CN106366180A - 一种上皮生长因子受体免疫原多肽及其用途 - Google Patents

一种上皮生长因子受体免疫原多肽及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种上皮生长因子受体免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的上皮生长因子受体免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于***药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR‑T细胞免疫治疗的应用。本发明的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞增殖，（2）促进CD8+免疫应答，（3）促进体内产生上皮生长因子受体抗体，（4）促进T细胞与肿瘤细胞的结合，（5）在体内，能提高胶质瘤荷瘤小鼠的生存率。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR‑T等细胞疗法。

Description

一种上皮生长因子受体免疫原多肽及其用途
技术领域
本发明是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本发明涉及用作抗癌疫苗的上皮生长因子受体免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
背景技术
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到***的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体。EGFR也被称作HER1、ErbB1，突变或过表达一般会引发肿瘤。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。其可能机制有：EGFR的高表达引起下游信号传导的增强；突变型EGFR受体或配体表达的增加导致EGFR的持续活化；自分泌环的作用增强；受体下调机制的破坏；异常信号传导通路的激活等。EGFR的过表达在恶性肿瘤的演进中起重要作用，胶质细胞、肾癌、肺癌、***癌、胰腺癌、乳腺癌等组织中都有EGFR的过表达。对胶质细胞瘤的研究发现EGFR的高表达主要与其基因扩增有关。但有时EGFR表达水平的调节异常也存在于翻译及翻译后。EGFR在肿瘤中的高表达还可能与活化后降解减少有关，一些研究指出c-Src可通过抑制受体泛素化和内吞作用而上调EGFR水平。许多肿瘤中有突变型EGFR存在，现已发现许多种EGFR突变型。突变型EGFR的作用可能包括：具有配体非依赖型受体的细胞持续活化；由于EGFR的某些结构域缺失而导致受体下调机制的破坏、异常信号传导通路的激活、细胞凋亡的抑制等。突变体的产生是由于EGFR基因的缺失、突变和重排。EGFR的配体对细胞内信号传导有很大影响。EGFR的配体通过自分泌形式激活EGFR促进细胞增殖，他们的共表达往往预示肿瘤预后不良，例如，在乳腺浸润性导管癌的研究中发现，TGFα与EGFR共表达，且这种共表达与病人的生存率显著相关。Kopp等人对结/直肠癌的研究表明肿瘤的自分泌生长是EGFR的过表达及其配体表达共同作用的结果。
EGFR可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，EGFR分子量较大，较难得到纯度高的EGFR。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本发明提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
发明内容
发明目的
本发明提供一种EGFR免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。
技术方案
本发明的技术方案在于提供一种上皮生长因子受体免疫原多肽，序列为SSGCTGPRESDPKRCCRKFRDEATCKDTCDP(SEQ ID NO：1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于***药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
有益效果
本发明的上皮生长因子受体免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于(1)促进T细胞增殖，(2)促进CD8+免疫应答，(3)促进体内产生上皮生长因子受体抗体，(4)促进T细胞与肿瘤细胞的结合，(5)在体内，能提高胶质瘤荷瘤小鼠的生存率。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。
具体实施方式
多肽由上海生工吉尔合成。
实施例1
用胶质瘤肿瘤模型检测EGFR免疫原多肽的体内活力。
6-8周龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)多肽低剂量组；(3)多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。建立胶质瘤动物模型，在接种C6鼠胶质瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效提高胶质瘤荷瘤小鼠的生存率，高剂量多肽的生存率达到57.1％。
实施例2
采用检测免疫动物体内EGFR免疫原抗体滴度的方法，评价EGFR免疫原多肽的免疫原性。BALB/c白鼠40只，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14、21、28天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部***附近多点注射。于28天，眼眶静脉丛定点取血，每周一次，12000rpm离心2min，分离血浆取上清液，-20℃低温保存备用。待室温溶解后，取0.1ml上清液间接ELISA检测血清中EGFR免疫原抗体滴度。以各样品实际A值(OD450)比阴性空白对照血清A值的值为抗体滴度。
结果表1所示：BALB/c小鼠单次静脉注射给予有效剂量的EGFR免疫原多肽后，多肽能促进体内EGFR抗体产生，在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
表1多肽对体内EGFR抗体滴度的作用
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
实施例3
T淋巴细胞的增殖作用：无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，Tris-NH4CL破解红细胞，冰水浴静置3-5min，离心(1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涤细胞两次。最后加入10％小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买)、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液100μl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终浓度为5μg/ml)。37℃细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μl MTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm处OD值，每孔设5个平行。
表2多肽对T淋巴细胞的增殖作用
*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。
实验结果见表2，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。
实施例4
EGFR免疫原多肽的免疫原性测定：采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。6-8周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部***附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰昕生物医疗技术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。
表3多肽对CD8+T淋巴细胞的作用
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
实验结果见表3，与空白组比较，多肽能促进小鼠CD8+T淋巴细胞，在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
实施例5
EGFR免疫原多肽的T细胞结合试验：采用玫瑰花环试验评价T细胞与人胶质瘤细胞U251的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心1000转/分，10分钟，弃上清，以Hank’s液调细胞浓度为3×106/ml。于96孔培养板中培养。
实验设空白对照组、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入胸腺淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液500μl，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽。37℃细胞培养箱，培养48h，培养结束后每孔中加入100μl/孔人胶质瘤U251细胞(细胞浓度为1×106/ml，含10％胎牛血清)，混匀，500转/分，离心5分钟。弃上清，加少量戊二醛，轻轻晃动，使细胞悬浮，加甲紫染色，400倍显微镜观察。凡结合3个以上肿瘤细胞的T淋巴细胞为花环阳性细胞。记数100个T细胞中形成花环的淋巴细胞百分率，即为T细胞与U251细胞的结合率。每孔设5个平行。
实验结果见表4，与空白组比较，EGFR免疫原多肽可以显著性增加T细胞与U251细胞的结合率(P<0.01)，在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。
表4多肽对T细胞结合的影响
*P<0.05，**P<0.01与空白组相比。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州普罗达生物科技有限公司
<120> 一种上皮生长因子受体免疫原多肽及其用途
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Ser Gly Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Pro Lys Arg Cys Cys
1 5 10 15
Arg Lys Phe Arg Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Asp Pro
20 25 30

Claims (4)

1.一种上皮生长因子受体免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：在制备用于***药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用。
4.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。
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