CN106432458A - 快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法,黄颡鱼inad‑like基因,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明通过Inad‑like基因在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中的序列差异,我们筛选得到了一对可以将黄颡鱼、瓦式黄颡鱼以及其杂交种准确鉴定出来的标记,为黄颡鱼下一步的育种研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术,具体地指一种快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法。
背景技术
黄颡鱼在分类上隶属于鲶形目,鲿科,黄颡鱼属,该属中主要有黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼(江黄颡鱼)、岔尾黄颡鱼和光泽黄颡鱼等4种。黄颡鱼是我国淡水养殖中非常重要的一种经济鱼类,对生态环境适应性较强,广泛分布于我国淡水水体中,2014年养殖产量高达34万吨。因其具有肉质细嫩,营养丰富,含肉率高,除脊刺外没有肌间刺等优点,颇受广大消费者欢迎。
瓦氏黄颡鱼,是该属中个体最大、生长最快的种类,2龄鱼体重最高可达600g左右。瓦氏黄颡鱼的仔稚鱼和幼鱼的生长和成活率显著高于黄颡鱼(甘炼,2008),以黄颡鱼为母本,以瓦氏黄颡鱼为父本杂交获得的子一代杂交黄颡鱼,从形态特征上比较接近黄颡鱼,但其在受精率和生长速度上比普通黄颡鱼有明显的优势(王卫民,2002;王明宝,2012)。因此,杂交黄颡鱼作为近年来崭露头角的一种养殖新品种,市场前景非常看好,在黄颡鱼养殖中占有相当大的比例。但是杂交黄颡鱼后代一般是不可育的,不能用于后期的苗种制备。
目前,从形态学上很难区分杂交黄颡鱼和普通黄颡鱼的苗种和成鱼。
发明内容
本发明的目的是提供了一种快速鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物及其鉴定方法。该方法利用DNA标记进行种间鉴定成为可能。我们在黄颡鱼中克隆得到一个新基因Inad-like,并在瓦氏黄颡鱼中得到其基因组序列。通过Inad-like基因在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中的序列差异,我们筛选得到了一对可以将黄颡鱼、瓦式黄颡鱼以及其杂交种准确鉴定出来的标记,为黄颡鱼下一步的育种研究奠定了基础。
为实现上述目的,本发明提供的一种黄颡鱼inad-like蛋白的氨基酸序列为:
(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;或
(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在90-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
编码上述蛋白的黄颡鱼inad-like基因,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物对,其引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示所示。
利用上述引物对鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的方法,包括以下步骤:
1)提取黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA
选取1龄的黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种鱼各10条,剪取尾鳍,保存在100%的酒精中,使用醋酸铵提取法提取基因组DNA。
2)分子标记的选择
通过对黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼Inad-like基因序列进行比对分析,并设计上述引物对,并以黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA为模板分别进行PCR扩增;得到三个不同PCR产物;
3)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种鱼的鉴定
以上述三个不同PCR产物PCR扩增的凝胶电泳结果来判断其种类,只扩增出一条1908bp条带的为黄颡鱼;只扩增出一条1178bp条带的为瓦氏黄颡鱼;同时扩增出1178bp、1908bp两条条带的为瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼杂交种黄颡鱼。
本发明的有益效果在于:
1)本发明首次在黄颡鱼中克隆一个新的基因,命名为inad-like。
2)本发明首次在黄颡鱼属,开发可以鉴定区分黄颡鱼、瓦式黄颡鱼以及杂交种的DNA分子标记。
3)本发明可以应用到实践中,区分市场上的三种类型的黄颡鱼,规范黄颡鱼市场,为黄颡鱼分子育种提供优良基础。
附图说明
图1为DNAMAN对两种鱼该基因的序列进行比对图;
图2为PCR扩增产物的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明,以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容,但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的方法
1)取黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼各10尾,取样于武汉市江夏区上涉湖养殖基地。
2)黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA提取
取0.2g鳍条组织到1.5ml离心管中,加入600μl细胞裂解液(Tris-HCl 100mM,pH8.0;EDTA 50mm/L,pH 8.0;SDS 1%,pH 8.0;NaCl 125mM)和15μl蛋白酶K(10mg/ml),将鳍条于离心管中剪碎,放置离心管于水浴锅中62℃水浴2-4h,每隔半小时轻摇离心管,直至充***解。取出离心管冷却至室温后,加入200μl 7.5M醋酸铵,上下摇匀,冰上放置5min,之后1,2000rpm 4℃离心10min,取上清液于新管中,1,2000rpm 4℃离心10min,取上清液500μl于新管中。加入600μl异丙醇,轻摇,析出沉淀,室温下静置1-2min,1,2000rpm 4℃离心5min,弃上清液。加入1ml 70%乙醇,轻摇混匀,1,2000rpm4℃离心10min,弃上清液,加入1ml无水乙醇,轻摇混匀,1,2000rpm4℃离心5min,弃上清液。
室温下干燥10-20min,加入100μl ddH2O,静置20-30min完全溶解,用NanoDropND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量,将各DNA样品稀释至100ng/μL。
3)inad-like基因的克隆
采用特异引物设计合成和染色体步移技术,得到黄颡鱼inad-like基因的全长。
4)序列比对分析
根据黄颡鱼Inad-like基因的外显子序列设计引物进行PCR扩增,并进行切胶回收以及TA克隆,经测序得到瓦氏黄颡鱼该基因序列,用DNAMAN对两种鱼该基因的序列进行比对,可发现在第六段及第七段外显子之间序列黄颡鱼较瓦氏黄颡鱼多出730bp(图1)。
5)分子标记的开发
根据上述片段大小差异,设计一对引物(表1),
上游引物位于第6段外显子序列,下游引物位于第7段外显子序列,使用该对引物分别在三种黄颡鱼基因组DNA上进行PCR扩增。PCR反应体系为10μl:5.0μl MasterMix,上下游引物各0.5μl(10μm/L),0.5μl DNA模版,加ddH2O至10μl。PCR程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,63℃退火30s,72℃延伸1min50s,反应进行34个循环;最后再延伸7min。
表1.用于鉴定黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的引物序列信息
其中:F:上游引物R:下游引物
6)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种鱼的鉴定结果
PCR扩增产物的凝胶电泳结果见图2,第一组为黄颡鱼,扩增条带大小为1908bp;第二组为瓦氏黄颡鱼,扩增条带大小为1178bp;第三组为黄颡鱼于瓦氏黄颡鱼杂交种黄颡鱼,扩增出两条条带,条带大小分别为1908bp、1178bp。鉴定成功率为100%,可以准确鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.一种黄颡鱼inad-like蛋白的氨基酸序列的特征为:
(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;或
(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在90-100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。
(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸且具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
2.编码权利要求1所述蛋白的黄颡鱼inad-like基因,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的引物对,其引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示所示。
4.利用权利要求3所述引物对鉴定黄颡鱼、瓦式黄颡鱼和杂交黄颡鱼的方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)提取黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA
2)分子标记的选择
通过对黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼Inad-like基因序列进行比对分析,并设计上述引物对,并以黄颡鱼、瓦式黄颡鱼及其杂交种黄颡鱼基因组DNA为模板分别进行PCR扩增;得到三个不同PCR产物;
3)黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种鱼的鉴定
以上述三个不同PCR产物PCR扩增的凝胶电泳结果来判断其种类,只扩增出一条1908bp条带的为黄颡鱼;只扩增出一条1178bp条带的为瓦氏黄颡鱼;同时扩增出1178bp、1908bp两条条带的为瓦氏黄颡鱼与黄颡鱼杂交种黄颡鱼。
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