CN106404865A - 一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微电极生物传感技术,具体公开了一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器。本发明通过在金(或铂)工作电极上修饰IAA的抗体实现对IAA的特异性识别,通过在电极上沉积金纳米粒子及修饰IAA‑金纳米粒子复合物实现IAA的高灵敏检测。本发明通过对活体植物体内IAA的在线连续检测,原位实时的掌握植物体内生长素的动态变化信息,了解IAA的代谢过程,为了解IAA参与植物生命体系的调控机理提供理论依据。应用微型生物传感器实现对植物活体内IAA的在线连续检测,对被检测样本不造成本质伤害;得到的数据结果可实时动态的反映植物体内IAA的含量变化,实际应用操作简便,易于掌握。
Description
技术领域
本发明涉及微电极生物传感技术,具体地说,涉及一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器。
背景技术
作为植物体内的一种小分子有机物,生长素(IAA)主要参与植物的生长及发育过程。生长素对植物胚芽鞘尖端、幼嫩的芽、叶等的诱导通常具有正负两重性,主要取决于其浓度和植物的生理状况。通常情况下,过多的生长素会促进植物体内乙烯的产生,打乱植物内部的生理平衡,从而抑制植物的生长。另一方面,植物果实的发育离不开生长素。种子在发育过程中,产生的生长素能够改变其营养物质的分配,使子房发育为果实。
目前,常用的生长素检测方法主要有酶免疫(ELISA)检测法、放射免疫分析(RIA)法、高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法等。除此之外,近年来,光谱法、电化学法等也被应用于生长素的检测。但目前的检测方法都是破坏植物样本的离体检测,仅能反应某一时间点的静态浓度或累积效应。传统检测方法需对样品取样进行分离提纯等预处理,不仅操作繁琐、耗时成本高,对样本的破坏性较大,而且只能离体取样检测,无法体现样本内IAA含量的实时动态变化。
植物体内的生长素的含量极少且生长素周围共存基体成分非常复杂,其含量易受光照条件、水分以及温度等外界条件的影响,因此,随着研究的深入,研究者更希望获得植物适应外界环境时生长素的实时动态变化。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器及其应用。
为了实现本发明目的,本发明的技术方案如下:
第一方面,本发明提供了一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器,所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤:
S1、将金工作电极或铂工作电极浸入HAuCl4溶液中,在工作电极上经电化学沉积得到AuNPs修饰的工作电极;
S2、在S1所得的工作电极上滴涂巯基十一酸(MUA),使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上;
S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液,激活MUA的羧基;
S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物,得到IAA抗体修饰的工作电极;
S5、在S4所得的工作电极上滴涂K3Fe(CN)6媒介体。
为了更好地实现工作电极对IAA检测的灵敏度和特异性,本发明对工作电极的修饰条件进行进一步的优化,具体如下:
S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含0.5~1M KNO3的2-5mM HAuCl4溶液中,在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极;
S2、在S1所得的工作电极上滴涂1~5mM巯基十一酸(MUA),孵育1~2h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上;
S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有50mM N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(200mM)的混合溶液,孵育1-2h后,激活MUA的羧基;
所述N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液中N羟基琥珀酸亚胺与1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度比为1:1~1:4;
S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物,孵育1~4h得到IAA抗体修饰的工作电极;
S5、在S4所得的工作电极上滴涂5~10mM K3Fe(CN)6媒介体。
作为优选,所述工作电极最佳的制备方法包括:
S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含1M KNO3的3mM HAuCl4溶液中,在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极;
S2、在S1所得的工作电极上滴涂2mM巯基十一酸(MUA),孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上;
S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液,孵育1-2h后,激活MUA的羧基;
所述混合溶液中,N羟基琥珀酸亚胺的浓度为50mM,1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为200mM;
S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物,孵育1h得到IAA抗体修饰的工作电极;
S5、在S4所得的工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
本发明首先在金工作电极上沉积了金纳米粒子,研究发现,电极上沉积金纳米粒子后,可以显著增加电极的表面积,从而大大提高检测的灵敏度。其次,本发明对HAuCl4溶液的浓度进行了优化,发现HAuCl4浓度在2~5mM时效果较好,其中3mM的效果最好。在此基础上,本发明对电化学沉积的条件进行了优化,在-0.4V电化学沉积200s能够使AuNPs沉积的更加均匀,从而提高检测的灵敏度。而后,本发明在金纳米粒子修饰的工作电极上滴涂了巯基十一酸(MUA)以提供羧基,并对其浓度进行了优化,发现1-5mM的MUA效果较好,浓度太低不足以覆盖电极表面,太高则影响电极的导电性,进而降低检测性能,其中2mM的效果最好。进一步在电极上滴涂NHS和EDC的混合溶液,以激活羧基。NHS和EDC的浓度比为1:1-1:4,其中1:4效果最好。然后将AuNPs-抗IAA复合物滴涂到工作电极上,孵育1-4h得到IAA抗体修饰的工作电极。利用IAA的抗体实现对IAA的特异性检测,而AuNPs-抗IAA复合物则可进一步增强检测信号,从而提高检测的灵敏度。
进一步地,S4中所述AuNPs-抗IAA复合物的制备方法为:通过柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子,将金纳米粒子溶液的pH调节至7.6,在400μL金纳米粒子溶液中加入100μL抗IAA的抗体(1mg/ml),震荡5min后,于4℃孵育12h;然后将混合物在4℃、12000rpm离心30min,以除去未连接的抗体;之后将沉淀分散于1ml含1%BSA、pH7.4的PBS缓冲液中,形成AuNPs-抗IAA复合物。
进一步地,所述微电极生物传感器还包括Ag/AgCl参比电极和铂对电极。
进一步地,为了使所述微电极生物传感器适用于植物活体的在线检测,避免离体检测对样品的破坏和取样过程中样品的变化和损失,本发明采用针式微电极,微电极通过涂膜、蚀刻技术等微机电加工(MEMS)技术制作,在硅片基质上制备上述工作电极、Ag/AgCl参比电极和铂对电极,其外观具有穿透植物组织的能力,长度约为30~50mm。
第二方面,本发明提供了所述微电极生物传感器在活体在线检测植物生长素方面的应用。
所述植物包括林木、花卉、蔬菜、农作物等,所述植物组织为植物的茎、叶、果实。
进一步地,本发明提供一种活体在线检测植物生长素的方法,所述方法包括:
1)将所述微电极生物传感器连接至电化学工作站,与IAA的标准溶液反应,通过电化学循环伏安法确定反应电压为0.2V;然后将微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在0.2V工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,制备标准曲线;
2)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在0.2V工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤1)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的实时IAA浓度。
在本发明的一个具体实施方式中,选择黄豆幼苗的茎秆为材料,活体检测IAA含量。将微电极生物传感器***黄豆幼苗的茎秆部位进行活体检测,并与电化学工作站相连获取由IAA与电极反应引起的电流变化,利用该电流的变化计算出活体样本汁液中IAA的含量。
本发明的有益效果在于:
本发明通过在工作电极上修饰IAA的抗体实现对IAA的特异性识别,通过在电极上沉积金纳米粒子及修饰IAA-金纳米粒子复合物实现IAA的高灵敏检测。
本发明提供了一种基于微型生物传感技术的植物体内生长素的活体在线连续检测方法,从而更准确、实时地了解植物体内生长素的动态变化规律及作用机制。
本发明通过对活体植物体内IAA的在线检测,原位实时的掌握植物体内生长素的动态变化信息,了解IAA的代谢过程,为了解IAA参与植物生命体系的调控机理提供理论依据。应用微型生物传感器实现对植物活体内IAA的在线检测,对被检测样本不造成本质伤害;得到的数据结果可实时动态的反映植物体内IAA的含量变化,实际应用操作简便,易于掌握。
附图说明
图1为本发明所述工作电极的制备与检测的简易示意图。
图2为本发明所述微电极生物传感器检测植物组织的示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1工作电极的制备
1)金纳米粒子通过柠檬酸钠还原法制备。将金纳米粒子溶液的pH值调节至pH7.6,在400μL金纳米粒子溶液中加入100抗IAA的抗体(1mg/ml),震荡5min后,于4℃孵育12h。然后将混合物在4℃、12000rpm离心30min,以除去未连接的抗体。之后将沉淀分散于1ml含1%BSA、pH7.4的PBS缓冲液中,形成AuNPs-抗IAA复合物。
2)微电极清洁处理后,浸入含1M KNO3的3mM HAuCl4溶液中,在金工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的微电极。在修饰后的工作电极上滴涂2mM巯基十一酸(MUA),孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到修饰后的金电极上。
3)在工作电极上滴涂50mM N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液,孵育1h后,激活MUA上的羧基后将AuNPs-抗IAA复合物滴加至修饰的金电极表面,孵育1h得到IAA抗体修饰的微电极,进一步在工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
实施例2微电极生物传感器的应用
1)将制备好的微电极连接至电化学工作站,与IAA的标准溶液反应,通过电化学循环伏安法确定反应电压为0.2V。微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在0.2V工作电压下通过计时电流法进行连续检测。将峰电流值与IAA的浓度值作图,制备标准曲线。
2)选用培养至第7天黄豆幼苗做实验材料,将微电极***豆苗的嫩茎连接至电化学工作站,在线连续测定4天内IAA的浓度变化。
3)分别取培养至第7、8、9、10天的黄豆幼苗嫩茎,用传统的液相色谱-质谱连用方法对选取的样本进行IAA的检测。将液相色谱-质谱连用(HPLC-MS)得到的结果与同一时期微电极在线检测的结果进行对比。
每组实验重复三次计算其平均值,得到结果如表1:
表1不同时期黄豆幼苗茎部IAA含量检测结果
样本 | 微电极(ng·g-1FW) | HPLC-MS(ng·g-1FW) |
7thD | 16.2(±0.24) | 15.7(±0.33) |
8thD | 18.6(±0.17) | 18.3(±0.42) |
9thD | 19.3(±0.12) | 19.5(±0.39) |
10thD | 20.0(±0.04) | 19.8(±0.24) |
由上表看出,利用微电极在线检测黄豆幼苗茎部IAA含量与传统HPLC-MS方法测量结果数据基本吻合。该方法数据可靠、选择性高,可实现对IAA高度灵敏、专一的识别,适用于植物的茎、叶、果实等不同组织部位,可实现植物体内IAA的活体在线连续检测,有助于了解IAA参与植物生命活动的调控规律及作用机制。
实施例3
1)金工作电极清洁处理后,浸入含0.5M KNO3的1mM HAuCl4溶液中,在金工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的微电极。在其上滴涂巯基十一酸(MUA),孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au-S键组装到修饰后的金电极上。
2)在工作电极上滴涂50mM N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液,孵育1h后,将AuNPs-抗IAA复合物滴加至修饰的金电极表面,孵育1h得到IAA抗体修饰的微电极,进一步在工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
3)将该修饰的微电极连接至电化学工作站,然后将微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,所制备的标准曲线与最优条件下制备的含有电沉积金纳米粒子步骤的工作电极相比,斜率稍偏小,表明传感器的灵敏度降低。
4)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤3)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的即时IAA浓度。其检测值全部偏小,并与HPLC-MS法检测到的数值偏差较大。
实施例4
1)微电极清洁处理后,浸入含1M KNO3的3mM HAuCl4溶液中,在金工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的微电极。在修饰后的工作电极上滴涂2mM巯基十一酸(MUA),孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到修饰后的金电极上。
2)在工作电极上滴涂50mM N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和500mM1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液(将NHS和EDC的摩尔浓度比调整为1:10),孵育1h后,激活MUA上的羧基后将AuNPs-抗IAA复合物滴加至修饰的金电极表面,孵育1h得到IAA抗体修饰的微电极,进一步在工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
3)将该修饰的微电极连接至电化学工作站,与IAA的标准溶液反应,通过电化学循环伏安法确定反应电压。然后将微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,所制备的标准曲线与本发明中制备的NHS和EDC的摩尔浓度比在1:1-1:4范围内的工作电极相比,斜率较小,表明传感器的灵敏度较低。
4)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤3)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的即时IAA浓度。其检测值全部偏小,并与HPLC-MS法检测到的数值偏差较大。
对比例1
1)金工作电极清洁处理后,在其上滴涂巯基十一酸(MUA),(不进行电沉积金纳米粒子),孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到修饰后的金电极上。
2)在工作电极上滴涂50mM N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液,孵育1h后,将AuNPs-抗IAA复合物滴加至修饰的金电极表面,孵育1h得到IAA抗体修饰的微电极,进一步在工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
3)将该修饰的微电极连接至电化学工作站,与IAA的标准溶液反应,通过电化学循环伏安法确定反应电压。然后将微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,所制备的标准曲线与我们制备的含有电沉积金纳米粒子步骤的工作电极相比,斜率较小,表明传感器的灵敏度较低。
4)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤3)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的即时IAA浓度。其检测值全部偏小,并与HPLC-MS法检测到的数值偏差较大。
对比例2
1)金工作电极清洁处理后,在其上滴涂巯基十一酸(MUA),(不进行电沉积金纳米粒子),孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到修饰后的金电极上。
2)在工作电极上滴涂50mM N羟基琥珀酸亚胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合溶液,孵育1h后,将IAA抗体滴加至修饰的金电极表面(不滴涂金纳米粒子-抗IAA复合物),孵育1h得到IAA抗体修饰的微电极,进一步在工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
3)将该修饰的微电极连接至电化学工作站,与IAA的标准溶液反应,通过电化学循环伏安法确定反应电压。然后将微电极与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,所制备的标准曲线与我们制备的含有电沉积金纳米粒子步骤的工作电极相比,斜率较小,表明传感器的灵敏度较低。
4)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤3)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的即时IAA浓度。结果只能检测培养至第10天的黄豆幼苗的IAA,其它几天的IAA含量检测不到,数值偏小,并与HPLC-MS法检测到的数值偏差较大。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种活体在线检测植物生长素的微电极生物传感器,其特征在于,所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤:
S1、将金工作电极或铂工作电极浸入HAuCl4溶液中,经电化学沉积得到AuNPs修饰的工作电极;
S2、在S1所得的工作电极上滴涂MUA,使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上;
S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液,激活MUA的羧基;
S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物,得到IAA抗体修饰的工作电极;
S5、在S4所得的工作电极上滴涂K3Fe(CN)6媒介体。
2.根据权利要求1所述的微电极生物传感器,其特征在于,所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤:
S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含0.5~1M KNO3的2-5mM HAuCl4溶液中,在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极;
S2、在S1所得的工作电极上滴涂1~5mM MUA,孵育1~2h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上;
S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液,孵育1-2h后,激活MUA的羧基;
所述N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液中N羟基琥珀酸亚胺与1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔浓度比为1:1~1:4;
S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物,孵育1~4h得到IAA抗体修饰的工作电极;
S5、在S4所得的工作电极上滴涂5~10mM K3Fe(CN)6媒介体。
3.根据权利要求2所述的微电极生物传感器,其特征在于,所述微电极生物传感器中工作电极的制备方法包括如下步骤:
S1、将金工作电极或铂工作电极浸入含1M KNO3的3mM HAuCl4溶液中,在工作电极上-0.4V电化学沉积200s得到AuNPs修饰的工作电极;
S2、在S1所得的工作电极上滴涂2mM MUA,孵育1h后用水冲去多余未反应的MUA,使MUA通过Au–S键组装到S1所得的工作电极上;
S3、在S2所得的工作电极上滴涂含有N羟基琥珀酸亚胺和1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的混合溶液,孵育1-2h后,激活MUA的羧基;
所述混合溶液中,N羟基琥珀酸亚胺的浓度为50mM,1-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度为200mM;
S4、在S3所得的工作电极上滴涂AuNPs-抗IAA复合物,孵育1h得到IAA抗体修饰的工作电极;
S5、在S4所得的工作电极上滴涂5mM K3Fe(CN)6媒介体。
4.根据权利要求1~3任一项所述的微电极生物传感器,其特征在于,S4中所述AuNPs-抗IAA复合物的制备方法为:将金纳米粒子溶液的pH调节至7.6,加入抗IAA的抗体孵育,离心沉淀后分散于含1%BSA、pH7.4的PBS缓冲液中,形成AuNPs-抗IAA复合物。
5.根据权利要求4所述的微电极生物传感器,其特征在于,所述微电极生物传感器还包括Ag/AgCl参比电极和铂对电极。
6.权利要求1~5任一项所述的微电极生物传感器在活体在线检测植物生长素方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,具体为:
1)将权利要求1~5任一项所述的微电极生物传感器连接至电化学工作站,与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在0.2V工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,制备标准曲线;
2)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在0.2V工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤1)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的即时IAA浓度。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述植物组织为植物的茎、叶、果实。
9.一种活体在线检测植物生长素的方法,其特征在于,所述方法包括:
1)将权利要求1~5任一项所述的微电极生物传感器连接至电化学工作站,与不同浓度的IAA的标准溶液反应,在0.2V工作电压下通过计时电流法进行连续检测,将峰电流值与IAA的浓度值作图,制备标准曲线;
2)将微电极生物传感器***待测植物组织,连接电化学工作站,在0.2V工作电压下,通过计时电流法检测被测部位的电流I,通过与步骤1)所述的标准曲线的方程对比,计算得到待测组织的即时IAA浓度。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述植物组织为植物的茎、叶、果实。
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