CN106399119B - 生防菌株hz-9及其在防治大豆孢囊线虫中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生防菌株HZ‑9及其在防治大豆孢囊线虫中的应用，该生防菌株命名为钩状木霉菌HZ‑9，保藏编号为CCTCC NO:M 2016207，保藏时间为2016年4月19日。本发明的生防菌株HZ‑9为钩状木霉菌(Trichoderma hamatum)，其孢子悬浮液对大豆孢囊线虫病有较好的防治效果，当孢子浓度达109cfu/ml，孢囊抑制率达到87.5％。

Description

生防菌株HZ-9及其在防治大豆孢囊线虫中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，尤其涉及生防菌株HZ-9及其在防治大豆孢囊线虫中的应用。
背景技术
大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode,SCN)主要寄生在大豆(Glycine maxL.)上，Ichinohe于1952年首次将此线虫与其他孢囊线虫进行形态学比较，并将其命名为大豆孢囊线虫(Heterodera glycines Ichinohe)。
至今，大豆孢囊线虫已蔓延至世界上主要的大豆种植区，也是危害美国经济最重要的植物病原生物(Wrather J A,Koenning S R.Estimates of disease effects onsoybean yields in the United States 2003to 2005[J].Journal of Nematology,2006,38(2):173-180)，在日本和中国东北部的大豆产区危害非常严重(简恒.植物线虫学[J].中国农业大学出版社,2011:89-94)。
在大豆孢囊线虫的防治措施中，最基础也是最经济的防治方法是农业防治。种植抗病品种是国内外控制大豆孢囊线虫危害，降低大豆产量损失的有效方法(De Bruin J L,Pedersen P.Response of old and new soybean cultivars to Heteroder aglycinesIchinohe[J].Agronomy Journal,2008,100(5):1347-1353)，目前我国已获得一些抗病大豆品种，如抗线1号、抗线2号、齐黄25、嫩丰15等(孔祥超,李红梅,耿甜,黄文坤,彭德良.大豆种质资源对大豆孢囊线虫3号和4号生理小种的抗性鉴定[J].植物保护,2012,38(1):146-150；徐文平,申宏波,苗兴芬,姚文秋.大豆胞囊线虫抗病种质鉴定[J].大豆科学,2007,26(3):377-380)。但是，如果在同一地区连续种植同一抗病品种，SCN毒性增强而导致大豆品种丧失抗性，
大豆种衣剂作为一种化肥和农药复合剂，常被用于防治苗期大豆孢囊线虫的危害(韩晓增,许艳丽.大豆连作减产主要障碍因素的研究Ⅱ.连作大豆土壤有害生物的障碍效应[J].大豆科学,1999,18(1):48-53；贾玉芹，蒋光胜，王晓彤.几种种衣剂的应用效果[J].现代化农业,1995,(12):10-11)。由于这些化学药剂一般毒性较高，在土壤中残留时间较长，会对环境、人畜安全、粮食安全等一系列的副作用，同时，还会使大豆孢囊线虫产生抗药性，现在大都被禁用。。
植物线虫的生物防治研究起步早，发展慢，目前大豆孢囊线虫的生物防治的研究主要集中在真菌、细菌和抑制性土壤等几个领域(尉文彬,武玉环,黄建明,郑志兴.大豆孢囊线虫生物防治研究进展[J].河北农业科学,2013,17(5):56-58+99)。
目前关于大豆孢囊线虫研究较多的是生防真菌，由于其种类多、易分离的特点，一些生防真菌成为人们关注的热点，并被商品化应用于大田。
自1984年最早由Morganjones等人从大豆孢囊线虫孢囊上分离到生防真菌以来，人们对筛选出的SCN的生防真菌的分类和防效做了大量研究(Morganjones G,Rodriguezkabana R,Tovar J G.Fungi associated with cysts of Heteroderaglycinesin the Cauca Valley,Colombia[J].Nematropica,1984,14(2):173-177)。
Carris等描述了定殖于大豆孢囊线虫孢囊上的80种真菌，美国也已报道近百种的食线虫真菌(Carris L M,Glawe D A,Smyth C A,Edwards D I.Fungi associated withpopulations of Heteroderaglycinesin 2illinois soybean fields[J].Mycologia,1989,81(1):66-75)；而Chen等从孢囊上分离到了至少168种真菌(Chen F J,Chen SY.Mycofloras in cysts,females,and eggs of the soybean cyst nematode inMinnesota[J].Applied Soil Ecology,2002,19(1):35-50)。
我国从不同地区的SCN的孢囊上分离到生防真菌共30个属51种，其中以厚垣轮枝菌(V.chlamydosporium)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)等出现频率最高(李进荣,段玉玺,陈立杰,薛春生.大豆根瘤内生细菌对大豆胞囊线虫影响研究[J].大豆科学,2005,24(2):154-156；林茂松.真菌寄生大豆孢囊线虫的初步研究[J].生物防治通报,1990,6(1):38-41；刘杏忠,刘文敏,张东升.定殖于大豆胞囊线虫的淡紫拟青霉生物学特性研究[J].中国生物防治,1995,11(2):23-27)。随着近几年对植物寄生线虫的生防真菌研究的不断深入，有研究者将食线虫真菌分为捕食线虫真菌、内寄生真菌、机会真菌和产毒真菌等(Barron G L.NematophagousHyphomycetes-new species ofHarposporium[J].Antonie Van Leeuwenhoek Journal of Microbiology and Serology,1972,38(2):217-222)。
发明内容
本发明提供了一种生防菌株HZ-9及其在防治大豆孢囊线虫中的应用，该生防菌株HZ-9能够有效防治大豆孢囊线虫病。
所述的生防菌株HZ-9，命名为钩状木霉菌(Trichoderma hamatum)HZ-9，保藏编号为CCTCC NO:M 2016207，保藏时间为2016年4月19日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。
该生防菌株HZ-9的生物学特征为：呈绒毛状菌落，菌丝不发达，分生抱子梗透明，壁光滑，主轴直，顶端逐渐变细，分生孢子绿色，椭圆形，长×宽大小范围大为3.5-4.9μm×2.6-3.4μm。
生防菌株HZ-9的ITS序列如SEQ ID NO.1所示；生防菌株HZ-9的eEF1a1序列如SEQID NO.2所示。
本发明还提供了所述生防菌株HZ-9在防治农作物孢囊线虫中的应用。
所述的农作物为大豆。
具体地，所述大豆的品种为合丰55。
所述的应用，包括：
(1)制备所述生防菌株HZ-9的生防菌剂；
(2)将所述的生防菌剂施用在所述的农作物上。
所述生防菌剂为生防菌株的孢子悬浮液、孢子悬浮液的稀释液或生防菌株的发酵液。
作为优选，所述的生防菌剂中，所述生防菌株HZ-9的浓度为106～109CFU/mL。
具体地，以1升计，所述发酵液的液体培养基为玉米粉30g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml。
以1升计，所述孢子悬浮液的固体培养基为去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
所述发酵液制备过程中的发酵条件为：28℃，100rpm振荡培养10d。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的生防菌株HZ-9为钩状木霉菌，其孢子悬浮液对大豆孢囊线虫病有较好的防治效果，当孢子浓度达109cfu/ml，孢囊抑制率达到87.5％以上。
(2)本发明的生防菌株HZ-9菌落与大豆孢囊线虫接触48h后，幼虫即失去活性；生防菌株HZ-9的发酵液能够抑制孢囊或雌虫内卵的孵化。
(3)本发明生防菌株HZ-9的孢子悬浮液和发酵液均能促进大豆的生长。
附图说明
图1为菌株培养滤液对卵孵化的影响。
图2为菌株HZ-9的形态图；
A.菌落特征；B-D.分生孢子梗和分生孢子。
图3为菌株HZ-9的ITS区和eEF1a1区PCR扩增产物的电泳图；
图4为菌株HZ-9基于木霉属ITS和eEF1a1合并序列构建的***发育树，分支上数字表示大于50％的Bootstrap检验值(1000次重复)。
图5为菌株孢子悬浮液对不同线虫的校正死亡率(％)。
图6为不同浓度的孢子悬浮液对大豆孢囊线虫病的防治效果。
图7为盆栽试验50d时，大豆孢囊线虫在大豆根部的发育；
A，B：处理组；C，D：对照组。
图8为菌株HZ-9不同浓度孢子悬浮液对大豆根鲜重和株高的影响。
图9为温度对菌株HZ-9的菌丝生长和产孢量的影响。
图10为光照对菌株HZ-9的菌丝生长和产孢量的影响。
图11为pH值对菌株HZ-9菌丝生长和产孢量的影响。
图12为碳源对菌株HZ-9的菌丝生长和产孢量的影响。
图13为氮源对菌株HZ-9的菌丝生长和产孢量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。
实施例1 大豆孢囊线虫生防真菌的分离与筛选
一、大豆孢囊线虫孢囊、二龄幼虫和卵悬液的获得
大豆孢囊线虫采自浙江省杭州市、山西省太谷县和安徽省宿州市大豆孢囊线虫危害严重的地块。
1、获取大豆孢囊线虫孢囊
将采集到的大豆根和病土放入淘洗桶中，充分混合后，加入适量的水淘洗均匀，使土样完全溶解，静置约10-20秒后，把悬浮液倒入在双层筛子上(上层为20目，下层为100目)，用强水流冲洗筛子。倒去上层20目网筛上的残余物，用细水流把100目网筛上的沉积物中的泥沙冲去，剩余物用缓慢水流收集在一个干净的烧杯中。在解剖镜下用镊子从中挑取新鲜饱满的棕色孢囊，放入4℃冰箱备用。
将获得的孢囊置于孵化池中，放在28℃生化培养箱中进行孵化，5天后将孵化池中的悬浮液通过500目筛，即可获得较干净的J2悬浮液。
2、获取大豆孢囊线虫二龄幼虫和卵悬液
将上述收集好的孢囊置于一个直径约3cm的小容器中，用玻璃棒底部将孢囊轻轻压碎，然后倒在双层目筛上(上层为100目，下层为500目)用强水流将卵和二龄幼虫冲洗到下层筛子，收集下层筛子上的液体至50ml离心管中，并加入适量76％的现配的蔗糖溶液，2000rpm离心2min，然后将上层悬浮液倒在500目筛子上，用水流轻轻冲洗以除掉蔗糖即可获得大豆孢囊线虫卵的悬浮液，然后置于4℃冰箱保存备用(Acedo J R,Dropkin VH.Technique for obtaining eggs and juveniles of Heterodera glycines[J].Journal of Nematology,1982,14(3):418-420.)。
二、大豆孢囊线虫生防真菌的分离
1、根际土壤中大豆孢囊线虫寄生真菌的分离
每份土壤样品称取1g加入盛有99ml无菌水的三角瓶中置于摇床上200rpm，60min后，制备成土壤悬液，然后进行10-2、10-4、10-6和10-8的梯度稀释，每个稀释度吸取200μl土壤悬液在无菌条件下采用涂布法接种于含有100mg/L氨苄和硫酸链霉素的PDA培养基上，涂布均匀后，将平板倒置于25℃恒温培养箱中暗培养。每个稀释度重复3次，待菌落长出后进行分离纯化(杨蕾,梁军,周国英,倪杨,吕全,张星耀.土壤中杨树溃疡病生防菌的分离鉴定[J].西南农业学报,2015,51(4):116-124.)。
通过上述方法，得知当土壤混合液稀释至10-6时，即可在PDA上发现单菌落，挑取新长出的新鲜菌丝转移到新的PDA培养基上，进行纯化培养；共获得30个菌分离物，经保存后备用。
2、大豆孢囊线虫孢囊上寄生真菌的分离
将上文收集到的孢囊用0.5％的次氯酸钠消毒3min后，用无菌水冲洗三遍，在无菌培养皿底部垫上一张灭过菌的圆形定性滤纸，在滤纸上放置孢囊，封好皿盖，并做好标记，25℃下保湿培养3d。3d后，挑出表面长有菌丝的孢囊，放在含硫酸链霉素和氨苄霉素的PDA固体培养基上，25℃培养。待长出菌落后，用挑针切取菌落边缘的菌丝体转至新的培养基平板中，25℃纯化培养三次。通过上述方法，共筛选出34株真菌，经纯化培养后，保存备用。
3、大豆孢囊线虫二龄幼虫和卵上寄生真菌的分离
将上文中收集到的二龄幼虫和卵先用0.5％的次氯酸钠消毒3min后，用无菌水清洗三遍，制备二龄幼虫和卵的悬浮液，然后进行10倍，100倍，1000倍稀释。分别取原悬浮液、10倍稀释液、100倍稀释液、1000倍稀释液200μl均匀涂布在含硫酸链霉素和氨苄霉素的PDA固体平板上，3d后挑取单菌落的菌丝置于新的平板上，25℃纯化培养三次。通过上述方法，共分离出81株真菌，经纯化培养后，保存备用。
上述三种方法筛选出的真菌，如下表1所示。
表1 大豆孢囊线虫寄生真菌的分离
4、生防真菌的保存
挑取纯化后的菌株，置于含硫酸链霉素和氨苄霉素的PDA斜面上培养2周后放于4℃冰箱进行短期保存；同时长期保存使用超低温保存法，用1.5mL冷冻管灭菌后加入1mL冷冻保存液备用。从生长旺盛的菌落边缘挑取约为0.5cm2的菌块若干块，直接放入冷冻保存管中。
加入菌块的冷冻管先置于4℃冰箱预冷30min，再放入-20℃冰箱30-40min，再转入-75℃冰箱保存备用。冷冻保存液的配方如下(1L)：15％甘油(v/v)，葡萄糖10g，酵母提取物1g，酪蛋白水解物1g，高压灭菌后备用。
三、生防菌株的筛选(HZ-9来自大豆根际土壤)
1、菌株对大豆孢囊线虫孢囊的寄生性
对挑取出的菌株，选取菌落形态不同的真菌，进行大豆孢囊线虫孢囊寄生性的鉴定，按上文的方法获得孢囊，用0.5％NaClO表面消毒3min，用无菌水清洗三遍。
将纯化后的菌株转至PDA培养基上，待菌落直径长至培养皿1/2-3/4时，将消毒后的孢囊放入PDA培养基上新鲜菌丝的边缘，每皿放置10个孢囊，每个菌株设置三个生物学重复。放置在25℃的生化培养箱中培养10d，将孢囊轻轻挑出(注意不要弄破孢囊)，用0.5％NaClO表面消毒3min，无菌水清洗三遍，每个孢囊放于一个灭菌的滤纸片上，保湿培养5d。5d后观察滤纸片上长菌的情况，记录孢囊被寄生的情况。
从筛选出的145株真菌菌株中，选取菌落形态和孢子形态不一致的33株真菌进行回接孢囊的实验，测定所筛选的菌株对孢囊的寄生性。
所选取的33株真菌中，大部分真菌菌株都能进行回接孢囊，其中侵染率达到100％的菌株有7株，分别是：HZ-L9,TG-9,HZ-7,HZ-L21，TG-L37，TG-3和AH-8；侵染率大于90％的菌株有10株，分别为：HZ-3,HZ-4,HZ-5,HZ-L23,HZ-L26,TG-13,TG-17,AH-3,TG-1和HZ-9；侵染率大于80％的菌株有11株，分别为：HZ-L25,HZ-L18,HZ-L7,HZ-L5,AH-L16,TG-15,TG-L8,AH-L7,AH-L6,HZ-1和HZ-9；侵染率小于80％的有5株，分别为HZ-L4,AH-1,TG-L5，AH-L15和TG-6。
2、菌株对大豆孢囊线虫二龄幼虫毒性的初步测定
将纯培养的菌株接种在含硫酸链霉素和氨苄霉素的PDA固体培养基平板上(90mm无菌培养皿)，25℃生化培养箱中培养2-3d后，在菌落边缘接入20μL二龄幼虫悬浮液(约200条)，分别于24h，48h后显微镜下观察被菌丝粘着和穿透及随后被消化的情况，同时在不接菌的PDA培养基上也接入同样多的线虫作为对照，每个处理设置三个生物学重复。
对上述菌株进行大豆孢囊线虫二龄幼虫致病性的初步筛选，结果显示，进行测定的33株菌株中，其中HZ-4,HZ-9,HZ-L9,TG-1，TG-15,TG-L37及AH-8菌株对大豆孢囊线虫二龄幼虫的活动能力有影响，虫体接触菌丝后，线虫行动自由度降低；HZ-L9及HZ-9菌落与幼虫接触后，幼虫在24h后即失去活性，48h以后被菌丝覆盖；TG-1，TG-15及AH-8在菌丝接触虫体48h后线虫虫体才开始僵直，而其他菌株菌丝对大豆孢囊线虫二龄幼虫没有毒杀作用，虫体48h后仍能活动自由。
3、菌株发酵液对孢囊或雌虫内卵孵化的影响
将菌株接种于盛有150ml玉米粉液体培养基的250ml的三角瓶中，28℃、100rpm振荡培养10d，培养液经灭菌的双层擦镜纸过滤除去菌丝团，然后4℃12000rpm离心20min，上清液通过直径0.22um的微孔滤膜，即得菌株发酵液，保存在4℃冰箱备用。
在24孔培养基中每孔加入1ml的菌株发酵液，另加入5个雌虫，无菌水做对照，每个菌株的发酵液及对照均设6个重复，将24孔细胞培养板放置在28℃生化培养箱中，稀释0x、5x、10x、20x五个浓度梯度，每皿加入500μL，用无菌水做对照，重复三次，并用封口膜封严，防止水分蒸发和杂菌污染。置于25℃培养箱中10d。观察记录孵化出的线虫数，计算孵化相对抑制率。
采用上述方法检测菌株发酵液对大豆孢囊线虫卵孵化的影响，首先分别用33株菌株的发酵液原液测定其对大豆孢囊线虫卵孵化的影响，结果可知，菌株HZ-L9，HZ-9，HZ-L26，AH-1，AH-L6，TG-L5，TG-16对大豆孢囊线虫孢囊或雌虫内卵的孵化有抑制作用，其中菌株HZ-L9和菌株HZ-9的发酵液原液基本不能使孢囊或雌虫内的卵孵化(图1)。
通过对菌株HZ-L9和菌株HZ-9的发酵液原液进行5x，10x，20x稀释，以无菌水作对照，再次测定其稀释液对卵孵化的影响，发现所获取的两株目的菌株的发酵液对大豆孢囊线虫卵的孵化有一定的抑制作用(见表2和3)，并且各稀释浓度的发酵液以及无菌水处理之间，对线虫孵化影响差异显著，其中发酵液原液处理，几乎没有线虫孵化；20x稀释时，两菌株对孢囊或雌虫内卵的孵化抑制率分别达到47.75％和45.87％，显示较好的抑制作用。
表2 HZ-L9发酵液不同稀释倍数对大豆孢囊线虫卵孵化的影响
注:不同大、小写英文字母分别表示差异极显著(P≤0.01)和差异显著(P≤0.05)，字母相同者为差异不显著。
表3 钩状木霉(HZ-9)发酵液不同稀释倍数对大豆孢囊线虫卵孵化的影响
注:不同大、小写英文字母分别表示差异极显著(P≤0.01)和差异显著(P≤0.05)，字母相同者为差异不显著。
实施例2 生防菌株的鉴定
一、形态鉴定
将保存于4℃PDA培养斜面中的菌株移入直径90mm的PDA平板上，28℃生化培养箱中活化3-5d，用直径14mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，转接到新的PDA平板上，28℃生化培养箱中恒温培养，3次重复。逐日观察记录菌落形态、颜色及生长状况。
待上述菌落培养3d后，用电子显微镜(LEICA DMI 3000B，德国徕卡)观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子等的形态特征，统计100个孢子的长、宽，计算其长宽比。根据木霉属真菌菌落形态、孢子特征，对其进行初步鉴定。
菌株HZ-9在PDA呈绒毛状菌落，菌丝不发达，分生抱子梗透明，壁光滑，主轴直，顶端逐渐变细，分生孢子绿色，椭圆形，长×宽大小范围大约3.5-4.9μm×2.6-3.4μm(图2)。
二、分子生物学鉴定
1、DNA的提取方法
用解剖刀刮取PDA平板上25℃生化培养箱中培养了3d的菌丝，将其放置于含有石英砂的振荡管中，每管加入800μl CTAB抽提液，用振荡器震荡90s，65℃水浴孵育1-2h，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混匀，10000rpm离心15min，取上清液(约750μl)转入2ml离心管中，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心20min，取上清液(约450μl)至1.5ml离心管中，加入2/3体积的异丙醇混匀5min，12000rpm离心10min，弃上清，加入200μl 70％的乙醇清洗，12000rpm离心1-2min，倒光液体，晾干沉淀，加入30μl TE水悬浮溶解沉淀，即可获得DNA。
2、ITS序列和eEF1a1片段的扩增
以基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITS1和ITS4扩增ITS区的片段以及引物tef71f和tef997R扩增eEF1a1片段(Shoukoui E,Bissett J.Preferred primers forsequencing 50end of the translation elongation factor 1-alpha gene(EF1-a1)andsubnit 2of the RNA ploymerase B gene(RPB2)ISTH available from:http://isth.info/methods,2008.)。
实验所用PCR扩增试剂盒购自大连宝生物工程有限公司(Takara)。引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。
PCR扩增采用50μl反应体系，各试剂用量如下：
引物序列：
ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
tef71f5’-CAAA ATG GGT AAG GAG GAS AAGAC-3’
tef997R5’-CA GTA CCG GCR GCR ATR ATS AG-3’
扩增ITS区的反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，8℃永久保存。
扩增eEF1a1片段采用‘touchdown’扩增程序：首先94℃预变性4min，然后4个循环：94℃变性1min，70℃退火1min30s，72℃延伸1min30s；26个循环：94℃变性1min，68℃(每经过一个循环降低0.5℃)退火1min30s，72℃延伸1min30s；12个循环：94℃变性1min，55℃退火1min30s，72℃延伸1min30s；72℃延伸7min，8℃保存。
PCR程序完成后取2μl PCR产物加入3μl 6×Loding buffer混匀后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离(120V，400mA，25min)。电泳后经EB染色10-15min，在紫外检测仪上观察和拍照。
3、PCR产物的纯化
选用浙江爱思进生物技术公司(AxyGen)的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行PCR产物的回收、纯化。
4、纯化产物的连接
PCR纯化产物可直接与pUCM-T连接，采用10μl反应体系，依次加入：
12000rpm离心10秒，置4℃连接过夜或16℃连接4小时。
5、连接产物的转化
(1)从-70℃冰箱中取100μl大肠杆菌DH 5α感受态，1min冰上解冻；
(2)向离心管中加入10μl的上述连接溶液，轻轻搅拌均匀，冰上放置20-30min；
(3)42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却5min；
(4)向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养40min；
(5)1500rpm离心2min，去上清800μl，吹打混匀剩余液体，吸取200μl涂布于含Amp，X-gal和IPTG筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h。
6、重组质粒的PCR鉴定
将菌液直接用于PCR鉴定，步骤如下：
(1)100ml LB液体培养基中加入100μl氨苄霉素(100mg/ml)
(2)用0.2μl无菌eppendorf管挑取白色单菌落接种到含有氨苄霉素的2ml LB培养液中，振荡培养(37℃，180rpm)约12h；
(3)取2μl上清用于PCR鉴定(25μl反应体系)。
7、DNA序列测定与分析
每个平板挑取3个阳性克隆送生工生物(上海)科技有限公司测序。测序结果用DNAstar进行编辑，运用木霉鉴定在线网站(http://www.isth.info)上的7Hc/70KEY和TWcABLAST对序列进行比对分析。
菌株HZ-9的rDNA–ITS(SEQ ID NO.1)和eEF1a1片段(SEQ ID NO.2)经PCR克隆、测序，结果如图3，菌株HZ-9的rDNA–ITS(SEQ)和eEF1a1片段大小分别为600bp和760bp，运用木霉菌鉴定在线网站(http://www.isth.info)上的7Hc/70KEY和TWcABLAST对序列进行比对分析可知，菌株HZ-9的两个片段均与Trichoderma hamatum有高度同源性。
三、***发育分析
将由DNAStar软件编辑后的序列在GenBank中进行Blast比对，根据序列同源性下载相关序列。下载的序列用Mega 6.0软件Clustal W程序进行多序列联配，对联配结果进行***发育分析，以邻接法(N-J)构建***进化树，用Bootstrap对***树进行检验，1000次重复。
选择GenBank中Trichoderma属已公布的种的ITS序列和eEF1a1序列(见表4)，用Mega 6.0软件对rDNA–ITS和eEF1a1片段合并后序列进行聚类分析，并分别以钩状木霉Trichoderma hamatum、里氏木霉Hypocrea lixii作为外群，经Clustal W匹配排列后，用Mega6.0软件N–J法分别构建***发育树，从图4可知菌株HZ-9与Trichoderma hamatum在同一分支，亲缘关系最近。
表4 用于多基因序列分析的木霉属菌株
综上所述，结合形态学和分子生物学鉴定结果，将菌株HZ-9鉴定为钩状木霉(T.hamatum)。
将上述菌株HZ-9进行菌种保藏，该生防菌株命名为钩状木霉菌(Trichodermahamatum)HZ-9，保藏编号为CCTCC NO:M 2016207，保藏时间为2016年4月19日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。
实施例3 生防菌株孢子悬浮液对不同线虫的毒杀作用
南方根结线虫(Meloidogyne incognita)二龄幼虫(juvenile 2)为长期在番茄上纯培养获得，挑取番茄根部南方根结线虫的卵囊置于孵化器中进行孵化，两天后即可获得大量干净的南方根结线虫(J2)悬浮液，然后配成每10ul含100条J2的悬浮液4℃冰箱保存备用。
甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor)、松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides bessyi)均为长期培养在灰葡萄菌上的半寄生性线虫，将线虫接种在长满灰葡萄菌的PDA培养基上，一个月后，向皿中加入5ml无菌水即可获得干净的线虫滤液，然后配成每10μl含100条J2的线虫悬浮液4℃冰箱保存备用。
1、菌株孢子悬浮液的制备及计数
从保存菌株的斜面上用灭菌的挑针挑取菌丝接种到含有硫酸链霉素和氨苄霉素的PDA平板中央，置于28℃生化培养箱中培养1周后，加入6ml灭菌水到PDA平板表面，用灭过菌的三角棒刮取菌株的菌丝和孢子，所获得的悬浮液通过灭过菌的双层纱布过滤除去菌丝即得干净的孢子悬浮液。
用型号为XB-K-25的血球计数板对孢子悬浮液进行计数，将孢子悬浮液充分混匀，根据实际情况稀释10倍到100倍或不稀释，首先将混匀后的孢子悬浮液用滴管滴在中央平台上，盖上盖玻片，在低倍镜下找到方格网后，转换至高倍镜下进行观察和计数，通常检查5个中格内的孢子数，5个中格分别在四个角上和中央，计数的方格多分布在不同的方位上，可以避免孢子在各个方位上分布不均所造成的误差。计数后，用无菌水调至所需浓度放于4℃冰箱保存备用。
2、生防菌株孢子悬浮液(浓度为108/ml)对线虫毒杀作用的测定
将大豆孢囊线虫二龄幼虫的悬浮液配成每10μl含100条J2的悬浮液，用无菌的24孔细胞培养皿，加入500μl事先准备好的孢子悬浮液，以无菌水做对照，每个处理3个生物学重复，每孔中加入10μl配置好的J2悬浮液或者其他供试线虫悬浮液，48h后观察并计算击倒率。
菌株HZ-9对供试的几种植物病原线虫均具有一定的活性，其对大豆孢囊线虫校正死亡率达到83.3％；对松材线虫校正死亡率达到85.6％；对甘薯茎线虫和南方根结线虫的毒杀作用相对较差，校正死亡率分别为64.0％和58.3％(图5)。
实施例4 生防菌株的盆栽防效试验及其生物学特性
一、实验材料
(1)菌株：HZ-9；
(2)供试大豆品种：大豆孢囊线虫感病品种合丰55；
(3)供试大豆孢囊线虫：采自安徽省宿州市大豆孢囊线虫危害严重的地块，经多年纯培养获得；
(4)半乳糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖；氯化铵、谷氨酰胺、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸钠、酵母膏、脯氨酸、甘氨酸、硫酸铵购买于生工生物(上海)科技有限公司。
二、实验方法
制备生防菌株HZ-9的孢子悬浮液(方法同实施例2)，用无菌水分别把菌株的孢子悬浮液稀释成109cfu/ml、108cfu/ml、106cfu/ml、104cfu/ml、102cfu/ml的不同梯度。
大豆种子放入0.5％次氯酸钠溶液中，用玻璃棒搅拌4min，然后用无菌水彻底冲洗3次后，将大豆在无菌水中浸泡1h以去除残留的次氯酸钠，然后置于放有一层无菌滤纸的大培养皿中(直径15cm)，大豆上再覆盖一张浸湿无菌滤纸，盖好培养皿后置于25℃培养箱中黑暗培养。
期间每天用无菌水冲洗大豆并注意保湿培养，培养箱中温度设置在25℃，16h光照，8h黑暗处理，湿度60％，光照100％。5天后，当根大约4-5cm长时，挑选长势一致的幼芽移栽到盛有350cm3无菌细沙的塑料杯中(直径12cm)，然后将所有的塑料杯都放入塑料箱中(550×350×90mm)培养。
待幼苗长出3天后，每个杯中接入15ml所设定的不同浓度的孢子悬浮液。接种菌悬液2d后接种线虫，每株接种1500个卵。用直径0.5cm的玻璃棒在大豆根部周围土壤打3-4个3cm深的小洞。将配制好的含1500个卵的线虫悬浮液4ml注入小洞中，并用沙子封上。每个菌悬液浓度处理重复4次，以无菌水代替菌悬液作对照处理。
接种线虫后，每隔7天浇一次设定浓度的孢子悬浮液(109cfu/ml、108cfu/ml、106cfu/ml、104cfu/ml、102cfu/ml)或发酵液原液。50天后计数大豆根部和土壤中雌虫数量以及根上线虫数，计算孢囊抑制率。
接种线虫50d后，采用次氯酸钠-酸性品红染色方法，对大豆根部线虫进行染色。将洗净的病根放入150ml的小烧杯中，在烧杯中加入50ml蒸馏水，并加入适量5.25％的次氯酸钠(次氯酸钠的用量取决于根组织的幼嫩程度)，用玻璃棒不断搅拌4min后取出根，用水流冲洗45s，将根组织浸泡在蒸馏水中15min，以彻底去除次氯酸钠，倒去蒸馏水，将根组织放在盛有30-50ml蒸馏水的烧杯中，并加入1ml的酸性品红溶液，微波炉中煮沸30s，冷却后，用蒸馏水漂洗根组织，将根组织放入20-30ml酸性甘油(在纯甘油中滴加2-3滴5mol/L的盐酸)中煮沸使根组织褪色(注意不要煮沸过度，否则根组织易变黄)，待冷却后，取出根组织在体视显微镜下观察。
待大豆苗生长50d后，调查大豆根部的孢囊数量，并计算不同处理对大豆孢囊线虫的抑制率：孢囊抑制率(％)＝(对照组孢囊数量－处理组孢囊数量)/对照组孢囊数量×100％。
大豆根部孢囊数量的调查结束后，测量全部植株的株高和根鲜重。
试验数据经SAS软件和Excel 2013软件统计，并采用单因素方差分析(One WayANOVA)进行差异显著性分析。
1、温度对菌丝生长和产孢量的影响
采用菌碟接种法，即用直径为14mm的打孔器，从培养了3d的PDA平板上的菌落边缘打出菌碟，将菌碟接种于新的PDA平板上，分别置于15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃生化培养箱内培养，每个温度为1个处理，每个处理4次重复，培养2d后观察菌落生长状况，十字交叉法测量菌落直径，并于5d后检查其产孢量。
2、光照对菌丝生长和产孢量的影响
打取菌碟后，接种于PDA平板上，28℃下分别置于24h光、12h光12h暗、24h暗下培养，每种光照条件为1个处理，每个处理4次重复。培养2d后观察菌落生长状况，十字交叉法测量菌落直径，并于5d后检查其产孢量。
3、pH对菌丝生长和产孢量的影响
将高压灭菌后的PDA培养基在超净工作台中，用l mol·L-1的HCl和lmol·L-1的NaOH配置pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PDA培养基，制成90mm的平板，打取菌碟放在平板中央，每个pH值为1个处理，每个处理4次重复。培养2d后观察菌落生长状况，十字交叉法测量菌落直径，5d后检查其产孢量。
4、不同碳源对菌丝生长和产孢量的影响
以查氏培养基(NaNO3 2.00g，K2HPO4 1.00g，KCl 0.50g，MgSO4·7H2O 0.50g，FeSO40.01g，蔗糖30.00g，加水定容至1000ml)为基础培养基。以NaNO3为氮源，测定半乳糖、可溶性淀粉、甘露醇、果糖、麦芽糖、葡萄糖、山梨醇、蔗糖对菌株生长的影响，以无碳源查氏培养基为对照，每个处理4次重复。培养2d后观察菌落生长状况，十字交叉法测量菌落直径，5d后检查其产孢量。
5、不同氮源对菌丝生长和产孢量的影响
以查氏培养基为基础培养基。以蔗糖为碳源，测定甘氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、酵母膏、硫酸铵、牛肉浸膏、胰蛋白胨、氯化铵、硝酸钾对菌株生长的影响，以无氮源查氏培养基为对照，每个处理4次重复。培养2d后观察菌落生长状况，十字交叉法测量菌落直径，5d后检查其产孢量。
二、实验结果
1、生防菌株孢子悬浮液或发酵液原液对大豆孢囊线虫病的防治效果
在盆栽大豆苗根部土壤中施用不同浓度的孢子悬浮液50d后，统计大豆根部和土壤中的白雌虫和孢囊数量，计算目的生防真菌对大豆孢囊线虫引起的大豆孢囊线虫病的孢囊抑制率；通过酸性品红染色法统计大豆根部不同龄期的线虫数，观察处理组与对照组根部线虫减少情况。
图6为生防真菌钩状木霉(HZ-9)对大豆孢囊线虫病防治效果的评估。
与对照相比，钩状木霉(HZ-9)孢子悬浮液浓度在106-109时，防治效果较好，且孢囊抑制率最高达到87.5％。
图7为盆栽试验50d后，孢子悬浮液处理与用无菌水处理的大豆孢囊线虫侵染的大豆根部线虫侵染状况，，与对照相比，根上线虫最高减少96％，说明所筛选出的生防菌株的孢子悬浮液在盆栽试验中对大豆孢囊线虫具有抑制作用。
2、生防菌株不同浓度孢子悬浮液对大豆株高和根鲜重的影响
对50d后大豆的根鲜重和大豆株高进行统计分析，来衡量目的生防真菌对大豆长势的影响。
钩状木霉(HZ-9)不同浓度孢子悬浮液对感染了大豆孢囊线虫病的大豆根鲜重和株高的影响结果(图8)。
施用钩状木霉孢子悬浮液处理组与对照组相比，大豆植株的根鲜重和植株高度会有不同程度的增加。
总之，生防菌株在盆栽试验中对大豆孢囊线虫的孢囊和二龄幼虫均有抑制作用，且对大豆的生长有一定的促进作用。
3、生防菌株HZ-9发酵液对大豆孢囊线虫病的防治效果以及对大豆株高和根鲜重的影响如表5所示，菌株HZ-9的发酵液对大豆孢囊线虫病有较好的防治效果，将发酵液原液施用于大豆盆栽试验中，孢囊抑制率最高达到88.9％，根上线虫数量与对照相比最高减少75％，同时，与对照相比，大豆的株高有一定的增加，处理组根鲜重与对照组相当。
表5 生防菌株HZ-9发酵液对大豆孢囊线虫病的防治效果以及对大豆株高和根鲜重的影响
4、温度对菌丝生长和产孢量的影响
温度对钩状木霉HZ-9菌丝生长和产孢量的影响，如图9所示。
温度对菌株HZ-9的生长影响有一定的差异，其中，菌株HZ-9在温度为35℃时不生长，在温度为25-28℃时生长最好，但在温度为15℃和35℃时均不产孢，温度为28℃时产孢量最大。
5、光照对菌丝生长和产孢量的影响
图10为光照条件对钩状木霉HZ-9菌丝生长和产孢量的影响。
光照条件对钩状木霉菌丝生长的影响不大，但对产孢量有一定影响，24h全光照时，产孢量最大，达到2.4×109个，而光照和黑暗交替培养时，最不利于钩状木霉产孢。
6、pH值对菌丝生长和产孢量的影响
图11为不同pH值对钩状木霉HZ-9菌丝生长和产孢量的影响。
钩状木霉在pH值为6时，生长和繁殖达到最佳，但钩状木霉的产孢对碱性环境较为敏感，在pH值为11.0时基本上不产孢。
7、碳源对菌丝生长和产孢量的影响
图12为碳源对钩状木霉HZ-9的菌丝生长和产孢量的影响。
8种碳源与无碳对照相比菌丝生长和产孢量均有一定的差异，不同碳源对菌丝生长只存在很小的差异，钩状木霉在以可溶性淀粉作为碳源的培养基上生长最快，同时在以半乳糖为碳源的培养基上产孢量最大，达到4.8×108个。
8、氮源对菌丝生长和产孢量的影响
图13为氮源对钩状木霉(HZ-9)菌丝生长和产孢量的影响。钩状木霉在以酵母膏为氮源的培养基上生长和繁殖最好，5d时其产孢量最高能达到0.4×108个。

Claims (7)

1.一种生防菌株HZ-9，其特征在于，命名为钩状木霉菌HZ-9，保藏编号为CCTCC NO:M2016207，保藏时间为2016年4月19日。
2.如权利要求1所述的生防菌株HZ-9，其特征在于，所述生防菌株HZ-9的生物学特征为：呈绒毛状菌落，菌丝不发达，分生孢 子梗透明，壁光滑，主轴直，顶端逐渐变细，分生孢子绿色，椭圆形，长×宽大小范围为3.5-4.9μm×2.6-3.4μm。
3.如权利要求1所述的生防菌株HZ-9，其特征在于，所述生防菌株HZ-9的ITS序列如SEQID NO.1所示，eEF1a1序列如SEQ ID NO.2所示。
4.如权利要求1所述的生防菌株HZ-9在防治农作物孢囊线虫中的应用，其特征在于，所述的农作物为大豆。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述大豆的品种为合丰55。
6.如权利要求4～5任一项所述的应用，其特征在于，包括：
(1)制备所述生防菌株HZ-9的生防菌剂；
(2)将所述的生防菌剂施用在所述的农作物上。
所述生防菌剂为生防菌株的孢子悬浮液、生防菌株的发酵液或孢子悬浮液的稀释液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的生防菌剂中，所述生防菌株HZ-9的浓度为106～109cfu/mL。
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