠(5g/L)、pH为7.4的1M磷酸钾缓冲液(1％V/V)及添加一定量的牛血清(5％V/V)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.1mg/L)。
E、所述培养基配制方法：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
实施例2：培养方法的制备：
A、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养10h至OD600值达到0.9；
B、以2％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养12h至OD600值达到3.0；
C、将二级种子液以2％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装液量为300L，培养条件为：温度36℃、罐压0.04Mpa、通气量10m3/h、搅拌转速与溶氧串联、溶氧25％、pH7.8，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体，活菌数最高为73亿/毫升；
D、所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：酵母粉(10g/L)、胰蛋白胨(5g/L)、酵母浸膏(1g/L)、醋酸铵(2g/L)、氯化钠(4g/L)、pH为7.4的1M磷酸缓冲液(5％V/V)及添加一定量的牛血清(20％V/V)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.03mg/L)。
E、所述培养基配制方法：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
实施例3：培养方法的制备：
A、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养14h至OD600值达到1.6；
B、以5％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养9h至OD600值达到2.8；
C、将二级种子液以5％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装液量为300L，培养条件为：温度39℃、罐压0.06Mpa、通气量15m3/h、搅拌转速与溶氧串联、溶氧30％、pH7.5，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体，活菌数最高为74亿/毫升；
D、所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：酵母粉(20g/L)、胰蛋白胨(7g/L)、酵母浸膏(4g/L)、醋酸铵(4g/L)、氯化钠(10g/L)、pH为7.4的1M磷酸缓冲液(20％V/V)及添加一定量的牛血清(25％V/V)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.05mg/L)。
E、所述培养基配制方法：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
实施例4：培养方法的制备：
A、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养12h至OD600值达到1.2；
B、以3％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养10h至OD600值达到2.5；
C、将二级种子液以3％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装液量为300L，培养条件为：温度37℃、罐压0.08Mpa、通气量14m3/h、搅拌转速与溶氧串联、溶氧35％、pH7.6，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体，活菌数最高为75亿/毫升；
D、所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：酵母粉(30g/L)、胰蛋白胨(10g/L)、酵母浸膏(7g/L)、醋酸铵(2g/L)、氯化钠(1g/L)、pH为7.4的1M磷酸缓冲液(10％V/V)及添加一定量的牛血清(10％V/V)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.01mg/L)。
E、所述培养基成分中酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
实施例5：培养方法的制备：
A、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养11h至OD600值达到1.1；
B、以4％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养11h至OD600值达到2.8；
C、将二级种子液以4％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装液量为300L，培养条件为：温度38℃、罐压0.05Mpa、通气量17m3/h、搅拌转速与溶氧串联、溶氧40％、pH7.7，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体，活菌数最高为77亿/毫升；
D、所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：酵母粉(40g/L)、胰蛋白胨(15g/L)、酵母浸膏(3g/L)、醋酸铵(7g/L)、氯化钠(6g/L)、pH为7.4的1M磷酸缓冲液(15％V/V)及添加一定量的牛血清(14％V/V)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.04mg/L)。
E、所述培养基配制方法：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
实施例6：培养方法的制备：
A、挑取4～8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养13h至OD600值达到1.6；
B、以5％V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养13h至OD600值达到3.2；
C、将二级种子液以5％V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，培养基装液量为300L，培养条件为：温度37℃、罐压0.06Mpa、通气量14m3/h、搅拌转速与溶氧串联、溶氧50％、pH7.4，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体，活菌数最高为80亿/毫升；
D、所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：酵母粉(40g/L)、胰蛋白胨(5g/L)、酵母浸膏(1g/L)、醋酸铵(1g/L)、氯化钠(1g/L)、pH为7.4的1M磷酸缓冲液(10％V/V)及添加一定量的牛血清(15％V/V)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(0.07mg/L)。
E、所述培养基配制方法：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。

Claims (5)

1.一种副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法，其特征在于：步骤如下：
A、将冻干副猪嗜血杆菌5型用TSA平板活化18~24h，至单菌落长出；
B、 挑取4~8个单菌落至TSB摇瓶一级种子培养基中，培养6~14h至OD600值达到0.8~1.6；
C、以1%~5%V/V接种量将一级种子液转接自配二级摇瓶种子培养基，培养8~14h至OD600值达到2.0~3.5；
D、将二级种子液以1%~5%V/V接种量接种于500L发酵罐的灭菌培养基中，发酵罐中盛有发酵罐培养基，培养条件为：温度35~39 ℃、罐压0.02~0.1Mpa、溶氧20~50%、pH74~7.8，培养至pH值稳定及溶氧回升时，放罐收菌，得到高密度的副猪嗜血杆菌5型菌体；发酵培养条件中通气量5~20m3/h；
所述的二级种子培养基和发酵罐培养基成分均为：胰蛋白胨1～20 g/L、酵母粉5～50g/L、酵母浸膏1～10 g/L、氯化钠1~10 g/L、醋酸铵1~10 g/L、pH为7.4的1M磷酸缓冲液1%~30 % V/V及添加一定量的牛血清5%~30% V/V和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.01~0.1 mg/L。
2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法，其特征在于：发酵罐培养基装液量为250-350L。
3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法，其特征在于：发酵培养过程中搅拌转速与溶氧串联，当溶氧高于设定值时，搅拌转速自动调低，当溶氧低于设定值时，搅拌转速相应调高。
4.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法，其特征在于：二级种子培养基和发酵罐培养基的配制方法为：酵母粉、胰蛋白胨、酵母浸膏和氯化钠，121℃灭菌20min，待冷却至常温再加入同样经121℃灭菌20min处理的pH为7.4的1M磷酸钾缓冲液，并加入过滤除菌的牛血清、醋酸铵和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
5.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌5型500L发酵罐的高密度培养方法，其特征在于：上述在培养过程中pH控制手段为：在培养过程中在线流加氨水溶液控pH值在7.4~7.8。
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