CN106399381B - miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miR‑34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。本发明首次发现一种新的促骨骼肌细胞分化因子—miR‑34c,通过Western blot和免疫荧光染色技术检测miR‑34c对成肌细胞分化的影响,从而确定miR‑34c在骨骼肌发育中的作用,对预防和治疗骨骼肌相关疾病具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,涉及miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。
背景技术
MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的单链小RNA,其长度约为20~25nt,在物种进化中非常保守,它们在特定发育阶段或特定组织中表达。miR-34c是mir-34家族的一员,miR-34家族有3个成员(miR-34a,miR-34b,miR-34c)。其中,miR-34a由一个单独的初级转录产物转录生成,而miR-34b和miR-34c共用一个初级转录产物。在人类基因组中,miR-34a位于1号染色体上,miR-34b和miR-34c位于11号染色体上。60%以上的人类编码蛋白的基因都有miRNA的保守靶位点,因此,miRNA有多种多样的生物学功能,包括信号转导、组织分化、机体的发育等。
骨骼肌由中胚层的间充质干细胞发育而来,是胚胎发育过程中最早形成的组织之一。骨骼肌的发育受到一系列调控因子的精确调控,其中肌肉生成调控因子(MRFs)发挥了核心作用,此外,Wnt、Notch、TGF-β等信号通路也起到了主要的作用。除了上述调控因子外,miRNA在骨骼肌的损伤修复、卫星细胞的增殖与分化、成肌细胞的增殖与分化等骨骼肌的发育进程中发挥了重要的作用。
自1993年发现第一个miRNA后,随后20年中已有10000多个miRNA被陆续发现。它们在细胞增殖、分化、凋亡等生物学进程中发挥了关键的作用。MiRNA调控的多样性,使它们与很多人类疾病相关。因此了解miRNA在肌肉发育过程的作用,对预防和治疗骨骼肌相关的疾病具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用。
为了实现本发明目的,本发明提供一种新的促骨骼肌分化因子—miR-34c。
本发明还提供miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用,其是利用脂质体(例如脂质体2000)在成肌细胞中瞬时转染miR-34c mimics,待细胞汇合度达到85%-95%(优选90%)时,将细胞用分化培养基培养,诱导细胞分化。
本发明中涉及的miR-34c mimics是指miR-34c拟似物,购自上海吉玛制药技术有限公司。所述miR-34c mimics的序列为:
正义链:5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’(SEQ ID No.1)
反义链:5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’(SEQ ID No.2)
本发明中涉及的成肌细胞为小鼠成肌细胞C2C12。
所述分化培养基培养为含有2%马血清和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。
用分化培养基培养的条件为:37℃,5%CO2。
在细胞分化第3天时,提取蛋白质,用Western blot技术检测肌球蛋白重链(MYHC)的表达,发现转染miR-34c mimics的细胞MYHC的表达量高于转染Negative Control(NC)mimics(SEQ ID No.3和4)的细胞;另外,在细胞分化第3天时,取细胞样品,进行细胞免疫荧光染色,发现转染miR-34c mimics的细胞中MYHC阳性细胞数多于转染NC mimics的细胞。以上结果说明过表达miR-34c能促进C2C12细胞的分化。
本发明还提供含有miR-34c mimics的转基因细胞系、工程菌。
本发明首次发现一种新的促骨骼肌细胞分化因子—miR-34c,通过Western blot和免疫荧光染色技术检测miR-34c对成肌细胞(C2C12细胞)分化的影响,从而确定miR-34c在骨骼肌发育中的作用,对预防和治疗骨骼肌相关疾病具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中Western blot检测miR-34c对C2C12细胞分化的影响。
图2为本发明实施例1中免疫荧光检测miR-34c对C2C12细胞分化的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的miR-34c mimics的序列为:
正义链:5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’
反义链:5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’
NC mimics的序列为:
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’
实施例1 miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用
待C2C12细胞的汇合度为60%-70%时,利用脂质体2000(11668-019,Invitrogen)在C2C12细胞中瞬时转染miR-34c mimics,待细胞汇合度达到90%时,将细胞用分化培养基培养,诱导细胞分化。
所述分化培养基为含有2%马血清和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基。
用分化培养基培养的条件为:37℃,5%CO2。
1、Western blot检测miR-34c对C2C12分化的影响
蛋白样品收集:将转染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12细胞倒掉培养基后,用PBS洗3遍细胞,弃去PBS,加入含有1%PMSF的IP裂解液,冰上放置5min,用细胞刮刀将样品刮至1.5ml EP管中,12000g,4℃,离心5min,取上清,按照BCA蛋白定量试剂盒(购自碧云天生物技术研究所)说明书对提取的蛋白进行定量。
Western blot检测:
1)将蛋白样品与5×蛋白上样缓冲液混合,于99℃变性10min,每个样品上样50ug。
2)电泳:浓缩胶时电压恒定在60V左右,电泳45min。当进入分离胶时,电压恒定在100V左右电泳1-2h,直到25KD marker跑至凝胶底部时,停止电泳;
3)转膜:350mA恒流,4℃转膜,蛋白MYHC(肌球蛋白重链)转1小时40分钟,蛋白GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶,内参蛋白)转膜1小时。
4)封闭:将膜放入5%脱脂奶粉中,室温封闭1小时。
5)一抗:GAPDH(1:10000,购自CST公司,货号2118L);MYHC(1:3000,购自Sigma公司,货号M4276),4℃,过夜。
6)洗一抗:TBST在摇床上洗3次,每次10分钟。
7)二抗:山羊抗小鼠(货号ZB-2305)和(货号ZB-2301)山羊抗兔,1:10000(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),室温1小时。
8)洗二抗:TBST在摇床上洗3次,每次10分钟。
9)显影:将曝光过的胶片马上放入显影液中,显影时间根据观察而定。
10)停影:将显影过的胶片放入水中停影。
11)定影:停影后的胶片放入定影液中定影至少5min。
图1结果显示,转染miR-34c mimics的细胞MYHC的表达量明显高于转染NC mimics的细胞。
2、细胞免疫荧光检测miR-34c对C2C12分化的影响
1)细胞固定:将转染miR-34c mimics或NC mimics并分化3天的C2C12细胞倒掉培养基后,用PBS洗3遍细胞,弃去PBS,加入4%多聚甲醛,室温固定30分钟。
2)细胞通透:倒掉固定液,PBS洗3遍,加入0.1%TritonX-100,室温10分钟。
3)细胞封闭:倒掉通透液,PBS洗3遍,加入免疫荧光封闭液(购自碧云天生物技术研究所),室温封闭1小时。
4)一抗:倒掉封闭液,加入MYHC一抗(1:500,Sigma公司),4℃过夜。
5)洗一抗:PBS洗3次,每次10分钟。
6)二抗:Goat anti-Mouse IgG Alexa Fluor 594(1:400,A-11034,购自Life公司),室温1小时,避光。
7)染DAPI:倒掉二抗,PBS洗一次,加入浓度为1μg/ml的DAPI,室温避光染核5分钟。
8)洗DAPI:PBS洗3次,每次10分钟。
9)封片:加少量抗荧光淬灭机,放上盖玻片,封片,镜检。
图2结果显示,转染miR-34c mimics的细胞中MYHC阳性细胞数多于转染NC mimics的细胞。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.miR-34c在体外诱导骨骼肌细胞分化中的应用,其特征在于,利用脂质体在成肌细胞C2C12中瞬时转染miR-34c mimics,待细胞汇合度达到85%-95%时,将细胞用分化培养基培养,诱导细胞分化;
所述分化培养基为含有2%马血清和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基;
所述miR-34c mimics的序列为:
正义链:5’-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3’
反义链:5’-AAUCAGCUAACUACACUGCCUUU-3’。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,待细胞汇合度达到90%时,将细胞用分化培养基培养,诱导细胞分化。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述脂质体为脂质体2000。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用,其特征在于,用分化培养基培养的条件为:37℃,5%CO2。
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miRNA-34c regulates Notch signaling during bone development;Yangjin Bae et al.;《Human Molecular Genetics》;20120412;第21卷(第13期);摘要,第2992页左栏第3段-右栏第2段,图1,补充材料和方法第1页最后1段 * |
Notch signaling inhibits muscle cell differentiation through a CBF1-independent pathway;Carrie Shawber et al.;《Development》;19961231;第122卷;第3765-3773页 * |
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