CN106399494B - 活体内原位检测分析微生物相互作用的方法 - Google Patents

活体内原位检测分析微生物相互作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，包括将单菌种基质和培养基质组成的凝胶态的复合基体转移至多孔磁性容器空心内腔中，并以口服或投送的方式进入人体或动物活体开放器官中驻留一定时间后排出；通过磁力从排出的粪便或开放器官中取出多孔磁性容器，经冷藏后取出复合基体检测分析单一菌种的基因表达情况；让目标微生物在活体原位条件下完成相互作用，既能将置于同一环境的多种目标微生物在人和动物活体内区分开来，也不隔阻目标微生物在活体条件下产生的物质对环境中其他微生物的相互作用，能够真实捕捉目标微生物在不同自然条件下的状态和变化，在人和动物活体原位条件下完成特定种类微生物间相互作用的试验。

Description

活体内原位检测分析微生物相互作用的方法
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种活体内原位检测分析微生物相互作用的方法。
背景技术
微生物间的相互作用形式多种多样，目前对此研究大多数在实验室中进行，无法完全还原自然环境条件，也受人为因素影响。通常研究细菌间相互作用的方法有细菌共培养法和牛津杯法等。细菌共培养是指在无菌条件下，一些特别指定的不同的微生物在厌氧或好氧条件下的混合培养。但在研究细菌之间相互关系时，细菌混合共培养法能使不同种细菌充分接触却无法准确判断培养液中不同细菌的数目和抽提单一菌种基因组DAN或RNA，结果统计和准确分析单一菌种基因表达困难，尤其对同一属内相近物种，不便分析实验结果。牛津杯法是体外通过获取一种细菌活动产生的物质，通过牛津杯扩散后研究其对另一种细菌的抑制作用，不能原位分析活体体内微生物的相互作用。
因此，急需一种可以排除人为因素影响，能让目标微生物在活体内原位条件下完成相互作用的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种活活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，让目标微生物在活体原位条件下完成相互作用，既能将多种目标微生物区分开来，也不隔阻活体原位环境中的物质对特定种类微生物间在活体原位条件下相互作用，通过检测和分析其菌体数量和基因表达变化，探索微生物间相互关系，能够真实捕捉目标微生物在不同人和动物体内原位条件下的状态和变化，数据更精准，结果更精确，操作更简便，可以在人和动物活体原位条件下完成特定种类微生物间相互作用的试验，排除人为因素的干扰，使试验数据具有极大的可靠性与参考价值。
本发明的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，包括以下步骤：
a.将单菌种基质和培养基质组成的凝胶态的复合基体转移至多孔磁性容器空心内腔中，并以口服的方式进入人体或动物体消化道环境，驻留一定时间后排出；
b.通过磁力从排出的粪便中选取多孔磁性容器，经冷藏后取出复合基体检测分析菌种的基因表达情况；
进一步，将分别装有不同单菌种基质的多孔磁性容器同时经人体或动物体消化道环境；
进一步，所述多孔磁性容器表面以1～3×105个/cm2的方式分布有孔径为200～500nm的通孔；
进一步，所述多孔磁性容器材质为马氏体不锈钢，所述多孔磁性容器长10～250mm，直径为5～50mm；
进一步，所述多孔磁性容器由螺纹连接的上下两部分组成，在连接部外表面套设有密封环；
进一步，所述密封环材质为耐高温和耐腐蚀的食品级硅胶；
进一步，将单一微生物培养液，在无菌条件下与体内环境基质充分混匀形成凝胶态的复合基质体；
进一步，将复合基质体装入多孔不锈钢容器，并密封，并套上密封环，防止体内外其他非目标微生物的污染；
进一步，将装有目标微生物复合基质体的多孔不锈钢容器口服进入体内消化道，并驻留一段时间；
进一步，将排出的多孔磁性容器在-80℃或液氮中保藏；
进一步，在无菌条件下，对冷藏后的多孔磁性容器进行清洗和消毒后取出复合基体，对复合基体内微生物进行计数或抽提基因组DNA或RNA，进一步分析检测其基因表达；
进一步，采用冷冻无菌的pH＝8.0，浓度为0.1mol/L的磷酸盐清洗多孔磁性容器表面，用蘸有浓度为70～75％的酒精无菌吸水纸对多孔磁性容器表面消毒。
本发明的有益效果：本发明的活体原位检测分析微生物相互作用的方法，让目标微生物在活体原位条件下完成相互作用，既能将多种目标微生物在人和动物活体内区分开来，也不隔阻目标微生物在活体条件下产生的物质对环境中其他微生物的相互作用，通过检测和分析其具体数量和基因表达变化研究微生物间相互关系，能够真实捕捉目标微生物在不同自然条件下的状态和变化，数据更精准，结果更精确，操作更简便，可以在活体条件下完成特定种类微生物间相互作用的试验，排除人为因素的干扰，使试验数据具有极大的可靠性与参考价值。
附图说明
下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步描述：
图1为本实用新型的椭圆体盛菌器结构示意图；
图2为本实用新型的圆柱体盛菌器结构示意图；
图3为本实用新型的球体盛菌器结构示意图；
图4为本实用新型的子弹头体盛菌器结构示意图。
具体实施方式
本实施例的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，包括以下步骤：
a.将单菌种基质和培养基质组成的凝胶态的复合基体转移至多孔磁性容器1空心内腔中，并以口服或投送的方式进入人体或动物体消化道环境，驻留一定时间后排出或取出；
b.通过磁力从排出的粪便或开放器官中取出多孔磁性容器1，经冷藏后取出复合基体检测分析菌种的菌体数量和基因表达变化；多孔磁性容器1在使用前需灭菌处理，将多孔磁性容器1通过在人体和动物开放器官(肠道、口腔、***、尿道等)驻留一定时间后，分析多孔磁性容器1内菌体基质复合体内微生物数量或抽提基因组DNA或RNA，进行基因表达分析。也可将该多孔磁性容器1按合适的密度移入微生物生存的其他自然环境(淤泥、土壤等)、人工发酵***(酿酒、制曲、酿醋、青贮饲料等)中，在设定的时间，采用磁力从土壤、糟醅、粪便、淤泥等环境中选出，检测分析微生物相互作用关系。
本实施例中，将分别装有不同单菌种基质的多孔磁性容器1同时经人体或动物体开放器官环境；将不同的菌种基质与培养基质匀浆混合形成凝胶态后分别装入多孔磁性容器1中，然后再以口服或投送方式进入人体或动物体，在人体开放器官驻留一段时间后，经正常的消化通道后排出或人工取出以进行检测分析。
本实施例中，所述多孔磁性容器1表面以1～3×105个/cm2的方式分布有孔径为200～500nm的通孔2；通孔2的数量和孔的大小直接决定多孔磁性容器1的使用效果，孔太大或太密集都无法对目标微生物进行有效的隔离，孔太小或太稀疏，又影响容器内的微生物和所处环境状态的接触，使微生物不能完全置于该环境中，影响微生物的自然状态，该容器不隔阻自然环境中直径小于多孔磁性容器1孔径的物质对特定种类微生物间在自然条件下相互作用的影响，使微生物完全处于自然状态。
本实施例中，所述多孔磁性容器1材质为马氏体不锈钢，所述多孔磁性容器1长10～250mm，直径为5～50mm；多孔磁性容器1的材质、大小确保其能在人体内进行有效的活动和流通，同时不影响人体组织，耐酸碱，耐腐蚀甚至是耐高温，确保容器内的微生物处于自然状态，不影响微生物的活性。
本实施例中，所述多孔磁性容器1由螺纹连接的上下两部分组成或为不具螺纹的一端开口的盲管，在连接部外表面或盲管开口端设有密封环3，所述密封环3材质为耐高温和耐腐蚀的食品级硅胶。；多孔磁性容器1可以为椭球体、圆柱体、球体、子弹头体等结构，均由可内外螺纹扭合的两部分组成，密封环3长度为套直径为3mm～35mm的环状结构，宽3～20mm,材质为耐高温、耐腐蚀的食品级硅胶，可套在多孔磁性容器1螺纹扭合处形成密封，防止环境微生物加入多孔磁性容器1。
本实施例中，将单一微生物培养液，在无菌条件下与培养基质充分混匀形成凝胶态的复合基体；便于微生物在多孔磁性容器1内的储存，细菌产生的各种物质可以通过多孔磁性容器1在体系内进行扩散，实现了细菌间的直接接触。
本实施例中，将排出或取出的多孔磁性容器1在-80℃或液氮中保藏；使排出的复合基体不受外界环境的影响而导致复合机体的再次变化和作用，使结果也更加便于统计和分析。
本实施例中，采用冷冻无菌的pH＝8.0，浓度为0.1mol/L的磷酸盐清洗多孔磁性容器1表面，用蘸有浓度为70～75％的酒精无菌吸水纸对多孔磁性容器1表面消毒取出复合基体，对复合基体内微生物进行计数或抽提基因组DNA或RNA分析检测其基因表达，确保检测分析的准确性，排除一切干扰因素。
实施例一
研究巴马小型猪消化道内大肠杆菌、两歧双歧杆菌、尿肠球菌和嗜酸乳杆菌四种菌的相互作用
1.将单菌种分析***的椭球体多孔磁性容器1、密封环3和密封塞及辅助工具(镊子、移液器头、给药器)在120℃灭菌30分钟；
2.按常规方法制备微生物纯培养液：
配制细菌液体培养基，121℃灭菌30分钟；分别挑取大肠杆菌、两歧双歧
杆菌、尿肠球菌和嗜酸乳杆菌单菌落至5mL细菌培养液中，培养值对数期，
分别扩大培养至50mL菌体量；
3.制备微生物纯培养基质：食物基质粉(粒度40目)，所用基质均在121℃灭菌30分钟；
4.将大肠杆菌、两歧双歧杆菌、尿肠球菌和嗜酸乳杆菌单菌落纯培养液，在无菌条件下，分别与食物基质充分混匀，并形成凝胶态的菌体基质复合体；
5.在无菌条件下，将凝胶态菌体基质复合体分别装入标记的四种椭球体多孔磁性容器1，扭合带有内螺纹和外螺纹的多孔磁性容器1两部分，并在螺纹扭合处套上密封套；
6.用给药器以口服的方式将椭球体多孔磁性容器1送入巴马小型猪消化道，在消化道内驻留一段时间后，排出体外；采用磁力分选器从粪便中椭球体多孔磁性容器1；
7.将椭球体多孔磁性容器1立即放入无菌采样袋，并放入-80℃或液氮中保藏。
在无菌条件下，用冷冻无菌0.1mol/L磷酸盐[pH＝8.0]清洗多孔磁性容器1表面，用干燥无菌吸水纸吸干多孔磁性容器1表面液体，用蘸有浓度为70％的酒精的无菌吸水纸对多孔磁性容器1表面消毒，取下密封套，小心拧开多孔磁性容器1，取出目标菌体基质复合体。
8.对菌体基质复合体内微生物进行计数或抽提基因组DNA或RNA：
a)对抽提的DNA或RNA进行分析检测；
b)对抽提的DNA或RNA进行基因表达分析。
实施例二
研究***内双歧杆菌科、小韦荣球菌和多毛拟杆菌的相互作用
1.将单菌种分析***的子弹型多孔磁性容器1、密封环3和密封塞及辅助工具(镊子、移液器头、给药器)在120℃灭菌20分钟；
2.按常规方法制备微生物纯培养液：
配制细菌液体培养基，121℃灭菌15分钟；分别挑取双歧杆菌科、小韦荣球菌和多毛拟杆菌单菌落至5mL培养液中，培养值对数期，在扩大培养15mL菌体量；
3.制备微生物纯培养基质：制备三份加入30％低熔点琼脂的15mL蒸馏水，121℃灭菌15分钟；
4.待灭菌的低熔点琼脂温度降至30℃～35℃时，分别将双歧杆菌科、小韦荣球菌和多毛拟杆菌纯培养液在无菌条件下与灭菌30％琼脂液等比例充分混匀，并形成溶凝胶态的菌体基质复合体；
5.在无菌条件下，将溶胶态菌体基质复合体分别加入三种标记的子弹型多孔磁性容器1，在子弹型多孔磁性容器1内形成凝胶态菌体复合体后，在开口处套上密封套；
6.分别将装有双歧杆菌科、小韦荣球菌和多毛拟杆菌菌体复合体的子弹型多孔磁性容器1经***给药器送入猕猴雌性***内，3～5天后，采用磁力从猕猴***内取出子弹型多孔磁性容器1；
7.将子弹型多孔磁性容器1立即放入无菌采样袋，并放入-80℃或液氮保藏。
8.在无菌条件下，用冷冻无菌0.1mol/L磷酸盐[pH＝8.0]清洗子弹型多孔磁性容器1表面，用干燥无菌吸水纸吸干多孔磁性容器1表面液体，用蘸有浓度为70％的酒精的无菌吸水纸对多孔磁性容器1表面消毒，用干燥无菌吸水纸吸试密封套处多孔磁性容器1外壁，用镊子小心取下密封套，取出菌体基质复合体。
8.对菌体基质复合体内微生物进行计数或抽提基因组DNA或RNA：
a)对抽提的DNA或RNA进行分析检测；
b)对抽提的DNA或RNA进行基因表达分析。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将单菌种基质和培养基质组成的凝胶态的复合基体转移至多孔磁性容器空心内腔中，并以口服的方式进入人体或动物体消化道环境后排出；
b.通过磁力从排出的粪便中选取多孔磁性容器，经冷藏后取出复合基体检测分析菌种的基因表达情况；所述多孔磁性容器表面以1～3×105个/cm2的方式分布有孔径为200～500nm的通孔；所述多孔磁性容器材质为马氏体不锈钢，所述多孔磁性容器长10～250mm，直径为5～50mm。
2.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：将分别装有不同单菌种基质的多孔磁性容器同时经人体或动物体消化道环境。
3.根据权利要求2所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：所述多孔磁性容器由螺纹连接的上下两部分组成，在连接部外表面套设有密封环。
4.根据权利要求3所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：所述密封环材质为耐高温和耐腐蚀的食品级硅胶。
5.根据权利要求1所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：将单一微生物培养液，在无菌条件下与培养基质充分混匀形成凝胶态的复合基体。
6.根据权利要求5所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：将排出的多孔磁性容器在人和动物开放器官驻留一定时间后，排出或取出后，立即-80℃或液氮中保藏。
7.根据权利要求6所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：在无菌条件下，对冷藏后的多孔磁性容器进行清洗和消毒后取出复合基体，对复合基体内微生物进行计数或抽提基因组DNA或RNA分析检测其基因表达。
8.根据权利要求7所述的用于非疾病诊断和治疗目的的活体内原位检测分析微生物相互作用的方法，其特征在于：采用冷冻无菌的pH = 8.0，浓度为0.1 mol/L的磷酸盐清洗多孔磁性容器表面，用蘸有浓度为70～75%的酒精无菌吸水纸对多孔磁性容器表面消毒。
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