CN106424127B - 邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法 - Google Patents

邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，具体为以下三种方式中的任一种：(1)在污染土壤中种植绿豆；(2)在污染土壤中施加绿木霉F7；(3)在污染土壤中种植绿豆，并联合施加绿木霉F7；所述绿木霉F7的分类命名为Trichoderma virens，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.17613。绿木霉F7对PAEs有良好的利用能力，绿豆能够有效去除土壤中PAEs，绿豆根系与根际微生物绿木霉F7联合，可进一步促进邻苯二甲酸酯降解，提高了邻苯二甲酸酯污染土壤的修复效率。

Description

邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法
技术领域
本发明属于生态环保领域，具体涉及一种邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法。
背景技术
邻苯二甲酸酯(Phthalate esters,PAEs)是邻苯二甲酸的酯化衍生物，是最常见的塑化剂，主要应用于聚乙烯树脂的合成、粘胶剂和塑料薄膜等的生产，所述的PAEs包括3种代表性的邻苯二甲酸酯类(即邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。近年来，由于PAEs的大量使用，这类化合物广泛存在于大气、水体和土壤等环境中，并通过食物链对人体健康造成影响。PAEs及其降解中间产物因被怀疑会引发癌症并损害肾脏，而被美国环境保护局(EPA)列为重要污染物。作为环境***，PAEs能够扰乱内分泌***的正常功能、干扰人体和其他动物的生长发育、导致出生缺陷和生殖能力下降等危害。因此，如何有效控制和消除环境内PAEs引发的污染已成为当务之急。
邻苯二甲酸酯类物质降解方法主要有光催化氧化处理、生物降解、微波辐照处理、活性炭降解、臭氧氧化等方式，其中生物降解的作用占重要地位。生物修复包括植物修复和微生物修复。植物修复是利用植物及其根际微生物的共存体系来吸收、转移、容纳或转化污染物使其对环境无害。作为一种原位绿色修复技术，植物修复在PAEs污染土壤的修复中具有极大的优势。但是随着残留时间的延长，土壤中的PAEs逐渐被土壤空隙吸附，使其生物有效性偏低，从而会导致植物对PAEs的降解和富集效率低。根际微生物对土壤中PAEs的降解有重要作用，同时植物根系分泌物能明显强化微生物的降解功能。因而，植物与微生物的协同修复技术是土壤有机污染生物修复领域的一个发展方向。
由于植物根系发达，其在生长过程中对PAEs具有较强的吸收、挥发、根滤、降解、稳定作用，可以净化土壤中的PAEs等污染物。为进一步提高植物对土壤中PAEs的修复效率，可采用生物修复技术中的植物修复和微生物强化技术相结合的方法。截至目前，利用微生物-植物联合降解PAEs的报道较少。
发明内容
针对生产实践中的实际问题和需求，本发明提出降解土壤中PAEs的方法，以实现对邻苯二甲酸酯污染土壤高效、快速地修复。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，具体为以下三种方式中的任一种：(1)在污染土壤中种植绿豆；(2)在污染土壤中施加绿木霉F7；(3)在污染土壤中种植绿豆，并联合施加绿木霉F7；所述绿木霉F7的分类命名为Trichoderma virens，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.17613。
进一步地，保持污染土壤中含水量为最大田间持水量的60-80％，以便有利于植物生长。
进一步地，绿豆种植及绿木霉F7联合施加的方式为以下三者之一：(1)先在污染土壤中种植绿豆再施加绿木霉F7；(2)先施加绿木霉F7再种植绿豆；(3)用绿木霉F7菌液浸泡绿豆种子再播种。
进一步地，所述种植的绿豆可以是直接将绿豆种子播种到污染土壤中，也可以将绿豆植株移栽至污染土壤中。
更进一步地，所述种植的绿豆优选直接将绿豆种子播种到污染土壤中，直接在原土壤中播种生长，避免移栽损伤根茎，无需缓苗过程，更利于绿豆的扎根生长，因此降解PAEs的速度更快。
更进一步地，所述绿豆的种植密度为20-30株/m2土地，密度过低根系无法全面覆盖污染土壤造成降解率低，密度过高绿豆的营养光照等条件跟不上、生长弱，也会降低对PAEs的降解率。
进一步地，所述绿木霉F7的施加量为1×1010-9×1012个孢子数/m2土地，如果施加量过低，绿木霉F7无法在短期内有效扩增影响对PAEs的降解，施加量也不宜过高以有效控制成本。
进一步地，所述绿木霉F7的施加形式为发酵液或固体制剂。
进一步地，发酵液的制备方式为：将活化的绿木霉F7菌块接种到含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上，28±2℃黑暗条件下培养4-6d后，用无菌水冲洗下分生孢子，将孢子液稀释到1×105-9×105个孢子/mL作为发酵接种的种子液；取种子液按照1％的接种量接种于PDA液体培养基中，28±2℃，150-200r/min的恒温震荡培养4-6d，即得到绿木霉F7发酵液。
进一步地，发酵液的施加方式为将绿木霉F7发酵液直接施加在绿豆根部。
进一步地，发酵液在绿豆出苗后10d、20d和30d，分三次向植物根际部位接种，以加强接种效果。
进一步地，固体制剂的制备方式为将绿木霉F7种子液(1×105-9×105个孢子/mL)，加入到麦麸培养基中，28±2℃培养3-5d至长出白色菌丝时，无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀，使绿木霉F7布满整个培养基；隔1.5-3d后再次用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀，直至整个麦麸培养基都长满绿色的绿木霉F7孢子，混匀计数孢子量为1×109-9×109个孢子/g，得到绿木霉F7固体制剂。固体制剂的施加方式为按土壤重量的4-6％将固体制剂拌入土壤中。
本发明修复邻苯二甲酸酯污染土壤的方法与现有技术相比有如下优点：
(1)实验发现绿木霉F7能够利用邻苯二甲酸二甲酯(DMP)作为唯一碳源和能源生长繁殖，在纯培养条件下，该菌5天就能将无机盐培养基中300mg/L的DMP降解75.1％。该菌同时对邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)等均具有良好的利用能力；
(2)绿豆适应性强，生长快，根系发达，生物量较大，能够有效去除土壤中邻苯二甲酸酯；
(3)绿豆根系与根际微生物绿木霉F7联合，可进一步促进邻苯二甲酸酯降解，使土壤中邻苯二甲酸酯降解去除率最高达85％，实现高效去除邻苯二甲酸酯。绿木霉F7联合绿豆处理污染土壤，提高了邻苯二甲酸酯污染土壤的修复效率，绿木霉F7与绿豆之间存在协同促进修复效果的现象；
(4)本发明方法在土壤中邻苯二甲酸酯浓度高达256mg/kg条件下仍可实现85％去除率，因此适用于大范围邻苯二甲酸酯中、低浓度污染土壤的修复。
附图说明
图1实施例1接种2.5％的绿木霉F7对不同浓度DMP、DBP、DEHP的降解率；
图2实施例1接种10％的绿木霉F7对不同浓度DMP、DBP、DEHP的降解率；
图3实施例2不同试验处理条件下DMP、DBP、DEHP的降解率；
图4实施例3不同试验处理条件下DMP、DBP、DEHP的降解率。
生物材料样品保藏信息：
绿木霉(Trichoderma virens)F7，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年6月29日，保藏编号为CGMCC No.3.17613。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1：绿木霉F7对邻苯二甲酸酯的降解
接种环挑取纯化培养的绿木霉F7，接入5g/L的葡萄糖溶液，于28℃，180r/min的恒温震荡培养箱中震荡培养36h，诱导孢子萌发和菌丝生长。分光光度计测定菌液在660nm处的OD值，适当稀释使其浓度一致(OD660≈0.8)，得到菌液。
配制基础盐培养基：MgSO4·7H2O 0.5g、KCl 0.5g、K2HPO4 1.31g、NaNO3 3.0g、FeSO4·7H2O0.018g、补足蒸馏水至1000mL；pH 7.0，121℃，0.1MPa灭菌20min。向灭菌后的基础盐培养基中添加PAEs，得到PAEs培养基。设置4组不同的浓度梯度，3种PAEs浓度分别为0、25、50和100mg/L，PAEs总浓度分别为0、75、150和300mg/L。
设置2种接种量，分别以2.5％和10％(菌液与PAEs培养基的体积比)的接种量将菌液接入到上述PAEs培养基中，以不接种绿木霉F7的PAEs无机盐培养基作为非生物降解对照，28℃、180r/min培养5d。每组设三个重复。所有操作均在无菌条件下进行。5d后取样分析培养液中PAEs含量，实验结果见图1-2。
结果显示，在不同浓度PAEs条件下，接种2.5％和10％的绿木霉F7对3种PAEs的降解率大小顺序均为DMP＞DBP＞DEHP；在纯培养5d内，接种2.5％的绿木霉F7处理下，DMP、DBP和DEHP三种PAEs的混合体系总降解率为53.5％～58.1％，其中DMP的降解率为64.1％～67.9％，DBP的降解率为51.2％～59.1％，DEHP的降解率为48.3％～50.8％。接种10％的绿木霉F7处理下，DMP、DBP和DEHP三种PAEs的混合体系总降解率为60.0％～64.5％，其中DMP的降解率为71.3％～75.1％，DBP的降解率为57.6％～64.9％，DEHP的降解率为51.1％～63.6％。而未接菌的对照组DMP、DBP和DEHP三种PAEs的降解率仅为2.1％～4.4％。上述结果表明绿木霉F7对三种邻苯二甲酸酯混合物具有较好的降解能力。
实施例2：绿木霉F7发酵液联合绿豆修复邻苯二甲酸酯污染土壤
试验土壤取自山东青岛胶州市胶西镇农田耕作层，土壤pH 6.58(土水比1：2.5)，有机质23.1g/kg，阳离子交换量13.2cmol/kg，全氮含量为1.25g/kg，速效磷和钾含量分别为36.4mg/kg、197mg/kg。取得土壤经风干、碾碎后过2mm(10目)筛。
上述土壤经进一步碾碎过0.3mm筛。取少量经过0.3mm筛的土壤，加入5g/L PAEs储备液，使3种PAEs浓度均为1000mg/kg(总浓度为3000mg/kg)，待溶剂挥发后与未污染土混合，制成3种PAEs浓度均为50mg/kg(总浓度为150mg/kg)的人工污染土壤。
供试绿豆(Phaseolus radiatus L.)种子购自山东农业科学研究院。
供试菌种为绿木霉(Trichoderma virens)菌株F7(保藏编号：CGMCCNo.3.17613)。
试验设置四个处理，处理一：CK，自然降解对照；处理二：接种绿木霉F7发酵液；处理三：种植绿豆；处理四，种植绿豆+接种绿木霉F7发酵液。每处理做四次重复。将实验土壤装入陶瓷盆中，每盆4kg土。在接种菌液和种植绿豆前采集土壤样品，测定PAEs含量，见表1。
绿木霉F7发酵液的制备：将活化的绿木霉F7菌块接种到含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面的克氏瓶中，28℃黑暗条件下恒温培养5d后，用无菌水冲洗下分生孢子，将孢子液稀释到5×105个孢子/mL，作为发酵接种的种子液。取5mL孢子悬浮液接种于500mL的PDA液体培养基中，28℃，180r/min的恒温震荡培养箱中培养5d，即为绿木霉F7发酵液。
选取饱满的绿豆种子，用1％次氯酸钠溶液浸泡种子10min，取出用去离子水清洗种子5次后，栽入育苗基质中进行育苗，出苗1周后移入装有污染土壤的陶瓷盆(盆内径为36cm)中，每盆5株，待苗移栽成活后进行一次间苗，每盆保留3株，相当于29.5株/m2土地。
在绿豆出苗后10d，在植株根际施加100ml绿木霉F7发酵液。在修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的65％左右。在培养20d和30d时，分别向植物根际追加一次绿木霉F7发酵液，用量均为100ml，也即干土重的2.5％(体积质量比)，相当于9.83×1010(单次)/2.95×1011(三次)孢子数/m2土地。
试验共进行75d，常规田间管理。收获时，采集土壤样品，测定试验终止时土壤的PAEs。结果见表1和图3。
从试验结果看，3种PAEs发生了自然降解作用，DMP、DBP和DEHP的降解率分别为64.2％，45.8％和41.7％，总PAEs降解率为50.8％。接种绿木霉F7和种植绿豆后PAEs的降解均有所提高，其中接种绿木霉F7处理下DMP、DBP和DEHP的降解率分别为69.7％，63.3％和58.2％，总PAEs降解率为64.0％；种植绿豆DMP、DBP和DEHP的降解率分别为74.8％，68.5％和64.7％，总PAEs降解率为69.5％。绿木霉F7联合绿豆显著提高了PAEs的降解，DMP、DBP和DEHP的降解率分别为88.3％，83.9％和82.0％，总PAEs降解率为84.9％。
本实例说明，绿木霉F7有效提高了土壤介质中的DBP、BMP和DEHP的生物修复效率，绿木霉F7联合绿豆处理污染土壤，提高了邻苯二甲酸酯污染土壤的降解速率，绿木霉F7与绿豆之间存在协同促进修复效果的现象。
表1实施例2不同试验处理条件下PAEs的降解率(mg/kg DW)
实施例3绿木霉F7固体制剂联合绿豆修复邻苯二甲酸酯污染土壤
所用土壤来源、性质和基本类型、添加PAEs污染物的方式、绿豆种子同实施例2。实验所用人工污染土壤3种PAEs浓度均为100mg/kg(总浓度为300mg/kg)。
绿木霉F7固体制剂的制备：将活化的绿木霉F7菌块接种到含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面的克氏瓶中，28℃黑暗条件下恒温培养5d后，用无菌水冲洗下分生孢子，将孢子液稀释到1×105个孢子/mL，作为发酵接种的种子液。以麦麸为绿木霉F7繁殖的载体即培养基，将麦麸洗净烘干粉碎后，调节其含水量为50wt％，分装至培养皿中，121℃灭菌30min。无菌条件下，吸取木霉孢子种子液加入到麦麸培养基中，28℃培养4d。待长出少量白色菌丝时，无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀，使绿木霉F7布满整个培养基。隔2d后重复上述操作，直至整个麦麸培养基都长满绿色的绿木霉F7孢子，混匀计数孢子量为4.5×109个孢子/g，得到绿木霉F7固体制剂。
试验设置四个处理，处理一：CK，自然降解对照；处理二：施加绿木霉F7固体制剂；处理三：种植绿豆；处理四，种植绿豆+施加绿木霉F7固体制剂。每处理做四次重复。每盆装5.0kg土，对于处理二和处理四按土壤重量的5％将固体制剂(0.25kg)拌入土壤中，相当于8.96×1012个孢子数/m2土地，表层覆土平衡7d后播种。
选取饱满的绿豆种子，用1％次氯酸钠溶液浸泡种子10min，取出用去离子水清洗种子7次后，在盆里的污染土壤中事先挖好深度一致的穴，均匀播种6颗种子。然后将土覆盖在种子上，喷洒去离子水。待绿豆长出2片真叶时，间苗。保证每盆3棵绿豆，盆内径为40cm，相当于23.9株/m2土地。在修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的75％左右。
试验共进行75d，常规田间管理。收获时，采集土壤样品，测定试验终止时土壤的PAEs。结果见表2和图4。
从试验结果看，3种PAEs发生了自然降解作用，DMP、DBP和DEHP的降解率分别为64.4％，48.8％和45.1％，总PAEs降解率为52.3％。施加绿木霉F7固体制剂和种植绿豆后PAEs的降解均有所提高，其中施加绿木霉F7固体制剂处理下DMP、DBP和DEHP的降解率分别为69.8％，63.9％和60.6％，总PAEs降解率为64.6％，种植绿豆DMP、DBP和DEHP的降解率分别为74.6％，68.9％和66.7％，总PAEs降解率为69.9％。绿木霉F7固体制剂联合绿豆显著提高了PAEs的降解，DMP、DBP和DEHP的降解率分别为85.0％，84.2％和83.1％，总PAEs降解率为85.1％。
本实例说明，绿木霉F7有效提高了土壤介质中的DBP、BMP和DEHP的生物修复效率，绿木霉F7固体制剂联合绿豆处理污染土壤，提高了邻苯二甲酸酯污染土壤的降解速率，绿木霉F7与绿豆之间存在协同促进修复效果的现象。
表2实施例3不同试验处理条件下PAEs的降解率(mg/kg DW)

Claims (7)

1.一种邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，具体为以下方式中的任一种：
(1)在污染土壤中施加绿木霉F7；(2)在污染土壤中种植绿豆，并联合施加绿木霉F7；所述绿木霉F7的分类命名为Trichoderma virens，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3.17613；
所述绿木霉F7的施加形式为发酵液或固体制剂；
所述发酵液的制备方式为：将活化的绿木霉F7菌块接种到PDA培养基斜面上，28±2℃黑暗条件下培养4-6d后，用无菌水冲洗下分生孢子，将孢子液稀释到1×105-9×105个孢子/mL作为发酵接种的种子液；取种子液按照1％的接种量接种于PDA液体培养基中，28±2℃，150-200r/min恒温震荡培养4-6d，即得到绿木霉F7发酵液；
所述固体制剂的制备方式为将1×105-9×105个孢子/mL的绿木霉F7种子液，加入到麦麸培养基中，28±2℃培养3-5d至长出白色菌丝时，无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀，使绿木霉F7布满整个培养基；隔1.5-3d后再次用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀，直至整个麦麸培养基都长满绿色的绿木霉F7孢子，混匀计数孢子量为1×109-9×109个孢子/g，得到绿木霉F7固体制剂。
2.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，方式(2)所述绿豆的种植密度为20-30株/m2土地，所述绿木霉F7的施加量为1×1010-9×1012个孢子数/m2土地。
3.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，保持污染土壤中含水量为最大田间持水量的60-80％。
4.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，绿豆种植及绿木霉F7联合施加的方式为以下三者之一：(1)先在污染土壤中种植绿豆再施加绿木霉F7；(2)先施加绿木霉F7再种植绿豆；(3)用绿木霉F7菌液浸泡绿豆种子再播种。
5.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，所述方式(2)发酵液的施加方式为将绿木霉F7发酵液直接施加在绿豆根部。
6.根据权利要求5所述的邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，所述发酵液在绿豆出苗后10d、20d和30d，分三次向植物根际部位接种。
7.根据权利要求1所述的邻苯二甲酸酯污染土壤的修复方法，其特征在于，所述固体制剂的施加方式为按土壤重量的4-6％将固体制剂拌入土壤中。
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