CN1063416A - 无毒微生物及其用途：伤寒沙门菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有伤寒沙门氏菌(S、typhi)无毒衍 生物的对脊椎动物门和非脊椎动物门免疫接种的致 免疫组合物。该衍生物具有cya和/或crp和/或 cdt基因的一种突变。本发明还提供具有上述类型 无毒衍生物的对脊椎动物和非脊椎动物免疫接种用 的致免疫组合物。所述类型衍生物能表达一种重组 基因，该重组基因来源于所说脊椎动物或非脊椎动物 个体的病原体，对所述病原体能诱发出免疫应答的抗 原。本发明的其它实施方案包括由这些菌株制备致 免疫组合物的方法，和在制备致免疫组合物中有用的 菌株，以及通过施用致免疫组合物刺激免疫***以对 伤寒沙门氏菌的致免疫抗原产生应答的方法。

Description

本申请是于1990年11月9日提出的未决的美国专利申请No.07/612，001的继续申请，该US申请No.07/612，001是于1988年6月1日提出的美国专利申请系列号No.200934的继续申请，该No.200934又是于1987年6月4日提出的未决的美国专利申请系列号No.058360的继续申请，该US系列申请号200934也是于1988年10月3日提出的未决的美国专利申请系列号No.251304的继续申请。该US  No.251304则是于1987年10月7日提出的未决的美国专利申请No.106072的继续申请。这些申请均作为参考而引入本文。
本发明涉及无毒微生物，它们的制备方法以及它们在疫苗中的运用，更进一步说，它涉及无毒伤寒沙门菌（S.typhi）。
对于不发达世界的居民以及走访过流行区域的工业化国家的旅游者以及在实验室中从事熟练试验的临床微生物学家们来说，因为伤寒沙门菌而引起的伤寒热仍然是一个重要的公共健康问题。现有获得许可的肠胃外杀死整个细胞的伤寒疫苗是保护性的，但它会频繁引起令人不能接受的明显的***和局部有害反应（Levine，Typhoid  fever  Vaccines，in  plothin  SA，Mortimer  EA  Jr.（eds）：VACCINES.Philadelphia，WB  Saunders，1988，pp.333-361），其它疫苗包括最近获得许可的活口服疫苗菌株Ty21a和实验性肠胃外Vi多糖疫苗。
口服疫苗的优点在于能将复制组织输送到粘液免疫***中，在该***中局部反应能被最大限度地激发。此外，减弱毒性的伤寒沙门菌是一种有吸引力的候选物，可用它作为载体疫苗以表达外源抗原，并将它们输送到人体免疫***中。但是，要想成功地将这种方法用于免疫人体的一个关键先决条件是，必须具有高度致免疫作用而又安全的减毒伤寒沙门菌菌株，以便将外源蛋白及多糖抗原输送到免疫***中。
现有的以Ty21为基础的口服疫苗有几个缺陷，Ty21a其致免疫性较低且需要多次口服剂量才能免疫，当大规模地将其发酵及冻干时，其存活有机体的产量较低。此外，Ty21a中除了qalE和Via以外还有多个至今尚未确定的突变。（Hone等人，1987，J.Infect，Dis.156：167-174;Hone等人，1988，J.Infect，Immun.56：1326-1333）。
表达宋内志贺菌（shigella，snnei）抗原（Formal等人，1981.Infect.Immun.34：746-750）或霍乱弧菌（vibrio  cholerae）01血清型Inaba的O抗原（Forrest等人，1989.J.Infect.Dis.159：145-146）的Ty21a的构件已经在人体中进行了临床试验。尽管在北美志愿者身上试验的两组Ty21a/宋内志贺菌构件对用病原宋内志贺菌进行的实验感染具有有效的保护性。但各组之间均有所不同，且其他几组没有保护性（Black等人，J.Infect.Dis.1987.155：1260-1627）;Herrington等人。1990，vaccine8：353-357）。Ty210/Inaba构件只在少数疫苗中且低滴度地诱发血清Inaba杀弧菌抗体和肠SIgA抗-InabaO抗体。（Tacket等人，1990，Infect.Immun.1620-1627）在用病原霍乱弧菌01进行的实验攻击研究中，该构件的受体没有完全对腹泻产生有效保护，但它确实减轻了腹泻且泻出较少野生型霍乱弧菌细胞（Tacket等人，Id）。
采用Ty21a作为候选载体菌株的主要缺陷在于其致免疫性有限，对其分子基础上的减毒缺乏准确的情报，以及该菌株的细菌遗传控制（例如转化，电穿孔术及重组频率）中存在实际困难，此外在冻干培养恢复之后，其存活力极低。
本申请人已经发现了新的对病毒性感染用疫苗进行保护的方法，在这些疫苗中采用了转座子诱导的有毒试剂的无毒突变，在该方法中，导致无毒损伤不可能因饮食或其它任何由动物宿主所提供的东西而恢复。本申请人的初始工作有些已在欧洲专利公开No.315，682（1987年5月17日公开）和专利合作条约（PCT）公开No.WO88/09669（1988年12月15日公开）中描述过，这些工作包括，通过在鼠伤寒沙门菌（Salmonella  typhimurium）腺苷酸环化酶基因（Cya）和环化Amp受体蛋白基因（Crp）中导入缺失突变来制备无毒微生物的方法。本申请人还提供了用于制备其它类型的无毒突变细胞的方法。这些突变细胞可望用作表达重组抗原的载体细胞。这些细胞的特征在于缺少编码细胞存活所必需的酶的功能性天生基因，其中该酶催化一种基本细胞壁结构组分生物合成过程中的一个步骤，另一特征系存在一种编码该天然酶之功能替代物的一种酶的一级重组基因，其中该一级重组基因不能取代该缺陷性染色体基因。在这些细胞中，一级重组基因与编码所需产物的二级重组基因在结构上相连，失去一级重组基因将使该细胞发生溶解，这些方法已公开在世界专利Wo89/03427（1989，4月20日公开）中，上面所述的专利申请以及相应国家的专利申请公开的内容均作为参考而引入本文。
本发明部分是基于新的无毒伤寒沙门菌衍生物，这些衍生物未公开在欧洲专利公开No.315682中。除此之外，本发明包括这些新型伤寒沙门菌衍生物在商业疫苗中的运用，激发免疫***使之对伤寒沙门菌的致免疫抗原产生应答的方法以及激发该免疫***使之对一种病原体的致免疫抗原产生应答的方法。本申请所提供的菌株可以直接和间接地适用于制备商业疫苗以预防因伤寒沙门菌和其它肠细菌（它与伤寒沙门菌抗体交叉反应）而引起的疾病。这些菌株还可用作为载体微生物以制备在细菌细胞中于重组基因上编码的表达产物。
因此，本发明的一个具体方案是一种用于个体免疫的致免疫组合物，它包含在一种生理学上可接受的赋形剂中在cya基因中有一种突变的伤寒沙门菌（S.typhi）的无毒衍生物。
本发明的另一具体方案是在cya基因中有一种突变的伤寒沙门菌的一种分离无毒菌株。
本发明的另一具体方案是一种用于个体免疫的致免疫组合物，它包括在Crp基因中有一种突变的伤寒沙门菌的无毒衍生物。
本发明的另一具体方案是Crp基因中有一种突变的伤寒沙门菌的分离无毒菌株。
本发明的另一具体方案是一种用于个体免疫的致免疫组合物，它包括伤寒沙门菌的一种无毒衍生物。该衍生物在cya基因中有一种突变且在crp基因中有一种突变。
本发明的另一具体方案是伤寒沙门菌的一种分离无毒菌株，它在cya基因和crp基因中有一种突变。
本发明的另一具体方案是一种用于个体免疫的致免疫组合物，它包括cdt基因中有一种突变的沙门菌的无毒衍生物。
本发明的另一具体方案是cdt基因中有一种突变的沙门菌的分离无毒菌株。
本发明的另一具体方案是选自菌株X3958，X4323，X3926，X3927，X4297，X4346，X3940，X4073，及其衍生物的分离菌株。
本发明的另一具体方案是一种使用cya基因中有一种突变的无毒伤寒沙门菌的一种菌株的方法，该方法包括通过将菌株悬浮于一种生理学上可接受的赋形剂中制备一种致免疫组合物。
本发明的另一具体方案是一种使用crp基因中有一种突变的无毒伤寒沙门菌的一种菌株的方法，该方法包括通过该菌株悬浮于一种生理学上可接受的赋形剂中制备一种致免疫组合物。
本发明的另一具体方案是使用一种cdt基因中有一种突变的无毒沙门菌的一种菌株的方法，该方法包括通过将该菌株悬浮于一种生理学上可接受的赋形剂制备一种致免疫组合物。
本发明的另一具体方案是具有cdt突变体的伤寒沙门菌的分离菌株。
附图简述：
图1.A表示在口服接种9×108CFU X3622（Δ〔crp-cysG〕-10）、1×109CFU X3737（pSD 110+/Δ〔crp-cysG〕-10）和1×109CFU X3339（野生型）后的某些特定时间，从8周大的BALB/C小鼠的派伊尔（peyer）结中回收的CFU值。对于每一个时间点杀死三只小鼠，其结果用几何平均值±标准误差表示。
图1.B表示在口服接种9×108CFU X3622（Δ〔crp-cysG〕-10），1×109CFU X3737（pSD110+/Δ〔crp-cysG〕-10）和1×109CFU X3339（野生型）后的某些特定时间，从8周大的BALB/C雌性小鼠的脾中回收的CFU值。对于每一个时间点采用三只小鼠，其结果用几何平均值±标准误差表示。
图2是PYA1077的局部限制图，将取自λgt11克隆L14的1.0kb M.Leprae（麻疯杆菌）嵌入DNA片段亚克隆到pYA 292的EcoRⅠ位点中。在该M.leprae嵌入DNA中有一单个不对称的SalⅠ位点。对于下面的限制性核酸内切酶，则在该M.leprae嵌入DNA中没有位点：BamHⅠ.HindⅢ，PstⅠ和XbaⅠ。
图3是一个半程复制过程。它表示对由带有PYA1077和PYA1078的伤寒沙门菌，鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌制成的蛋白质的Western印迹分析。将在硝基纤维滤纸上的蛋白质与来自21名瘤型麻疯病人的混合血清进行反应。线1：分子大小标记物（尺寸表示在印迹的左边）;线2：由带有PYA292的伤寒沙门菌X4297特定的蛋白质;线3到5：由3种均含有PYA1078的独立伤寒沙门菌X4297分离物特定的蛋白质;线6到8：由3种含有PYA1077的单独分离的伤寒沙门菌X4297特定的蛋白质;线9：由带有PYA1077的鼠伤寒沙门菌X4072特定的蛋白质;线10：由带有PYA1075（一种含有1.0kb M.leprae DNA***物的pUC8-2衍生物，该DNA***物取自λgt11克隆L14，L14正如在PYA1077中一样相对LacZ启动子具相同取向）的大肠杆菌X6060特定的蛋白质。注意：由PYA1075特定的免疫学上的活性蛋白比由PYA1077特定的稍微大些，是因为它是一种带β半乳糖苷酶的α区域的融合蛋白。
图4是一种半程复制过程，它表示对由λgt11∷M.leprae克隆L14和带有PYA292，PYA1077和PYA1078的伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌菌株制备的蛋白质的Western印迹分析。
图5表示伤寒沙门菌Ty2和ISP1820的野生型和突变菌株在人体血清中在37℃下的生长情况。
实施本发明的方式
本发明是基于这么一个发现，即某些突变可以使微生物无毒且基本不影响其致免疫性。更进一步说，本发明涉及微生物疫苗，在该疫苗中该微生物携带缺失（开放三角或Δ）突变体Δcya和/或Δcrp，该突变Δcya和/或Δcrp分别除去了合成腺苷酸环化酶（ATP焦磷酸溶解酶（环化）EC4.6.1.1）和环AMP受体蛋白（CRP）的能力。
环-3′5′-AMP（cAMP）和环AMP受体蛋白是转录与大量降解物的输送及断裂有关的大量基因和操纵子所必需的。已经有证据证明用于输送燃料/碳源的***受到cAMP的正性控制，就象几种氨基酸透酶一样。除了其在分解代谢过程中的重要作用以外，细胞中的cAMP浓度也影响瞬间噬菌体的溶原化作用，菌毛的合成，鞭毛的合成以及至少一种外膜蛋白的合成。尽管cAMP存在于哺乳动物细胞中，但其在巨噬细胞和其他沙门菌可以侵入并繁殖的细胞中浓度低于0.1到1.0mM  cAMP，此为造成体外Δcya突变表现出野生型表型所需浓度。另外，该Δcrp突变的卷入将因这样的Δcya突变体而基本上消除了由于体外或体内摄入cAMP而可以自然增长的益处。
利用转座子将突变从其他沙门氏菌株中移入伤寒沙门氏菌中可以实现将突变引入伤寒沙门菌的cya和crp中。转座子可以在许多点加入到细菌染色体中，转座子的***及缺失的特点已由Kleckner等人（1977）在J.Mol.Biol.116：125中加以综述。举例来说，可以用具有四环素抗性（及对镰孢菌酸敏感）的转座子Tn10在多种细胞包括大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌中产生Δcya和Δcrp突变，欧洲专利公开No.315682中描述了在鼠伤寒沙门菌中产生和除去这些突变的方法，在下面的实施例中还要提供一种方法。利用Tn10可以将这些突变转移到各种伤寒沙门菌的分离物中，优选转移到那些具有高致病性的细菌中。在下面的实施例中将描述将Δcya和Δcrp突变由鼠伤寒沙门菌移入野生型伤寒沙门菌株中的实例。
一旦通过导入Δcya和或Δcrp突变而导致无毒之后，该微生物就可以用作为疫苗的致免疫组分以对该微生物诱发免疫性。
在本发明的另一实施方案中，优选通过缺失作用在主管沙门菌毒性的crp基因邻近基因中，可以使该具有cya突变和/或crp突变的伤寒沙门菌进一步突变，在该基因即cdt基因中的突变降低了该细菌有效移生深部组织的能力，如脾。当将具有crp+基因的质粒放入携带Δ（crp-cdt）的菌株中时，它仍保持无毒并具有致免疫性。从而具有类似cya和crp突变体的表型。携带质粒上含有crp+基因的Δ（crp-cdt）突变的突变体仍保持其正常的移生肠道及GALT的能力，但其移生更深部组织的能力则降低了。在这些实施例中，原始Δ（crp-cdt）突变（如在X3622中分离的）也失去了argD和cysG基因，这些基因需要精氨酸和半胱氨酸供其生长;这种突变等位基因已被命名为Δ（crp-cysG）-10。含有较短缺失的第二种突变体也被分离出来了。它未强加精氨酸需求;它存在于X3931中并被命名为Δ（crp-cysG）-14。在伤寒沙门菌中的cdt中的突变可以直接产生，也可以通过从鼠伤寒沙门菌菌株（例如在实施例中所述的）变换而引入。另外，利用本领域熟知的技术以及通过利用本文中所述的特点进行表型选择，还可以在其它的沙门菌菌株中产生cdt突变。此外，利用本领域内所熟知的转座子诱变技术，可以将Δcdt突变由这些实施例中所述的鼠伤寒沙门菌变换到其它沙门菌菌株中。
在本发明的另一实施方案中，可以将病原性伤寒沙门菌的无毒衍生物用作为载体细菌以便将选定的抗原传送到GALT中，例如传送到回肠的Peyer结中。已经知道沙门菌是位于Peyer结中（carter，P.B.和F.M.Collims.J.Exp.Med.139：1189（1974））。鼠伤寒沙门菌-大肠杆菌杂种也显示出能移生小鼠中的Peyer结（Hohmann，A.W.等人，Infect.and  immun.22：763，1978），如果这些载体细菌能含有并表达来自病原生物体重组基因，则将会诱导由该病原体产生的抗原基因产物的抗体。随着重组DNA技术的出现，获得完全独特的能产生特异抗原的疫苗现在已经成为可能，它不必通过病原学试剂，而是通过能表达该抗原基因的另一种细菌宿主菌株。当抗原可以和该哺乳动物宿主的抗原交叉反应且由此加强自免疫的诱发能力时，也可以采用重组DNA技术去改变该基因，从而使起作用的交叉反应抗原确定子不能形成。因此，重组DNA技术可用来制备这类疫苗：这些疫苗不含有任何能与脊椎动物宿主抗原交叉反应的物质或任何能激发自免疫状态的物质。
制备能用作为载体细菌的生物体，特别是沙门菌的方法在Wo89/03427（1989年4月20日公开）和美国专利申请系列No.07/251304（1988年10月3日提出）中讨论过，该美国专利申请已被共同拥有。这两篇参考文献作为参考而引入本文。通常，对沙门菌进行处理，使之在编码一种细胞存活所必需的酶的染色体基因中产生一种突变，其中所述的酶能催化生物合成基本细胞壁结构组分的过程中的一个步骤。将一种额外染色体遗传成分例如一种重组载体引入该突变细胞中，该遗传成分含有一级重组基因，该基因编码一种酶，该酶是该天然酶的一种功能取代物，但是该一级重组基因不能取代该有缺陷的染色体基因。这种一级重组基因与编码所需产物的二级重组基因在结构上相连，将在载体微生物中被表达。失去一级重组基因将会使该细胞在处于下述环境中时发生溶解：由于一级重组基因表达的产物不存在时。
编码细胞存活所必需的酶的许多基因（该酶能催化生物合成基本细胞壁结构组分的过程中的一个步骤），是本领域内所熟悉的，例如天冬氨酸半醛脱氢酶（Asd），它是由asd基因编码的。实施例中描述了一种利用转座子诱变将一种缺失突变引入伤寒沙门菌的asd基因中的方法。在这些实施例中还描述了一种遗传成分的构建过程，该遗传成分携带asd基因的功能取代物，与一种编码欲在无毒载体伤寒沙门菌中表达的抗原的基因相连。
很显然，在局部免疫具有重要意义且可能是第一道防线的地方，本发明可以广泛地用于开发对细菌、真菌、寄生虫或病毒致病剂的有效疫苗。有些实施例是用于控制下列病症的疫苗：由耶尔辛鼠疫（Yersinia  pestis）引起的肺鼠疫，由淋病奈琵菌（Neisseria  gonorrhoexe）引起的淋病，由梅素螺旋体（Treponema  pallidum）引起的梅毒，和性病以及由沙眼衣原体（Chlamydia  trachomalis）引起的眼睛感染。来自A组和B组的链球菌种，例如那些引起喉咙痛或心脏病的菌种，奈琵脑膜炎菌，肺炎支原菌，流感嗜血杆菌，百日咳杆菌，结核分支杆菌，麻风分支杆菌，Bordetella  avium，大肠杆菌，类马链球菌，肺炎双球菌，流产布鲁杆菌，溶血性巴士德菌，霍乱弧菌，志贺菌种和Legionella  pneumophila是另外一些属于本发明的范围可以获得基因的细菌例子，本发明还包括病毒疫苗，例如那些抗流感病毒的疫苗。可以生产抗其他病毒的疫苗，不管它是DNA病毒还是RNA病毒，举例来说，如那些来自乳多空病毒（papovirus）腺病毒，疱疹病毒，痘病毒，细小病毒，呼吸道肠道病毒，微小RNA病毒，粘液病毒，副粘液病毒，或逆转病毒这类病毒。本发明还包括用于对病原真菌，原虫和寄生虫感染具保护性的疫苗。
在进一步的实施方案中，当疫苗的致免疫组分是宿主的过敏原时，可以将这些疫苗用于专门使过敏宿主解除过敏的暴露过程中。
在其一种实施方案中，本发明被描述成一种用于脊椎动物或非脊椎动物免疫的疫苗，它包括一种活的病原微生物的无毒衍生物，该衍生物不能产生功能性腺苷酸环化酶和cAMP受体蛋白，但能表达来自一种生物体的重组基因，该生物体是所述动物的一种病原，或产生一种所述动物的过敏原。
在另一个实施方案中，本发明的无毒微生物可以用作为合成各种宿主蛋白的载体，由于本发明的无毒微生物在引入宿主后能横越多种免疫活性结构，包括GALT，肠系膜***和脾，故这种微生物可用来将多种免疫调节产物作为药靶。因此，可以将一种或多种编码免疫调整蛋白或肽的基因通过重组引入该无毒微生物中，从而当这些微生物停留在合适的免疫活性组织中时它们就能表达该重组产物，以抑制、增强或修饰宿主中的免疫应答。这种免疫调整分子的例子包括（但不限于）：菌落激发因子（巨噬细胞、粒细胞或混合物），巨噬细胞化学毒素、巨噬细胞抑制因子、白细胞抑制因子、淋巴毒素，母细胞化因子，干扰素以及内白细胞素。
本发明的另一实施方案是采用其中的无毒微生物去输送并制备药理学上活性的产物，该产物可以激发或抑制多种生理功能（即生长速度、血压等）。
在精心考虑所有上述特点后的一个实施例中，本发明的主题是伤寒沙门菌的无毒菌株，它在cya和/或crp基因中带有突变。
利用其它本领域内已知的技术也能实现在伤寒沙门菌（包括那些在cdt中还含有突变和/或在载体微生物中含有突变的菌株）中产生cya和/或crp突变。这些技术，例如包括标准诱变技术和/或利用重组DNA技术。然后根据表型特点选择所需的突变体，其中的一部分特点将在下文，在实施例中描述，并示于表8中。
在下面的讨论中将对本发明的这些实施例中的每条术语进行分析。
致免疫试剂是指一种用来激发活生物体的免疫***的试剂，由此使该免疫***的一种或多种功能获得提高并指向该致免疫试剂。致免疫试剂包括疫苗，利用本领域内已知的技术可以将致免疫试剂用于制备抗体，分离多克隆抗体和单克隆抗体均可。
所谓疫苗是指一种用来激发活生物体的免疫***，而对将要遇到的有害物提供保护的试剂。免疫是指诱发持续高水平抗体和/或细胞免疫应答的过程，在该过程中T-淋巴细胞可以杀死病原体和/或激发其他细胞（如巨噬细胞）在生物体中做此工作，该免疫反应是针对该有机体先前所暴露于其中的病原体或抗原的。尽管短语“免疫***”可以包括单细胞生物体对外源体存在（如产生干扰素）的应答，但在本申请中，该短语仅指多细胞生物体产生对抗原物质的抗体的解剖特征及机理，其中所述的抗原物质侵入该生物体的细胞或该生物体额外细胞流体中。由此产生的抗体可以属于任何一种免疫学类型，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M。尽管本发明的疫苗并不仅限于那些激发IgA生成的疫苗，但其中特别感兴趣的是那些激发免疫球蛋白A（IgA）生成的疫苗，这是因为免疫球蛋白A是由暖血动物的分泌***产生的主要免疫球蛋白。举例来说，除形成IgA之外，本文所述的天然疫苗还很可能产生宽范围的其他免疫应答，例如细胞和体液免疫。抗原的免疫反应已被人们深入研究并广泛报导了。Barrett.James.T.在Textbook  of  lmmunology（第四版，C.V.Mosby公司，St.Louis.Moo（1983））一书中对免疫学进行了综述，该书作为参考而引入本文。
脊椎动物可以是亚门脊椎动物（脊索门中的一个基本部分）中任何一种成员，包括鱼类、两栖类、爬行动物、鸟类以及哺乳动物，所有这些动物的特征在于具有成段的骨胳或软骨脊柱。所有脊椎动物具有功能免疫***并通过产生抗体而对抗原产生应答。因此，所有的脊椎动物均能对疫苗起反应。尽管疫苗通常大多是施用于哺乳动物，如人类或狗（狂犬疫苗）身上的，但用于商业上培养其他种类的脊椎动物如鱼类和鸟类（如果它们具有本文中所述的性能）疫苗也属于本发明的范围。
无脊椎动物可以是除脊椎动物外的动物界中任何一种成员。这类动物组成了无脊椎门（Division  lnvertebrata），不具备脊骨或脊柱。这类动物包括所有除鱼类、两栖类、爬行动物、鸟类及哺乳动物之外的动物。许多无脊椎动物对抗原刺激能诱发产生初级免疫应答，而且对感染脊椎动物且在本发明中所描述的相同微生物敏感。这类无脊椎动物的例子如牡蛎和软体动物以及其它相近的动物。尽管用疫苗保护无脊椎动物的技术至今尚未被人们广泛记载，但熟悉本领域的人员将会认识到通过利用无脊椎动物的初级免疫***也可以将本发明用到所述的无脊椎动物上。举例来说根据本发明，牡蛎对沙门菌感染的敏感性可以使我们向其引入沙门菌种的无毒菌株，从而使其初级免疫***具有应答的潜力。因此，使用能够感染无脊椎动物的致病微生物的无毒衍生物，从而从存在于所述无脊椎动物体内的免疫***激发对病原的应答，此用途亦属于本发明的范围。
用本发明的疫苗进行处理的“个体”在本文中定义为包括所有脊椎动物，如哺乳动物（包括家养动物和人类）、各种鸟（包括家养鸟），特别是那些对农业具有重要意义的动物。此外，软体动物以及其它一些无脊椎动物具有初级免疫***，它们也属于一种“个体”。
本发明的一个具体方案是采用与GALT或BALT相连、侵入并持续存在于该GALT或BALT中的病原微生物的无毒衍生物，作为基因产物的载体，该基因产物是用来对病原体或过敏原激发抗体应答的。无毒并不是说这类种微生物不能起一种病原体的作用，而是指所用的这种特殊微生物相对所处理的特殊动物来说是无毒的。该微生物可以属于一类或甚至一种其他通常是会致病的，但必须属于是一种无毒的菌株。而致病是指能引起疾病或损害正常的生理功能。无毒菌株不能产生一整套通常与其有毒病原同伴相关的疾病症状。本文所用的微生物包括细菌、原虫以及单细胞真菌。
用于将遗传物质从第一种生物体转移到通常不与第一种生物体交换遗传物质的第二种生物体中的技术，近来随着重组DNA技术的迅速发展而变得广泛可行。在本申请中，被从一种生物体转移到第二种生物体中（并且其转移方式要保证该第二种生物体的繁殖能产生含有相同遗传物质的后代）的遗传物质被认为是一种重组基因。术语“基因”在本文中使用最为广泛的意义是代表任何一种生物遗传单位。该重组基因不一定是象存在于母体生物体中的一种完整的基因，其能产生巨型分子（如一种功能多肽）或调节该巨型分子的产生，只需要该基因能起一种模板作用，作为抗原产物形成过程中的导物。该产物可以是一种在母体生物体中找不到精确形式的东西。举例来说，可以将一种编码含100氨基酸残基的多肽抗原的功能基因部分转移到一种载体微生物中，从而通过该宿主细胞的细胞作用产生一种只含75个、或者甚至10个氨基酸残基的肽。但是，如果说基因产物是一种抗原，该抗原能导致对存在于该母体生物体中的相似抗原的抗体的形成，那么就可以认为这种基因是在如本发明所定义的术语“基因”的范围内。另一方面，如果一种特定抗原的氨基酸顺序或其片段是已知的，则通过自动基因合成器或其类似装置就可以化学合成该DNA片段或其类似物，并且将所述的DNA顺序引入合适的表达载体中。在该系列的另一端是一长段编码几种基因产物的DNA，其中的一种或其全部可以是抗原的，这样此处定义和要求保护的基因即是能产生抗原的任何遗传单元，该基因可以是染色体、质粒或病毒源。
为了使该基因能有效地诱发免疫应答，就必须表达该基因。“表达一种基因”是指通过该基因所在的细胞的生化作用将该基因的结构的固有信息（DNA碱基的顺序）转化成一种物质产物，该产物可以是一种RNA分子、多肽或其它生物分子形式。由此产生的生物分子叫做基因产物。这里所用的术语“基因产物”是指通过在基因控制下进行的生化反应而产生的任何一种生物产物或多种产物。该基因产物例如可以是一种RNA分子，一种肽，或一种在酶或其它分子（该基因的起始产物、即一种代谢产物）的控制下产生的产物。举例来说，一种基因可以首先控制一种RNA分子的合成，该RNA分子通过核糖体的作用被转译成一种酶，这种酶在该原始细胞（该基因存在其中）之外的环境中控制聚糖的形成。RNA分子、酶以及聚糖均是这里所述的基因产物。如果引入动物的免疫***中，这些产物中的任何一种以及许多其它类型的基因产物，如糖蛋白和多糖将起抗原作用。蛋白基因产物，包括糖蛋白和脂蛋白是优选的用作为疫苗中的抗原的基因产物。
为了使疫苗能有效地产生抗体，该抗原物质必须以这样一种方式被释放，即接种过疫苗的动物的抗体产生机理能发挥作用。因此，必须将该基因产物的微生物载体引入该动物中。为了如前所述地激发优选的GALT或BALT细胞的应答，优选将该微生物或基因产物直接导入内脏或支气管中，例如可以通过口服、胃插管接种或以气溶胶形式。当然，也可以使用其它方法施用疫苗，例如静脉内、肌肉内、皮下注射或***内或***内或***内给药。
当将无毒微生物用作载体微生物并且一旦该载体微生物存在于动物中时，该动物的免疫***就需要能得到抗原，这一点可以在该载体微生物死亡时实现，此时抗原分子被释放出。当然也可能利用能释放胞质体且不发生溶解而“泄漏”无毒突变体。另外，也可以选择一种能控制抗原的生成过程的基因，该抗原可以在该细胞死亡之前在外部环境中由该载体细胞获得。以此方式，就可以使用一种活的微生物，该微生物将生存于接种过疫苗的动物中，例如在Peyer结中，并且可以持续地产生抗原，从而持续地诱发抗体形成。在这些环境下优选的基因产物是一种可以穿过细胞膜而进入外部环境的产物或是一种与该外膜相连或嵌入该外膜从而使该基因产物全部或部分向环境暴露的产物。后一类基因产物的典型代表是通常在需要保护的生物体的表面上发现的抗原。如果将这些抗原以正常方式传送到细胞表面上，则对该抗原的抗体形成将获得提高。
利用病原将来自其它病原的抗原输送到GALT或BALT中，如果此时不能使这类病原无毒同时保持其移生Peyer结或BALT的能力，那么将是不合适的。
衍生该重组基因的生物体可以是接种动物的任何一种病原体，或者是一种能产生该动物的一种过敏原或其它抗原的生物体。过敏原是指能在将要接种抗该过敏原的动物中引起过敏反应的物质。有许多种不同的物质是过敏源，例如动物毛发皮屑和花粉，对于任何一种特定的过敏源各个动物的过敏反应也将不同。在具有正常过敏应答的动物中可能诱发对过敏源的耐受性。诱发耐受性的方法已为人们熟知，它通常包括以递增剂量向动物施用该过敏原。有关耐受性诱发的进一步讨论在前面引用的Barrett  textbook中给出。最后，当由载体表达免疫调整基因或其它药理活性物质的基因时，宿主生物体本身可以起一种遗传物质源的作用。
可以利用任何已知的或标准方法将上面所述的活疫苗施用到动物上，这些方法包括口服消化、胃插管、或支气管一鼻一眼喷洒。所有这些方法均可以使该活疫苗很容易地到达GALT或BALT细胞，并且诱发抗体形成，它们是优选的给药方法。其它给药方法也是可行的，例如静脉内注射，它可以使该载体微生物到达动物血液。利用后面将要描述的本发明的其它实施方案，静脉内、肌肉内或***内注射也是可行的。
由于优选的给药方法是口服消化、气溶胶喷洒和胃插管，因此优选的载体微生物是那些能粘连到能侵入并存在于被接种动物的肠或支气管的任何一种淋巴上皮结构中的载体微生物品种。这些菌株中优选的是通过致肠病菌株进行遗传操作而产生的致肠病菌株的无毒衍生物。最优选的菌株是与Peyer结相连，侵入并存在于其中从而直接激发IgA生成的菌株。在动物中，这些菌株包括特定的沙门菌菌株和位于Peyer结中的沙门菌-大肠杆菌杂种。
现在，重组DNA技术已为人们充分了解并广泛传播，因此可以将它视为惯用技术。按照笼统的且广义的说法，这种方法包括将一种生物体的遗传物质（或者通常是部分遗传物质）输送到第二种生物体中从而使输送的遗传物质变成被输送生物体的遗传物质中的一部分。这种方法通常包括首先由母体生物体的质粒或母体染色体获得一小片DNA。质粒（也叫一种额外染色体成分）是一种遗传单元，它同细胞的染色体是物理上分离的。这种DNA可以是任意尺寸的，且通常是通过限制性内切酶的作用，在特定的碱基对位点处切断DNA分子而获得的。接着在与质粒、噬菌体或粘粒载体连接从而形成重组分子以后，就可以将该重组分子通过各种手段如转化（从外部环境中吸收裸体DNA，这种吸收可以通过各种化学试剂，如钙离子的存在而人为地诱发产生），包括电穿孔转移到一种宿主细胞中。也可以采用其它方法如转导法，此时该重组DNA是包裹在噬菌体，如转导噬菌体或粘粒载体中。一旦该重组DNA位于载体细胞中，它就可以以一种独立片断存在（通常是真正的完全传递的质粒），或者它可以嵌入宿主细胞染色体中，并在细胞***期间随该染色体而繁殖。
虽然遗传物质的转移是相当简单的，但要想预测何种转移会产生表达基因现在尚不可能，然而这种选择过程对本发明来说将不存在任何困难。由于宿主微生物必须表达该被转移的基因，并且由此产生一种抗原，故“鸟枪”方法可以很好地起作用。通过标准技术首先产生对所需抗原的抗体，例如从病原微生物获得细胞膜片段，利用核酸内切酶将来自作为抗原源的生物体的DNA切割成多个片段，并将该片段随机***到表达该病原体的抗原的载体微生物中，通过与对病原抗原的抗体反应可以很容易地被识别。可以将表达抗原微生物进行选择并克隆从而产生所需的重组生物体。鸟枪克隆是人们所熟悉的，其详细描述参见Maniatis，T.等人，Molecular  Cloning，Second  Edihion，Cold  Spring  Hardor  Laboratories（1989），该文献作为参考而引入本文。基因转移技术，不视为本发明的一部分，而任何可以产生重组生物体（该重组生物体含来自在无毒微生物中被表达的生物体的基因）的方法均可以满足要求。
假使该菌种可以正常地交换遗传信息，则可以使用更多传统方法进行基因转移，如结合、转化或转导。
无毒微生物的衍生物也应视为是在本发明的范围内。衍生物是指该无毒菌株经有性或无性衍生的子代及突变体，它们包括单个或多个碱基取代、缺失、***或转化，它们仍然不能产生功能腺苷酸环化酶和/或cAMP受体蛋白和/或cdt基因表达，而不管其是否携带了自然产生的有毒质粒。举例来说，菌株如4062和4064携带赋于萘啶酮酸抗性的gyrA突变，在本申请中在口服接种以后，该性质被用作一种很方便的标记来跟踪菌株通过动物体。因此可以通过转导作用将野生型gyrA-（对萘啶酮酸敏感）基因导入按紧密结合Tn10的遗传来挑选的菌株，并尔后利用在携带有gyrA-等位基因（具镰孢菌酸抗性选择性）的母体菌株上繁殖噬菌体溶解物进行转导而除去Tn10，由此很容易地除去gyrA突变。
所需剂量将随该基因产物的抗原性而变化，且仅要求足以诱发现有疫苗那样的典型免疫应答即可，通常常规试验就可以很容易地确定所需用量，可以采用多次剂量以产生所需的保护力。
悬浮或溶解疫苗的药物载体或赋形剂可以是任何一种溶剂或固体，也可以包裹在一种对接种动物无毒且与该载体生物体或抗原基因产物相容的材料中。合适的药物载体已为本领域熟知，例如它们包括液体载体，如标准盐水和其他浓度为生理浓度或接近生理浓度的无毒盐，以及固体载体，如滑石粉或蔗糖，并且还可以将它们导入农场动物的饲料中。如果需要，也可以加入助剂以提高抗原性。当通过支气管给药时，优选该疫苗以气溶胶形式存在。有关合适的药物载体及助剂以及剂形的制备的描述。例如可以参见Remington′s  Pharmace-ceutical  Science，第17版，（Gennaro，Ed.Mack  Publishing  Co.，Easton，Peunsylvania，1985）。
可以将由病原体产生的基因产物进行的免疫与先前的用作为载体（以表达由来自病原的重组基因特定的基因产物）的病原微生物的无毒衍生物进行的免疫相结合。一旦通过载体微生物（表达病原体衍生基因产物，以刺激GALT或BALT的淋巴样细胞）的免疫作用。病原体衍生基因衍生物对分泌免疫体系起动以后这种肠胃外的免疫可以起一种第二次激发以促进该分泌性免疫应答的表达。已经知道这种增强的反应是一种辅助性，二次激发或回忆性应答，并且它可以对宿主产生长期的免疫保护。可以将二次激发免疫重复若干次，其效果较好。
上述内容对本发明作了一般性描述，通过参考下列特定实施例可以获得对本发明更全面的了解，提供这些实施例的目的仅在于说明本发明而不是对其进行限制（除非另有说明）。
实施例1
该实施例描述了无毒微生物的分离过程（通过导入影响cAMP合成及使用的缺失突变）以及对赋于其表型稳定性，完全无毒及高致免疫性的突变的菌株的鉴别。
细菌菌株：
表1.A和B中列出了所用的大肠杆菌及鼠伤寒沙门菌，它们以冰冻培养液形式悬浮于含有5%甘油的1%Bacto-蛋白胨中保持，并在干冰-乙醇中快速冷冻以在-70℃下贮存复制，并且也将其悬浮于含有50%甘油的1%Bacto-蛋白胨中以在-20℃下贮存供常规使用。
培养基
用于常规培养的复合培养基是L液体培养基（Lonnox，Virology  1：190-206，1965）和Luria液体培养基（Luria和Burrous，J.Bacteriol.74：461-476，1957）将Difco琼脂加入到Luria液体培养基中，其基本琼脂为1.2%而软琼脂为0.65%，用Penassay琼脂对细菌进行常规计数，通过补充Mac  Conkey基本琼脂或Eosin亚甲基兰琼脂（Curtiss，Geretics  58：9-54，1968）且使某种合适的碳水化合物的最终浓度达到1%，由此对发酵过程进行评价。
合成培养基是最低限度的液体（ml）和最低限度的琼脂（MA），用以前所述的最佳水平的营养成分对这些介质进行补充（Curtiss，J.Bacteriol.89：28-40，1965）。将用明胶（BSG）缓冲的盐水（Curtiss，1965同上）常规用作为稀释剂。
转导：
常规地用噬菌体P22HTint进行转导，转导过程用标准方法进行（Davis等人，“Aman.for  Genet.Eng-Adv  Bacterial  Geretics”Cold  Spring  Harbor.Laboratory.Cold  Spring  Harbor.NY.1979）。将供体菌株培养过夜，然后将其按1∶20比例稀释入预热的Luria液体培养基中，在37℃下摇动生长60分钟，然后用0.01 P22HTint进行多次感染，将该感染混合物摇动过夜，约15小时，加入氯仿并在37℃下再摇动10分钟，并将悬浮液离心（Sorvall Rc5C，ss-34转子，7000转/分，10分钟）以除去细菌碎片。将含有噬菌体（Ca.1010/ml）的上清液在氯仿上在4℃下贮存，为选择转导Tn10***和Tn10诱发突变，使用浓度为12.5μg/ml的四环素。
镰孢菌酸的Tn10缺失选择：
采用Maloy和Nunn（J.Bacteriol.145：1110-1112，1981）所述的培养基及方法。将携带Tn10诱导突变的菌株在含有12.5mg四环素/ml的L液体培养基中在37℃下培养过夜，使其浓度大约为5×108CFU/ml。然后将该培养液稀释（1∶40）进预热的无四环素的L液体培养基中并将它在37℃下暴露于空气中使其滴度达到2×109CFU/ml。将用BSG稀释的适当数量的细胞（即107-108）铺在含有镰孢菌酸的介质上并在37℃下培养48小时，在相同的选择性介质上提纯抗镰孢菌酸的分离物。从中挑选出单个分离物，将其生长并将其在含有或不含有12.5μg四环素/ml的Penassay琼脂上测试四环素过敏性。
小鼠：
采用雌性BALB/c小鼠（6到8周大）（Sasco，Omaha.NS）进行感染和/或免疫实验，在实验前将该动物在隔离室中放一周。将实验小鼠放在有Nalgene滤片覆盖的笼子里，笼子配有金属丝地板。任意供给食物和水以12小时照明动物室保持在22-23℃。
动物感染性：
在口服（P.O.）或腹膜内（i.p.）接种后测定鼠伤寒沙门菌菌株的毒性。将用于接种小鼠的细菌在37℃下在L液体培养基中培养过夜。将这些培养液稀释（1∶50）进预热的L液体培养基中，在37℃下将它向空气中暴露约4小时使其OD600达到约0.8-1.0。通过在Sorvall Rc5C离心机中在GSA转子，4℃下以7000转/分离心10分钟将细胞浓缩50倍，随后悬浮于BSG中。将合适的稀释液铺于Penassay琼脂上以进行滴度测定，并在含有1%麦芽糖的MacConkey琼脂上验证其cya/crp表型。对于所有口服接种鼠伤寒沙门菌的小鼠，在感染前4小时内不喂食物及水。在用Pipetman P20口服喂入20μl悬浮于BSG中的鼠伤寒沙门菌之前10-15分钟，用Pipetman P200向它们喂30毫升10%（W/V）的碳酸氢钠。在口服接种后30分钟再给食物及水，在30天内观察小鼠的发病率及死亡率。用26-gauge 3/8″针头对未禁食的BALB/c小鼠进行腹膜内接种以输送100μl用BSG稀释的鼠伤寒沙门菌悬浮液。在30天内观察其发病率及死亡率。
保护性免疫的评价：
在最初的实验中，对于在感染鼠伤寒沙门菌突变菌株后存活30天的任何小鼠，在第31天通过口服103-104倍于LD50剂量的野生型小鼠毒性鼠伤寒沙门菌母体菌株进行攻击。随后，以各种剂量的毒性突变体对各组小鼠口服免疫，然后在最初免疫后的不同时间用各种剂量的毒性野生型母体细胞对其进行攻击。在整个实验过程中以及在用野生型母体进行攻击后至少30天内观察其发病率及死亡率。
分离含有Δcya-12和Δcrp-11突变的鼠伤寒沙门菌菌株：
利用类似Curtiss和Kelly（1987）所述的经典遗传学方法，正如下文所述对野生型，连续传带型小鼠的毒性鼠伤寒沙门菌SL1344菌株X3339进行遗传修饰。该方法由下列步骤组成：将来自pp1037的原crp-773∷Tn10突变和来自pp1002的原cya∷Tn10突变转导到高毒性和侵入性鼠伤寒沙门菌SL1344菌株X3339中，并从大量独立的抗镰孢菌酸的、四环素过敏缺失的突变体中筛选出在小鼠中完全无毒且致免疫性最高以及表型稳定性最大的突变体。
通过首先在含有crp-773∷Tn10突变的鼠伤寒沙门菌菌株pp1037上制成一种高滴度噬菌体P22H Tint溶解物以及在含有cya∷Tn10突变的鼠伤寒沙门菌菌株pp1002上制成另一种溶解物，可以实现将crp基因和cya基因中的Tn10嵌入物转导。然后用所产生的P22H Tint溶解物感染受体鼠伤寒沙门菌X3339（0.3感染复制率），从而将它转导成四环素抗性（筛选出麦芽糖阴性表型）。在将100μl试样铺开在含有1%麦芽糖（终浓度）（用12.5μg四环素/ml补充）的MacConkey琼脂（Difco Laboratories，Detroit，MI）上之前，将该噬菌体-细菌感染混合物在37℃下培养20分钟。铺上后在37℃下培养约26小时之后，将其中的抗四环素的由P22H Tint（pp1037）→X3339感染产生的麦芽糖阴性菌落和抗四环素的由P22H Tint（pp1002）→X3339感染产生的麦芽糖阴性菌落挑选到0.5ml BSG中，并在相同的选择培养基上划线。将产生的X3339衍生物命名为X3604（cya∷Tn10）和X3605（crp-773∷Tn10）（表1.A.）。
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在L液体培养基+12.5μg四环素/ml中培养菌株X3604和X3605，取各菌株样品100μl，用含明胶的缓冲盐水（BSG）以1∶10比例进行稀释，再铺在10块含镰孢菌酸（FA）培养基的平板上（Maloy and Nunn，1981）。该平板在37℃保温约36小时，从各板中收集5个镰孢菌酸抗性菌落放入0.5ml BSG中，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的镰孢菌酸抗性菌落收集到L液体培养基中，在37℃进行培养至混浊，检验Tn10（四环素敏感性）缺失。从FA培养基中的10只板中的每一板中选出一种四环素敏感衍生物，鉴定如下性能：完全LPS（通过P22HTint敏感性）、营养缺陷型或原养型、基因缺失稳定性和回复四环素抗性。本方法结果得到10个独立的由X3604中分离的Δcya突变体和10个独立的由X3605中分离的Δcrp突变体。
无毒突变体的遗传稳定性
作活疫苗口服用的菌株，其有关的无毒性和免疫属性必须十分稳定。当10个独立Δcya突变体的每个和10个独立Δcrp突变体的每个的浓缩50倍的培养物和各种稀释液（～109、107、105、103CFU/每板）铺在含0.5%麦芽糖、蜜二糖、木糖、甘油，或鼠李糖的基本（minimal）琼脂培养基（添加22μg半胱氨酸/ml和22μg精氨酸/ml）上（不助其生长），检测不到回复突变等位基因和突变体。将一组复制皿用紫外线辅照（5焦耳/米2/秒），并在暗处在37℃下保温。另一组皿在光照下在37℃保温。生长48小时后来检测到回复突变等位基因和突变体。还进行试验以确定从镰孢菌酸抗性Δcya和Δcrp突变体中是否可以以较之四环素敏感性野生型母体菌株所能观察到的较高频率回复四环素抗性回收突变等位基因/突变体。但在所有情况下，均未测到这种四环素抗性回复突变等位基因突变体。
Δcrp和Δcya突变体的毒性和免疫原性
将得到的10个Δcrp和10个Δcya突变体经口服接种在BALB/c小鼠中进行筛选，以测定最低毒性和疾病症状（根据皮毛（零乱或者光滑）、食欲情况和活动状况（强或弱））。每组5个小鼠（口服）接种～109CFU各独立cya或crp缺失突变体。动物均按上述标准计分，试验30天时，用108CFU野生型毒性亲代菌株X3339攻击存活者，20组中的三组用cya或crp缺失突变体感染，最初被Δcya-12、Δcrp-11和Δcrp-10突变体感染的5个小鼠存活，且对104LD50野生型攻击也能完全保护。尤其是Δcrp-10突变体这一组在无毒性，免疫原性和稳定性方面是不相同的。重复这些试验后，任何给定剂量口服接种（P.O）或腹膜内接种（i.p）Δcrp-10突变体对小鼠均无影响（见实施例3表6）。
所选突变体菌株的性质
分别鉴定具有Δcya-12、Δcrp-10和Δcrp-11突变的X3615、X3622和X3623菌株是最低毒性、高免疫性和最稳定的表型性和遗传性。这些菌株的表型性质数据列于表2中。分别与具有cya∷Tn10和crp-773∷Tn10突变的X3604和X3605菌株和毒性野生型亲代X3339菌株相比这些菌株的无毒性和免疫原性的数据如表3所示。除了需要组氨酸（由于在亲代X3339中的hisG突变）外，Δcrp-10突变影响X3622对氨基酸、精氨酸和半胱氨酸的需要。基于该观测结果，实施例3给出了Δcrp-10突变性质的进一步分析结果。
Figure 911118764_IMG20
Figure 911118764_IMG21
实施例2
本实施例叙述通过引入影响cAMP合成和利用的缺失突变的无毒生物体的构建及具有二个缺失突变菌株的表型稳定性、完全无毒性和高免疫原性的鉴定。
细菌菌株：所用的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌菌株列于表1A和B中。这些菌株的保存和贮藏如实施例1所述。
培养基：细菌的常规培养、计数和鉴定所用的复合培养基如实施例1所述。
转导和镰孢菌酸Tn10缺失选择：所用培养基和方法如实施例1所述。
动物传染性和保护免疫性的测定：鼠伤寒沙门氏菌菌株的毒性和免疫原性的测定如实施例1所述。
具有Δcya-12和Δcrp-11缺失突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株的构建：最好的疫苗菌株就其效能来说类似于显示明显移生能力和侵袭力的高毒性菌株的减毒获得的结果。选择这些高致病鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株如：SL1344（X3339），UK-1（X3761）和798的标准，包括在鼠毒性鉴定中的低LD50值（见表4），抗生素敏感性、毒性质粒的拥有，容易遗传操作（噬菌体P22HTint或P1的敏感性，转化能力和容易接收移动质粒）和大肠杆菌素敏感性。
用类似Curtiss和Kelly（1987）所述的经典遗传方法进行野生型、毒性鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344（X3339）、798和UK-1（X3761）的遗传修饰如下所述。该方法包括移动crp和cya基因的缺失，该基因已被分离并已鉴定特征（在鼠伤寒沙门氏菌SL1344（如实施例1所述）中），将转座子Tn10（编码四环素抗性）放在Δcya-12或Δcrp-11突变附近，通过P22HTint中介转导将连接特性转导入高毒性鼠伤寒沙门氏菌菌株UK-1X3761、798和SL1344X3339并选择四环素抗性和筛选麦芽糖-负表型。将连接Δcrp-11的zhc-1431∷Tn10和连接Δcya-12的zid-62∷Tn10用于该目的。没有一种***独自影响鼠伤寒沙门氏菌的毒性。
在含Δcrp-11和zhc-1431∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3773首先制得一高滴度噬菌体P22H Tint溶菌产物，并在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3711中制成另一种溶菌产物以促进具有连接转座子的基因缺失的转导。然后用得到的P22HTint溶菌产物将遗传特性转导入野生型受体菌株X3339、798和X3761中。
在鼠伤寒沙门氏菌X3773（Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10）中繁殖的P22HTint被使用于转导毒性菌株为筛选出具Mal-的四环素抗性。将噬菌感染混合物在37℃保温20分钟，然后将100μl样品涂布在MacConkey琼脂（Difco Laboratories，Detroit，MI）上，该琼脂含有1%麦芽糖（最终浓度），添加12.5μg四环素/ml。在37℃保温约26小时后，收集四环素抗性Mal-转导体，在同样的培养基中进行纯化。得到的798衍生物用X3825表示，UK-1衍生物用X3828表示。菌株X3773X3825和X3828具有基因型Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10（表1.B.）。在L液体培养基+12.5μg四环素/ml中培养这些菌株，用含明胶的缓冲盐水（BSG）以1∶10比例对各培养物进行稀释，将各菌株培养物100μl涂布在含镰孢菌酸（FA）的培养基（Maloy和Nunn，1981）的平板上，将该板在37℃下保温约36小时。将各菌株的镰孢菌酸抗性菌落收集在0.5ml BSG中，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的镰孢菌酸抗性菌落收集在L液体培养基中，在37℃下培养至出现混浊，检测Tn10（四环素敏感性）的损失，完全LPS的存在和营养缺陷。这些新的菌株用X3876（798）和X3954（UK-1）〔二者均具有基因型Δcrp-11 Δ（zhc-1431∷Tn10）〕和X3623（SL1344Δcrp-11是最初分离的，如实施例1所述）表示（见表1.B.）
由于cya-和crp-突变体的表型是相同的（Mal-、Stl-、Mtl-等），携带经克隆的crp+基因并具有氨苄青霉素抗性的质粒pSD110（Schroeder和Dobrogosz.J.Bacteriol 167：616-622（1986））被暂时用于补充染色体中的Δcrp突变，当通过转导引入时，能鉴定Δcya突变。用在鼠伤寒沙门氏菌X3670中繁殖的P22HTint转导X3623、X3876和X3954的L液体培养基生长的培养物，它含有质粒pSD110（表1.B.）。在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml中进行选择。26小时后，收集各菌株的氨苄青霉素抗性，Mal+菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖琼脂+100μg氨苄青霉素/ml中进行纯化，用X3938（798）和X3961（UK-1）（二者均具有基因型Δcrp-11Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+）及X3774（SL1344）（它具有基因型Δcrp-11 pSD110+）表示。
在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml中培养菌株X3774、X3938和X3961，用在X3711中繁殖的P22HTint各自独立地转导菌株以引入连接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突变。将该转导混合物涂布在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml的平板上。收集氨苄青霉素抗性（pSD110+）、四环素抗性（zid-62∷Tn10），Mal-（Δcya）菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中进行纯化。将已纯化的菌落收集在L液体培养基中，培养以至混浊，检验该菌株的完全LPS和营养缺陷。得到的菌株用X3978（798）和X3962（UK-1）（二者均具有基因型Δcrp-11Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10）及X3936（SL1344）（它具有基因型Δcrp-11 pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10）表示。在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中培养X3936、X3978和X3962的培养物至混浊，以1∶10比例用BSG稀释，将100μl各培养物样品涂布在含镰孢菌酸的培养基中，在37℃下保温约36小时。收集各菌株的镰孢菌酸抗性菌落，在FA培养基中进行纯化。将经纯化的FA抗性菌落收集到L液体培养基中，培养以至混浊，然后检验Tn10（四环素敏感性）损失，完全LPS和营养缺陷。在该工序中pSD110质粒通常从该菌株中自然消失以导致氨苄青霉素敏感性，只是SL1344的衍生例外，它包括二步以除去pSD110。最后的这些菌株称为X4039（798）和X3985（UK-1）（二者均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕和X3939（SL1344）（它具有基因型Δcrp-11 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕（表1.B.）。
无毒突变体的遗传型和表型稳定性
测定遗传特性稳定性的方法如实施例1所述。由于Δcya  Δcrp突变，所有遗传型和表型特性是十分稳定的（除能动性外）。虽然功能性鞭毛的合成和能动性的出现取决于野生型cya和crp基因功能，但容易挑选在cfs（基本的鞭毛合成物）基因中的抑制基因突变以导致鞭毛合成和能动性与Cya和crp基因功能无关。在鼠伤寒沙门氏菌Δcya  Δcrp菌株中，在菌株构建过程中，可方便地选择能动变异体。因为对鞭毛抗原的免疫，可以是保护性的，从而可选择所有疫苗菌株的能动变异体。
用借助Luria软琼脂涂覆技术的p22H  Tint噬菌体敏感性并通过用抗血清CDifco  Laboratories，Detroit，MI）的载片凝集法可证实鼠伤寒沙门氏菌族BO-抗原的合成。
糖的发酵和在各种双突变体菌株的碳原中生长与表2所示只含Δcya或Δcrp的菌株相同。根据公开报道的有关对分解代谢活性的环状AMP和环状AMP受体蛋白质的需求其表型正如所预料的。
在构建下列镰孢菌酸抗性四环素敏感，衍生物的选择的各步中、经研究，确定能否以较之亲代四环素敏感性野生型菌株被处理所能观察到的更高频率回收四环素抗性回复突变等位基因/突变体。在所有情况下，未观察到这种四环素抗性回复突变等位基因/突变体。
突变体菌株对小鼠的毒性
口服108突变体细胞使每个小鼠感染，记录发病率和死亡率，从而可得到鼠伤寒沙门氏菌突变体菌株毒性的初步信息。口服鼠伤寒沙门氏菌野生型亲代菌株，和Δcya-12 Δcrp-11衍生物X3985和X4039而感染的小鼠的发病率和死亡率数据如表4所示。
Figure 911118764_IMG22
用无毒突变体免疫接种的效力
表5所示数据说明用104倍LD50剂量的全毒性野生型鼠伤寒沙门氏菌细胞口服攻击后，由鼠伤寒沙门氏菌Δcya Δcrp突变体X3985和X4039诱导的免疫能力。在这些高剂量攻击情况下，许多小鼠出现中度病状如食欲减退，而用X4039免疫的小鼠仍很健康，能正常进食和生长。
Figure 911118764_IMG23
实施例3
本实施例说明具有包含crp基因和相邻基因（它们也能控制沙门氏菌的毒性）的缺失突变的无毒生物的分离。
细菌菌株：所用的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌菌株列于表1A和B中。这些菌株的保存和贮藏如实例1所述。
培养基：细菌的常规培养、计数和鉴定所用的复合培养基如实例1所述。
转导和镰孢菌酸缺失Tn10选择：所用培养基和方法如实例1所述。
动物传染性和保护免疫性的测定：鼠伤寒沙门氏菌菌株的毒性和免疫原性的测定如实例1所述。
具有Δcrp-10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株的分离：如实例1所述，使在X3605中分离的10个Δcrp突变之一个具有精氨酸（由于argD缺失）和半胱氨酸（由于cysG缺失）营养缺陷。在鼠伤寒沙门氏菌SL1344菌株X3622中的突变原来称为Δcrp-10，而现在由于半胱氨酸营养缺陷而称为Δ〔crp-cysG〕-10。口服109X3622细胞而感染的5组BALB/c小鼠中有一组仍然是健康的。且完全不受影响（表3）。而且这些小鼠对口服108亲代X3339细胞攻击获得高水平免疫性（表3）。
构建一组菌株以分别测定X3622的各种表型。用载带克隆的crp＊基因并具有氨苄青霉素抗性的质粒pSD110〔Schroeder and Dobrogosz，J.Bacteriol.167：616-622（1986）〕补充染色体中Δcrp突变。用含有质粒pSD110的在鼠伤寒沙门氏菌X3670中繁殖的P22HTint转导X3622的L液体培养基培养物。在MacConKey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml中进行选择。26小时后，收集氨苄青霉素抗性、Mal+菌落并在MacConKey琼脂+1%麦芽糖琼脂+100μg氨苄青霉素/ml中进行纯化，称其为X3706。使小鼠口服X3706，再从脾脏中分离。动物继续传代型的菌株称为X3737。另外2个crp突变体，X3605（crp-773∷Tn10）和X3623（Δcrp-11）（不具有Arg-或cys-营养缺失性能）也通过用PSD110质粒转导被补充，分别称为X3731和X3774。构建分别载带cysG和arg突变的鼠伤寒沙门氏菌，并称之为X3910（cysG∷Tn10）、X4063和X4071（arg∷Tn10）。
选择其它两个高致病鼠伤寒沙门氏菌菌株，通过引入Δcrp-10突变而使其减毒。X3761（UK-1）和798是分别从半死状态的马和猪中分离的有毒、侵害性菌株，在小鼠中的LD50约为1×105CFU。先在鼠伤寒沙门氏菌菌株X3712中制成高滴度噬菌体P22HTint溶菌产物可方便进行以连接转座子zhc-1431∷Tn10的Δcrp-10转导（参见表1.B）。然后用该噬菌体溶菌产物将遗传性能转导入野生型受体菌株X3761和798。选择四环素抗性菌落，筛选出Mal-、Arg-和Cys-表型，得到的798衍生物称为X4246，而X3761（UK-1）衍生物称为X4248（表1）。
将载带crp+野生型等位基因的质粒pSD110引入X4246和X4248中以补充crp突变。用含有质粒pSD110，在鼠伤寒沙门氏菌X3670中繁殖的P22HTint转导X4246和X4248的L液体培养基生长培养物（表1）。在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中进行选择。26小时后，收集各菌株的氨苄青霉抗性，Mal+菌落，在相同的培养基中进行纯化，称为X4247（798）和X4262（UK-1），二者均具有基因型pSD110+/Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10。
鼠伤寒沙门氏菌X3622、X3731、X3737、X3774、X3910、X4063和X4071的毒性。表6所示数据说明口服鼠伤寒沙门氏菌菌株X3622、X3731、X3737、X3774、X3910、X4063和X4071而感染的小鼠的发病率和死亡率。菌株X3737对已接受104倍LD50剂量的野生型X3339亲代菌株的小鼠是完全无毒的。观测30天过程中小鼠从未出现病态。作为本实例的比较试验，以pSD110补足在X3605中的crp-773∷Tn10突变成野生型crp+表型（X3731），小鼠被感染并死亡。用X3731和X3774（pSD110+/crp-11）口服接种约1×105CFU剂量可杀死五只中的四只小鼠。为分别测定具有Cys-和Arg-表型菌株的毒性，使BALB/c小鼠口服菌株X3910（cysG∷Tn10）、X4063（arg∷Tn10）和X4071（arg∷Tn10）。当口服X3910、X4063和X4071相同或较少剂量时就能杀死小鼠。因此，有关Δ〔crp-cysG〕-10突变的无毒性不完全是由于缺失crp基因，而且缺失argD或cysG loci也不会使其具有无毒性。相反，对鼠伤寒沙门氏菌毒性来说另一个必不可少的基因必须位于crp基因附近的染色体区内。
Figure 911118764_IMG24
用X3622、X3737、X4247和X4262免疫接种的效力：用104倍LD50剂量的全毒性的野生型鼠伤寒沙门氏菌细胞p.o或i.p攻击后由X3622、X3737、X4247和X4262诱导的免疫性能数据列于表7中。在试验30天期间，接受过量剂量野生型亲代菌株的所有小鼠始终未出现病症。因此，Δ〔crp-cysG〕-10突变至少缺失二个基因，这二个基因使鼠伤寒沙门氏菌完全无毒且高度致免疫。
具有Δcrp-14突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株的分离
由于crp-773∷Tn10的不精确删除过程会导致从argD至cysG的基因缺失，可制定另一种对策以在邻近crp的区中确定具有无毒性的基因位置。在含镰孢菌酸的培养基中选择20个X3910（cysG∷Tn10）的独立缺失突变体，并筛选四环素敏感性和麦芽糖-负表型。X3910的20个镰孢菌酸抗性衍生物中一个有Δ〔crp-cysG〕-14基因型，具有组氨酸和半胱氨酸营养缺陷，但无精氨酸营养缺陷。用在X3670中生长的p22HTint溶菌产物转导称为X3931的这种菌株以引入载带野生型crp+基因的psD110。收集氨苄青霉素抗性、麦芽糖-正转导体，在相同的培养基中进行纯化，得到的菌株称为X3955。
鼠伤寒沙门氏菌psD110+/Δ〔crp-cysG〕-14×X3955的毒性：表7说明口服鼠伤寒沙门氏菌X3955而感染的小鼠的发病率和死亡率。对于接受约109CFU的小鼠，菌株X3955是完全无毒的。在整个30天期间小鼠从未出现病态。
用X3955免疫接种的效力：表7说明用104倍LD50剂量的全毒的野生型鼠伤寒沙门氏菌细胞口服攻击后由X3955诱导的免疫能力。在试验30天期间得到过量剂量亲代菌株的小鼠从未出现病态。
X3622（Δ〔crp-cysG〕-10）和X3737（pSD110+Δ〔crp-cysG〕-10）的肠胃、GALT和脾脏的移生：培养和制备相对于野生型菌株X3339，鼠伤寒沙门氏菌X3622和X3737，用以口服接种生长8周的雌性DALB/C小鼠（如实例1所述）。用9.4×108CFU（X3622）、1.2×109CFU（X3737）或1.1×109CFU（X3339）口服接种后1 3，5和7天杀死动物。每组任意选择3只小鼠，euthanized和收集组织样品。从每个鼠中取出脾脏、Peyer结、10-cm后段的回肠和少量肠内含物放入含BSG的聚丙烯管中，用Brinkmann组织均浆器使其混合均匀，并放在冰中。将未稀释或已稀释的样品（100μl）直接涂有在MacConkey琼脂+1%乳糖+50μg链霉素/ml（X3339和X3337）以及MacConkey琼脂+1%麦芽糖+50μg链霉素/ml（X3622）上，将该平板在37℃下保温26小时。每隔一段时间测定透视组知中的滴度，每次取样以每组中取3个小鼠来计算几何平均值。
该分析结果如图1所示。显然在X3622中的额外减毒突变（在crp+（pSD110+）衍生物X3737中更明显）将大大减弱有效地移生至深层组织的能力。因此由Δ〔crp-cysG〕-10突变缺失的起重要作用的基因称为cdt。由不存在任何脾大的情况这一事实，X3622和X3737的cdt-表型也得到证实，而用具有Δcrp-11突变的鼠伤寒沙门菌X3623或用具有Δcrp和Δcya结合突变的其他各种菌株（curtiss和Kelly，1987）对鼠口服接种后这种脾肿大可以观察到。菌株X3737比X3622生长更快。在X3622中的额外减毒突变不像crp突变那样降低其生长速率。
根据赋予表型的缺失突变的分离和分析结果，在鼠伤寒沙门菌染色体中基因的顺序可推断为argD、crp、cdt、cysG。
显然，当包括有Δ〔crp-cvsG〕-10或Δ〔crp-cysG〕-14突变（它也是Δcdt突变时将增加活的减毒的沙门氏菌疫苗菌株的安全性，而不会降低其免疫原性。这对下列品种特别重要。即宿主适应的侵害性沙门氏菌菌种如，伤寒沙门氏菌（s.typhi），甲型副伤寒沙门氏苗（s.paratyphi  A〕（薛氏沙门氏菌S.Schottmuelleri），乙型副伤寒沙门氏菌（希氏沙门氏菌）〔S.paratyphi  B（s.hirshfeldii〕，丙型副伤寒沙门氏菌C（所有使人感染）（S.paratyphi  C），猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）（使猪感染），都柏林沙门氏菌（S.dublin）（使牛感染），鸡沙门氏菌（S.gallinarum）和雏沙门氏菌（S.pullorum）（二者均使鸡鸭感染），以及非宿主特异的侵害性沙门氏菌（Salmonella）菌种，如鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）和肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）。
实施例4
本实施例叙述通过引入缺失突变（该突变影响cAMP合成和利用）和一个相邻基因（该基因也通过影响深部组织移生性而控制沙门氏菌毒性）来构建无毒生物体，以及鉴定带两个缺失突变的菌株的表型稳定性，完全无毒性及高致免疫原性。
细菌菌株：所用的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌菌株列于表1A和B中，这些菌株的保存贮藏如实例1所述。
培养基：用于细菌常规培养、计数、和鉴定的复合培养基如实例1所述。
转导和镰孢菌酸Tn10缺失的选择：所述培养基和方法如实例1所述。
具有Δcya-12和Δ〔crp-cysG〕-10缺失突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株的构建：最好的疫苗菌株就其效能来说类似于显示明显移生能力和侵袭力的高毒性菌株的减毒结果。选择这些高致病鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株如，SL1344（X3339），UK-1（X3761）和798的标准已在实例2中叙述。
用类似Curtiss和Kelly（1987）所述的经典遗传方法，按如下所述进行野生型、毒性鼠伤寒沙门氏菌菌株SL1344、798和UK-1的遗传修饰。该方法由下述步骤组成：移动已分离出并鉴明特性（在鼠伤寒沙门氏菌SL1344（如例1所述）中）放入转座子Tn10（编码四环素抗性）于靠近Δcya-12或Δ〔crp-cysG〕-10突变处）的crp和cya基因的缺失和通过P22H Tint介导的转导作用将连接特性转导入高毒性鼠伤寒沙门氏菌株UK-1X3761、798和SL1344X3339中同时挑选出四环素抗性及筛选麦芽糖阴性表型。将连接Δ〔crp-cysG〕-10的zhc-1431∷Tn10和连接Δcya-12的zid-62∷Tn10用于该目的。没有***单独影响鼠伤寒沙门氏菌的毒性。
先在含Δ〔crp-cysG〕-10和zhc-1431∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3712中制成高滴度噬菌体P22H Tint溶菌产物，并在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3711中生成另一种溶菌产物便很方便进行具有连接转座子的基因缺失的转导。然后用所得到的P22H Tint溶菌产物将遗传特性转导入野生型受体菌株X3339、798和X3761。
用在鼠伤寒沙门氏菌X3712（Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10）中繁殖的P22H Tint使毒性菌株转导成四环素抗性并筛选出Mal-。将噬菌感染混合物在37℃下保温20分钟，然后将100μl样品涂布在MacConkey琼脂（Difco，Laboratories，Detroit，MI）上，该琼脂含有1%麦芽糖（最终浓度），添加12.5μg四环素/ml。在37℃保温约26小时后，收集四环素抗性Mal-转导物，在相同的培养基中进行纯化。得到的798衍生物称为X3777，UK-1衍生物称为X3779。菌株X3712、X3777和X3779均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10（表1.B.）。在L液体培养基+12.5μg四环素/ml中培养X3777和X3779，用含明胶的缓冲盐水（BSG）以1∶10比例对各菌株进行稀释，将100μl各菌株涂布在含镰孢菌酸（FA）的培养基（Maloy和Nunn，1981）平板上，将该平板在37℃下保温约36小时。收集各菌株的镰孢菌酸抗性菌落放入0.5ml BSG中，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的镰孢菌酸抗性菌落收集在L液体培养基中，在37℃下培养至出现混浊，检测Tn10（四环素敏感性）的缺失，完全LPS的存在和营养缺陷。这新菌株称为X3784（UK-1）和X3806（798）（二者均具有基因型Δ〔crp-cysG-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕）。X3622〔（SL1344Δ〔crp-cysG〕-10）。最初分离的，如实例1所述（表1.B）。
由于cya-和crp-突变体的表型是相同的（Mal-、Stl-、Mtl-等），可用载带克隆的crp+基因并具有氨苄青霉素抗性的质粒pSD110（schroeder and Dobrogosz，J.Bacteriol 167：616-622（1986）暂时补充染色体中的Δcrp突变，当通过转导引入时，能鉴别Δcya突变。用在鼠伤寒沙门氏菌X3670中繁殖的P22H Tint转导X3622、X3784和X3806的L液体培养基生长培养物，它含有质粒pSD110（表1）。在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml中进行选择。26小时后，收集各菌株的氨苄青霉素抗性，Mal+菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖琼脂+100μg氨苄青霉素/ml中进行纯化，称为X3901（798）和X3945（UK-1）（二者均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+）及X3706（SL1344），它具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10pSD110+。
在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml中培养菌株X3706、X3901和X3945，用在X3711中繁殖的P22H Tint分别转导各菌株以引入连接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突变。将该转导混合物涂布在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml的平板。收集氨苄青霉素抗性（pSD110+）、四环素抗性（zid-62∷Tn10，Mal-（Δcya）菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中进行纯化。将已纯化的菌落收集在L液体培养基中进行培养至出现混浊，检测这些菌株的完全LPS和营养缺陷。得到的菌株称为X3902（798）和X3956（UK-1），二者均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10，及X3722（SL1344），它具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10。在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中培养X3722、X3902和X3956的培养物至出现混浊，以1∶10比例用BSG进行稀释。将100μl各培养物样品涂布在含镰孢菌酸的培养基中，在37℃下保温约36小时，收集各菌株的镰孢菌酸抗性菌落，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的FA-抗性菌落收集到L液体培养基中，进行培养至出现混浊，然后检测Tn10（四环素敏感性）的缺失，完全LPS和营养缺陷。在该过程中pSD110质粒通常从该菌株中自然消失，以导致氨苄青霉素敏感性，只是SL1344和UK-1的衍生包括二步以除去pSD110。最后的菌株称为X3958（UK-1）和X4038（798），二者均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕及X3724（SL1344），它具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕（表1.B）。
无毒突变体的遗传型和表型稳定性：测定遗传特性稳定性的方法如实施例1所述。由于Δcya  Δcrp突变，所有遗传型和表型特性是十分稳定的，除能动性外。虽然功能性鞭毛的合成和能动性的表现取决于野生型cya和crp基因功能，但容易选择在cfs（构建鞭毛合成）基因中的抑制基因突变，以使鞭毛合成和能动性与cya和crp基因功能无关。在鼠伤寒沙门氏菌Δcya  Δcrp菌株中，在该菌株构建过程中容易选择能动变异体。由于对鞭毛抗原的免疫是保护性的，所以可选择所有疫苗菌株的能动变异体。
用Luria软琼脂涂覆技术，利用P22H  Tint噬菌体敏感性，以抗血清（Difco  Laboratorits，Detroit，MI）的载片凝集法可证实鼠伤寒沙门氏菌族BO-抗原的合成。
糖的发酵和在双突变体菌株的各种碳源中生长与只含Δcya或Δcrp的菌株相同，如表2所示。根据对如有分解代谢活性的环状AMP和环状AMP受体蛋白质的需求这一已公开的种种报道，该表型正如所预料的一样。
在构建接着的镰孢菌酸抗性四环素敏感衍生物的选择各步中，进行试验，以决定与四环素敏感性野生型亲代菌株所观察到的相比，是否四环素抗性回复突变等位基因/突变体可以以较高频率回收。在所有情况下，未观察到该四环素抗性回复突变等位基因/突变体。
实施例5
本实施例叙述通过引入影响cAMP合成和利用的缺失突变的无毒生物体的构件，及鉴定具有二个缺失突变的菌株的表型稳定性和完全无毒性。
细菌菌株：所用的鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌菌株列于表1.B和C中。这些菌株的保存和贮藏如实例1所述。
培养基：用于细菌常规培养、计数和鉴定的复合培养基如实例1所述。
转导和镰孢菌酸的Tn10缺失选择：所用培养基和方法如实例1所述。
无毒突变体的遗传稳定性：测定遗传特性稳定性的方法如实例1所述。
小鼠：所有感染试验均用雌性CFW-1小鼠（18-20g）（Charles  River，Wilmington，MA）。将这些动物用于试验以前，先在隔离的房间中饲养一周，将试验用小鼠放在带有金属丝底板复盖Nalgene滤片的笼内。随意给些食物和水。该动物的房间保持22-23℃，光照时间达12小时。
动物传染性：在腹膜内（i.p.）注射猪胃粘蛋白后测定伤寒沙门氏菌菌株的毒性。接种到小鼠中的细菌在L液体培养基中在37℃静置培养生长过夜。用预热的L液体培养基以1∶50的比例稀释该培养物，在37℃通风约4小时使OD600约为0.8-1.0。将合适的稀释液涂布在Penassay琼脂上以进行滴度测定，并涂布在含1%麦芽糖的MacConkey琼脂板上以鉴定cya/crp表型。
用26-gauge 3/8″的针将悬浮在15%（W/V）猪胃粘蛋白（Wilson lot＃0347A001）中的500μl伤寒沙门氏菌细胞注入未禁食的CFW-1小鼠进行腹膜内接种。该粘蛋白悬浮液的制法为：在121°F（15p.s.i.）热压处理10分钟，中和至PH为7，在加伤寒沙门氏菌细胞前，每ml中加入3μg柠檬酸铁铵（sigma，st.Louis.MO）。记录10天的发病率和死亡率数据，然后测定该野生型母体的LD50值，以及Δcrp-11 Δcya-12衍生物的毒性。
含有cya和crp突变的伤寒沙门氏菌菌株的构建：用类似Curtiss和Kelly（1987）所述的经典遗传方法进行野生型、毒性伤寒沙门氏菌Ty2（type  E，）ISP1820（type  46）和ISP2822（type  E，）菌株的遗传修饰，如下所述：ISP1820和ISP2822是最近在智利流行伤寒期间分离的，它可能比伤寒沙门氏菌的标准实验室Ty2菌株的侵害性更强。该方法包括：移动crp和cya基因缺失，该基因已被分离出并鉴定出其特征为在鼠伤寒沙门氏菌SL1344中）放转座子Tn10（编码四环素抗性）于Δcya或Δcrp突变体附近，并通过P22HTint一介导的转导作用将连接特性转导入高毒性的伤寒沙门氏菌Ty2，ISP1820和ISP2822菌株中，同时挑选出四环素抗性及筛选麦芽糖阴性表型。将连接crp的zhc-1431∷Tn10和连接cya的zid-62∷Tn10用于该目的。没有一种***单独影响鼠伤寒沙门氏菌的毒性。
首先在含Δcrp-11和zhc-1431∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3773中制成高滴度噬菌体P22HTint溶菌产物，再在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3773中制成高滴度噬菌体P22H Tint溶菌产物，再在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3711中生成另一种溶菌产物便很方便地进行带有连接转座子的基因缺失的转导。然后用所得的P22HTint溶菌产物以感染复制率10进行感染，将遗传特性转导入受体伤寒沙门氏菌Ty2、ISP1820和ISP2822菌株中。
用鼠伤寒沙门氏菌X3773〔Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10〕中繁殖的P22HTint转导毒性伤寒沙门氏菌Ty2、ISP1820和ISP2822菌株为筛选Mal-的四环素抗性。将噬菌感染混合物在37℃下保温20分钟，然后将100μl样品涂布在含1%麦芽糖（最终浓度），添加12.5μg四环素/ml的MacConkey琼脂（Difco Laboratories，Detroit，MI）上。在37℃保温约26小时后，收集四环素抗性Mal-转导体，在相同的培养基中进行纯化。所得到的Ty2衍生物称为X3853，ISP1820衍生物称为X4298，ISP2822衍生物称为X3852。所有这些菌株均具有基因型Δcrp-11 zhc-1431∷Tn10（表1.C.）。在L液体培养基+12.5μg四环素/ml中培养菌株X3852、X3853和X4298，用含明胶的缓冲盐水（BSG）以1∶10比例稀释各菌株，将100μl各菌株样品涂布在含镰孢菌酸（FA）的培养基上（Maloy and Nunn，1981），将该平板在37℃下保温约36小时。将各菌株的镰孢菌酸抗性菌落收集到0.5ml BSG中，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的镰孢菌酸抗性菌落收集在L液体培养基中，在37℃下培养至出现混浊，检测Tn10（四环素敏感性）的缺失，完全LPS和Vi抗原的存在以及半胱氨酸和色氨酸（所有母体菌株需要的二种氨基酸）营养缺陷。这些新菌株称为X3877（ISP2822）、X3878（Ty2）和X4299（ISP1820），它们均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕（表1.C.）。
由于Cya-和Crp-突变体的表型是相同的（Mal-、Stl-、Mtl-等），可用载带克隆的Crp+基因，并具有氨苄青霉素抗性的质粒pSD110（Schroeder and Dobrogosz，J.Bacteriol，167：616-622（1986）〕暂时补充染色体中的Δcrp突变，当通过转导引入时，能鉴定Δcya突变。用在鼠伤寒沙门氏菌X3670中繁殖的P22H Tint转导X3877、X3878和X4299的L液体培养基生长培养物，它含有质粒pSD110（表1.B.）。在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml中进行选择。26小时后，收集各菌株的氨苄青霉素抗性、Mal+菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖琼脂+100μg氨苄青霉素/ml中进行纯化，得到的菌株称为X3879（ISP2822），X3880（Ty2）和X4300（ISP1820），它们所有均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+
在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml中培养菌株X3879、X3880和X4300，用在X3711中繁殖的P22HTint分别转导各菌株以引入连接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突变。将该转换混合物涂布在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml的平板上。收集氨苄青霉素抗性（pSD110+）、四环素抗性（zid-62∷Tn10），Mal-（Δcya）菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中进行纯化。将已纯化的菌落收集在L液体培养基中，进行培养至出现混浊，检测这些菌株的完全LPS、Vi抗原和半胱氨酸和色氨酸营养缺陷。所得到的菌株称为X3921（ISP2822）、X3922（Ty2）和X4316（ISP1820），所有均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10（表1.C.）。在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml中培养X3921、X3922和X4316的培养物至出现混浊，用BSG以1∶10比例进行稀释，将100μl各培养物样品涂布在含镰孢菌酸的培养基上，在37℃下保温约36小时，收集各菌株的镰孢菌酸抗性菌落，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的FA-抗性菌落收集到L液体培养基中，培养至出现混浊，然后检测Tn10（四环素敏感性）的缺失，完全LPS，Vi抗原和半胱氨酸和色氨酸营养缺陷。在该过程中，质粒pSD110通常从该菌株中自然消失以导致氨苄青霉素敏感性。最后得到的菌株称为X3926（ISP2822）、X3927（Ty2）和X4322（ISP1820），所有均具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕（表1.C.）。用Luria软琼脂涂复技术，利用ViⅡ噬菌体敏感性，用对Vi（Difco Laboratories，Detroit，MI）的抗血清载片凝集法可证实伤寒沙门氏菌Vi抗原的合成。鞭毛的合成取决于功能性cya和crp基因。然而，由于鞭毛是一种有潜力的重要抗原，因此Δcya Δcrp伤寒沙门氏菌菌株的能动衍生物〔由于在cfs（本质的鞭毛合成物）基因中突变（silverman和simon，J.Bacteriol.120：1196-1203（1974）〕可在能动性琼脂中选择。X3926和X3927作为鞭毛状的和能动性的被分离出，其中菌株X4323作为X4222的鞭毛阳性能动衍生物而被选择。
表8列出了关系到糖的发酵和在各种碳中生长的所有突变体菌株及其母体的表型性质，LPS外形，Vi抗原和平均生殖时间。根据所公开报道的需具有分解代谢活性的环状AMP和环状AMP受体蛋白质这一必要条件，这些表型是正如所预料的一样。
Figure 911118764_IMG26
Figure 911118764_IMG28
无毒突变体的遗传稳定性
作活疫苗口服用的菌株就其无毒属性来说必须完全稳定。将Δcya Δcrp伤寒沙门氏菌菌株浓缩50倍的培养物和各种稀释液（～109、107、105、103CFU/平板）涂布在含0.5%麦芽糖、蜜二糖、木糖、甘油、或鼠李糖（不会帮助其生长）的基本琼脂培养基（添加所需氨基酸）的平板上时，检测不到回复突变等位基因和突变体。将一组复制平板进行紫外线辐照（5焦耳/米2/秒），并在暗处在37℃下保温。另一组平板在光照下在37℃保温。生长48小时后，未检测到回复突变等位基因和突变体，也进行试验以便确定与亲代菌株可以观察到的相比，四环素抗性回复突变等位基因/突变体是否能以较高频率回收。但在所有情况下，均未检测到这种四环素抗性回复突变等位基因/突变体。
突变体菌株对小鼠的毒性：表9所列数据说明用大约104倍LD50剂量的X3926或X3927感染小鼠后的存活情况。伤寒沙门氏菌的天然宿主是人。因此，用猪胃粘蛋白作小鼠中伤寒沙门氏菌细胞的毒性增强剂，从而使该模拟***中伤寒沙门氏菌疫苗后选物的毒性达最大。
实施例6
本实施例说明通过引入影响cAMP合成和利用的缺失突变，以及引入通过影响深层组织移生而控制沙门氏菌毒性的一个相邻基因的无毒微生物的构建。
细菌菌株：所用鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌菌株列于表1.B和C中，这些菌株的保存和贮藏如实例1所述。
培养基：用于细菌常规培养、计数和鉴定的复合培养基如实例1所述。
转导和镰孢菌酸Tn10缺失选择：所用培养基和方法如实例1所述。
无毒突变体的遗传稳定性：测定遗传特性稳定性的方法如实例1所述。
含有Δcya-12和Δ〔crp-cysG〕-10突变的伤寒沙门氏菌菌株的构建：伤寒沙门氏菌对人的侵害性很强。虽然含有Δcya-12和Δcrp-11突变的伤寒沙门氏菌（S.typhi）菌株显示无毒，但也似乎为慎重起见考虑加入一种额外的减毒突变以进一步提高安全性而不损害其致免疫性。在鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimu-rium）菌株中Δ〔crp-cysG〕-10突变的性质（实例1、3和4）证明它的使用可使伤寒沙门氏菌（S.typhi）无毒和致免疫。该突变也缺失cdt基因，该基因控制鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella  typhimurium）的深层组织移生，而不会明显减少肠道的移生和GALT。
用类似Curtiss和Kelly（1987）所述的经典遗传方法对野生型、毒性Ty2（E1型）、ISP1820（46型）、和ISP2822（E1型）菌株进行遗传修饰，如下所述：ISP1820和ISP2822是最近在智利流行伤寒期间分离的，它可能比伤寒沙门氏菌的标准实验室Ty2菌株的侵害性更强。因此，其减毒作用生成疫苗菌株比由Ty2衍生的菌株更有效。该构建方法包括使crp和cya基因缺失移动，该基因已被分离出并已鉴定。
〔在鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）SL1344中（如实例1所述）〕，放转座子Tn10（编码四环素抗性）于靠近Δcya或Δ〔crp-cysG〕-10突变附近和利用P22HTint介导的转导作用将连接特性转导入伤寒沙门氏菌Ty2和高毒性伤寒沙门氏菌ISP1820和ISP2822菌株同时选择四环素抗性和筛选麦芽糖阴性表型。将连接〔crp-cysG〕-10的zhc-1431∷Tn10和连接cya的zid-62∷Tn10用于该目的。没有一种***单独影响鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）的毒性。
先在含Δ〔crp-cysG〕-10和zhc-1431∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）菌株X3712中制成高滴度噬菌体P22HTint溶菌产物，在含Δcya-12和zid-62∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）菌株X3711中制成另一种溶菌产物便很方便的进行具有连接转座子的基因缺失的转导。然后用所得到的P22HTint溶菌产物将遗传特性转导入受体伤寒沙门氏菌（S.typhi）Ty2、ISP1820和ISP2822菌株中。
用在鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）X3712（Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10）中繁殖的P22HTint转导毒性伤寒沙门氏菌（S.typhi）Ty2、ISP1820和ISP2822菌株为四环素抗性同时筛选Mal-。将噬菌感染混合物在37℃下保温20分钟，然后将100μl样品涂布在含1%麦芽糖（最终浓度），添加12.5μg四环素/ml的MacConkey琼脂（Difco Laboratories，Detroit，MI）平板上。在37℃保温约26小时后，收集四环素抗性Mal-转导体，在相同的培养基中进行纯化。所得到的ISP2822衍生物称为X3791，该Ty2衍生物称为X3792，ISP1820衍生物称为X4324。所有这些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 zhc-1431∷Tn10，它们是半胱氨酸、色氨酸和精氨酸营养缺陷（表1.C）。在L液体培养基+12.5μg四环素/ml中培养菌株X3791、X3792和X4324。用含明胶的缓冲盐水（BSG）以1∶10比例稀释各培养物，取100μl各培养物涂布在含镰孢菌酸（FA）的培养基（Maloy and Nunn，1981）板上，将该板在37℃下保温约36小时。将各菌株的镰孢菌酸抗性菌落收集到0.5ml BSG中，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的镰孢菌酸抗性菌落收集到L液体培养基中，在37℃培养至出现混浊，检测Tn10（四环素敏感性）缺失，完全LPS和Vi抗原的存在以及半胱氨酸、精氨酸和色氨酸营养缺陷。这些新菌株称为X3802（ISP2822）、X3803（Ty2）和X4325（ISP1820），所有这些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕（表1.C）。
由于Cya-和Crp-/Cdt-突变体的基因型是相同的（Mal-、Stl-、Mtl-等），可用载带克隆的Crp+基因并具有氨苄青霉素抗性的质粒pSD110（Schroeder and Dobrogosz.J.Bacteriol.167：616-622（1986））暂时补充染色体中的Δcrp突变，当通过转导引入时，能鉴定Δcya突变。用在鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）X3670中繁殖的P22HTint转导X3802、X3803和X4325的L液体培养基生长培养物，它含有质粒pSD110（表1.B）。在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml中进行选择。26小时后，收集各菌株的氨苄青霉素抗性，Mal+菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖琼脂+100μg氨苄青霉素/ml中进行纯化，得到的菌株称为X3824（Ty2），X3845（ISP2822）和X4331（ISP1820），所有这些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+。
在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml中培养菌株X3824、X3845和X4331，用在X3711中繁殖的P22HTint分别转换各菌株以引入连接的Δcya-12和zid-62∷Tn10突变。将该转导混合物涂布在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml上。收集氨苄青霉素抗性（pSD110+）、四环素抗性（zid-62∷Tn10），Mal-（Δcya）菌落，在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml进行纯化。将已纯化的菌落收集到L液体培养基中，进行培养至出现混浊，检测这些菌株的完全LPS，Vi抗原和半胱氨酸和色氨酸营养缺陷。得到的菌株称为X3919（Ty2）、X3920（ISP2822）和X4340（ISP1820），所有这些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10。在L液体培养基+100ug氨苄青霉素/ml+12.5ug四环素/ml中培养×3919、X3920和X4340的培养物至出现混浊，用BSG以1∶10的比例进行稀释，将各培养物的100μl样品涂布在含镰孢菌酸培养基的板上，在37℃下保温的36小时。收集各菌株的镰孢菌酸抗性菌落，在FA培养基中进行纯化。将已纯化的FA抗性菌落收集到L液体培养基中，进行培养至出现混浊，然后检测Tn10（四环素敏感性）的缺失，完全LPS，Vi抗原和半胱氨酸、精氨酸和色氨酸营养缺陷。在该工序中pSD110质粒通常从该菌株中自然消失，结果得到氨苄青霉素敏感性。最后得到的这些菌株称为X3924（Tyz）、X3925（TSP2822）和X4345（TSP1820），所有这些菌株均具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10Δ〔znc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕（表l.c.）。用Luria软琼脂涂复技术，采用ViTT噬菌体敏感性，用对Vi（Difco Laboratories，Detroit，MI）的抗血清载片凝集法可证实伤寒沙门氏菌（S.typhi）Vi抗原的合成。鞭毛的合成取决于功能性cya和crp基因。然而，因为鞭毛是一种有潜力的重要抗原，由于在cfs（本质的鞭毛合成物）基因中突变（Silverman and Simon，J.Bacteriol 120：1196-1203（1974）），因此可在能动性琼脂中选择Δcya Δcrp伤寒沙门氏菌菌株的能动衍生物。菌株X3940（ISP2822），X4073（Tyz）和X4346（ISP1820）分别作为X3925、X3924和X4345的鞭毛阳性能动衍生物而被选择。
糖的发酵和在Δ〔crp-cysG〕-10突变体菌株在各种碳源中生长与Δcrp-11突变体菌株所观察到的是相同。根据公开报道的需要有分解代谢活性的环状AMP和环状AMP受体蛋白质的这一条件，该表型正如所预料的。
无毒突变体的遗传稳定性
作活疫苗口服用的菌株其无毒属性必须完全稳定。将Δcya Δcrp伤寒沙门氏菌（S.typhi）菌株浓缩50倍的培养物和各种稀释液（～109、107、105，103CFU/板）涂布在含0.5%麦芽糖、蜜二糖、木糖、甘油或鼠李糖（不会帮助其生长）的基本琼脂培养基（添加所定量氨基酸）的平板上时，检测不到回复突变等位基因和突变体。将一组复制板进行紫外线辐照（5焦耳/米2/秒），并在暗处中，在37℃保温。其它组的板在光照下在37℃保温。生长48小时后，未测到回复突变等位基因和突变体。对四环素抗性回复突变等位基因/突变体的回收与其亲代菌株的测定值相比能否以较高频率出现进行了试验。在所有情况下，均未检测到这种四环素抗性回复突变等位基因/突变体。
实施例7
本例描述重组体无毒伤寒沙门氏菌菌株的构建，该菌株表达作为口服疫苗使用以对各种传染病免疫的外来抗原。
细菌菌株：使用的大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌的菌株列于表1。这些菌株的维持和储存如表1所述。
培养基：适于细菌常规培养、计数和鉴定的复合培养基如例1所述。
转导和镰孢菌酸的Tn10缺失选择：培养基和方法列于例1。
具有Δasd A1突变的伤寒沙门氏菌菌株的构建：采用类似于Curtiss和Kelly（1987）和Nakayama、Kelly和Curtiss（1988）所述经典遗传方法，将野生型毒性的伤寒沙门氏菌Ty2（E1型）按下述步骤，从遗传上加以改性：含Δcya-12 Δcrp-11突变的菌株X3927和X4323的构建描述于例5中，含Δ〔crp-cysG〕-10突变的菌株X4346的构建描述于例6。在无毒沙门氏菌属菌株中的重组质粒上稳定的维持和高水平的表达克隆基因，取决于使用平衡的-致死寄主-载体***（balanced-lethal host-vector system）。为此编码天冬氨酸β-半醛脱氢酶的asd基因的染色体突变，被引入Δcya Δcrp突变体中，以此强加上需二氨基庚二酸（DAP）这一专门必要条件，该酸是细菌细胞壁坚硬层的主要成分，而且它不能在动物体内合成。染色体Δasd突变由具有野生型asd+基因的质粒克隆载体加以补充。质粒的丧失导至无DAP（DAPless）死亡和细胞的溶解。这种平衡的-致死寄主-载体的结合，在已免疫的动物寄主中可稳定数周，并能对克隆的基因产物以及沙门氏菌属诱发出强烈的免疫应答。
构建方法包括：移动Δasd A1突变（该突变已被分离出并已在鼠伤寒沙门氏菌LT2-Z（X3520）中验明特征）至Δcya Δcrp伤寒沙门氏菌。该步骤的完成是通过放置转座子Tn10（编码四环素抗性）靠近Δasd A1突变，再通过P22HTint转导作用，将连接特性转导入伤寒沙门氏菌Ty2 Δcya-12 Δcrp-11菌株X3927、伤寒沙门氏菌ISP1820Δcya-12Δcrp-11菌株X4323以及伤寒沙门氏菌ISP1820 ΔcyaΔ〔crp-cysG〕-10菌株X4346并同时挑选四环素抗性和筛选二氨基庚二酸（DAP）阴性表型。用连接Δasd A1的zhf-4∷Tn10于该目的。
带连接转座子的基因缺失，按下述方法很方便进行：首先在含ΔasdA1和zhf-4∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌X3520上制成高滴度的噬菌体P22HTint溶胞产物，所得到的P22HTint溶胞产物再用于感染和转导遗传特性至受体伤寒沙门氏菌Ty2菌株X3927，ISP1820菌株X4323和X4346，其感染复制率为10。
噬菌体细菌感染混合物于37℃下保温20分钟，然后取100μl样品涂布于含50μg DAP/ml的Penassay琼脂上（Difco实验室Detroit、MI），并补充以12.5μg四环素/ml，于37℃下保温约26小时后，检出转导体并于相同培养基上纯化。5个四环素抗性菌落筛选出，能产生转导体约4-5个，也是需DAP者。所得到的Ty2衍生物称为X4295并具有基因型Δcrp-11Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 Δasd A1 zhf-4∷Tn10。所得到的ISP1820衍生物称为X4416，具有基因型Δ〔crp-cysG〕-10Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δ〔zid-62∷Tn10〕ΔasdA1 zhf-4∷Tn10和X4434具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕ΔasdA1 zhf-4∷Tn10。菌株X4296、X4416和X4434在L液体培养基+50μg DAP/ml+12.5μg四环素/ml中培养，该培养基用含明胶的缓冲生理盐水（BSG）以1∶10比例稀释。取100μl样品涂布于含镰孢菌酸（FA）+50μg DAP/ml的培养基上（Malog和Nunn，1981），再将平板于37℃下保温大约36小时。镰孢菌酸抗性菌落取出放入0.5mlBSG中，并于FA+50μg DAP/ml的培养基上纯化。纯化过的镰孢菌酸抗性菌落取出放入L液体培养基+50μg DAP/ml中，于37℃下培养至溶液发生混浊，再检验Tn10缺失（四环素敏感性），完全LPB和Vi抗原的存在以及在标准培养基上半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和DAP的营养缺陷，新菌株称为X4297（Ty2），该菌株具有基因型Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕;X4417（ISP1820），具有基因型Δ（crp-cysG）-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕;以及X4435（ISP1820），具有基因型 Δcrp-11 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕 Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕 ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕。
野生型亲代菌株的Asd-衍生物构建的目的是用于将由Crp+Cya+背景表达的重组抗原的产生与用Crp-Cdt-Cya-背景表达的相比较。Ty2 ΔasdA1菌株的构建是通过用P22HTint（X3520）转导伤寒沙门氏菌X3769和伤寒沙门氏菌ISP1820菌株X3744，同时选择四环素抗性和筛选二氨基庚二酸阴性表型。所得到的Ty2衍生物称为X4456而ISP1820衍生物称为X4454，且两者都具有基因型ΔasdA1 zhf-4∷Tn10。菌株X4456和X4454在L液体培养基+50μg DAP/ml+12.5μg四环素/ml中培养并按1∶10比例将培养基用含明胶的缓冲生理盐水（BSG）稀释。将100μl的样品涂布于含镰孢菌酸+50μg DAP/ml培养基（Maloy和Nunn，1981）中，平板于37℃下保温约35小时。将镰孢菌酸抗性菌落收集放入L液体培养基+50μg DAP/ml中并于37℃下培养至混浊，再验证Tn10的缺失（四环素敏感性），完全LPS和Vi抗原的存在，以及在标准培养基上半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸和DAP营养缺陷。新菌株称为X4457（Ty2）和X4455，并具有基因型ΔasdA1 Δ〔zhf-4∷Tn10〕。
麻疯分枝杆菌（Mycobacterium  leprae）抗原在无毒重组伤寒沙门氏菌中的表达：λgt11∷麻疯分枝杆菌克隆L14（也称为克隆7.8），借助于汇集21名患麻疯结节（LL）的麻疯病人的血清通过λgt11∷麻疯分析杆菌库免疫筛选加以鉴定（Sathish，Esser  Thole和Clark-Curtiss，Infect.Immun.58：1327-1336（1990））。克隆L14确定了两种约158和153KDa的蛋白，这两种蛋白与汇集的LL病人血清中的抗体反应非常强烈（Sathish等人，1990）。当血清逐个被检验时，这些蛋白也与21名LL病人中的14名血清抗体反应（Clark-Curtiss，Thole，Sathish，Bosecker，Sela，de  Carvalho和Esser.Res.in  Microbiology，in  press）。
通过使用EcoRⅠ来消化重组噬菌体DNA，接着用琼脂糖凝胶电泳法分离经消化的片段，而从λgt11克隆14中除去1.0Kb的麻疯分枝杆菌***DNA片段。该麻疯分枝杆菌片段从凝胶中提纯并克隆到Asd+载体pYA292的EcoRⅠ位点（Galan，Nakayama和Curtiss，Gene（1990），94：29），产生两种重组质粒：pYA1077，其中麻疯分枝杆菌***DNA克隆成pYA292，其相对于trc启动子的取向与它在λgt11中相对于lacZ启动子的取向相同，还有pYA1078，其中麻疯分枝杆菌（M.leprae）片段以相对于trc启动子相反取向克隆。pYA1077的部分限制图列于图2，两种重组质粒被转化进大肠杆菌（Escherichia coli）K-12菌株X6060和鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）菌株X3730，由转化体特定的蛋白通过Western印迹法进行分析。克隆pYA1077特定大约30KDa的单融合蛋白，它能与汇集的LL病人血清中的抗体强烈反应。克隆pYA1078不特定任何能与病人血清反应的蛋白。
噬菌体P22HTint溶胞产物在鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）X3730+pYA1077和X3730+pYA1078上制备;这些溶胞产物用于转导伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4297、X4417、X4435、X4455和X4457。借助于pYA1077由三种任意挑选的X4291转导体产生的蛋白的Western印迹分析表明，每一种转导体都特定一种能与汇集的LL病人血清反应的30KDa蛋白，而其中三种独立X4297转导体（包含pYA1078），就不特定任何免疫活性蛋白（图3）。
另外，来源于pYA1077的免疫活性蛋白的表达，也能在X4417、X4435、X4455和X4457中被证明。图4表示蛋白的Western印迹，该蛋白是由λgt11：麻疯分枝杆菌（M.leprae）克隆L14和包含pYA292、pYA1077和pYA1078的伤寒沙门氏菌（S.typhi）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）和大肠杆菌（E.coli）产生的。硝化纤维滤纸上的蛋白，与21名麻疯结节麻疯病人汇集的血清起反应，按Sathish、Esser.Thole和Clark-Curtiss（1990）58：1327所说明的技术检测阳性抗原-抗体。尤其是当次生抗体是碱性磷酸酶-结合抗-人多特异性抗体，产色底物是氮兰四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯、P-甲苯胺盐时。附图泳道如下：（泳道1）分子大小标记;（泳道2）具有pYA1077的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4297;（泳道3）具有pYA1077的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4417;（泳道4）具有pYA1077的伤寒沙门氏菌X4435;（泳道5）具有pYA1077的伤寒沙门氏菌X4455;（泳道6）具有pYA1077的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X＝4457;（泳道7）具有pYA292的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4297;（泳道8）具有pYA292的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4435;（泳道9）具有pYA292的伤寒沙门氏菌（S.typhi）的X4455;（泳道10）具有pYA292的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4457;（泳道11）具有pYA292的伤寒沙门氏菌（S.typhi）X4417;（泳道12）具有pYA1077的大肠杆菌（E.coli）X6097;（泳道13）来源于λgt11∷麻疯分枝杆菌（M.leprae）克隆L14的蛋白;（泳道14）具有pYA1078的鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）X4072。由λgt11∷麻疯分枝杆菌（M.leprae）克隆L14特定的免疫活性蛋白尺寸较大，因为它们是与β-半乳糖苷酶的融合蛋白。
具有pYA1077重组载体的伤寒沙门氏菌菌株X4297、X4417和X4435是用于人体免疫，对伤寒热和麻疯病具有保护作用的候选物。这种疫苗的效力由验明1至数种麻疯分枝杆菌抗原（该抗原可产生保护性免疫应答），并由其具有在伤寒沙门氏菌Δcya Δcrp Δcdt Δasd菌株中以Asd+载体所克隆基因而特定的该抗原而定，然后可用于人体免疫接种试验。
实施例8
本例提供的程序适于检验活口服疫苗的安全性、免疫性和效果，该疫苗包含伤寒沙门氏菌（S.typhi）的Δcya  Δcrp突变体。试验用的菌株是Ty2、ISP1820和ISP2822的Δcya  Δcrp衍生物。
个体研究：个体研究是年令为18-39岁的健康成年的志愿者。研究前予定的志愿者要经筛选。筛选程序包括：
1.用药史
2.身体检查
3.心电图
4.尿分析
5.全血球计数
6.血化学（BUN、肌酸酐、禁食血糖）
7.血清Na+、Cl-、K+、HCO-3
8.VDRL
9.乙型肝炎表面抗原
10.按ELISA计的HIV抗体
11.妊娠试验（女性）
12.肝功能试验（SPGT）
13.心理检查和会见
挑选参与研究的志愿者的根据是一般良好的健康状况和：
1.不具重大临床史的胆囊膀胱病，免疫缺乏、心血管性疾病、呼吸道疫病、内分泌紊乱、肝病（包括乙型肝炎，肾脏和膀胱病史）、***肥大、青光眼、胃肠病、网状内皮组织***紊乱、神经病、需住院治疗的精神混乱、药物或酒精滥用;
2.肠的正常和规则的习性（属于普通群体所定义的界限）：大便至少每周三次和每天不多于三次，不经常使用轻泻剂或止泻药剂;
3.对羟氨苄青霉素或ciprofloxacin不过敏;
4.接种疫苗前7天中无抗菌素治疗史;
5.阴性妊娠试验（女性）;
6.HIV抗体试验阴性。
让志愿者进入隔离病房，还要获得经宣告的、能作为证据的书面许可。
研究计划：研究一群22名志愿者，收集原始血液和肠液样品。在病房新环境下适应2天后，禁食的志愿者允许随机摄取掺有碳酸氢盐缓冲剂的一次口服剂量，其中含5×105的Ty2 ISP1820或ISP2822之任一种Δcya Δcrp衍生物。以后观察志愿者15天看有否不良反应：发烧、不适、寒冷、呕吐、腹泻（通常伤寒热的潜伏期为8-12天）。获得一系列血液和粪便培养物。另外，任何志愿者体温升至100.8°F时，便即时抽取血样进行观察，假如体温维持在该温度12小时，开始口服羟氨苄青霉素（每6小时1.0g）和ciprofloxacin（每12小时750mg服10天）进行治疗。在观察期第7、10和13天还吸取十二指肠液物。
动物试验：借助猪胃粘蛋白作为辅助剂，通过腹膜内接种小鼠测定亲代菌株和其减毒的衍生物的LD50。
疫苗接种剂的配制：伤寒沙门氏菌候选疫苗菌株的现有培养物，以胰蛋白酶（tryphicase）大豆液体培养基（TSB）（同时补充15%甘油）的细胞悬浮液形式储存，温度为-70℃，直到需要时。为制得每种菌株接种物，作细菌攻击前2天，将悬浮液熔化并涂复于羊红血细胞琼脂上（TSA中的Srbc为5%），于37℃保温过夜。挑选大约20-30株具代表性的菌落再悬浮于生理盐水中。该悬浮液于胰蛋白酶大豆琼脂培养平板上接种，培养基适当地加以补充，平板于37℃保温过夜。在配制适于志愿者口服接种的制剂时，采集每块平板上的生长物，大约使用3ml的消毒普通生理盐水。用浊度测定法标定所得到的悬浮液，在生理盐水中稀释至接近所需沙门氏菌属的浓度。用冰镇将疫苗接种物转移至隔离病房。使用前要进行显微镜检查和进行以伤寒沙门氏菌O和H抗血清的载片凝集法试验。为了确定存活力和接种物尺寸，接种前和接种后，涂复于平板的复制物的定量培养物由接种物制成。
志愿者接种：施用疫苗是掺有NaHCO3口服的，接种以前志愿者禁食（NPO）90分钟。将2g NaHCO3溶解于5盎司蒸馏水中，志愿者饮4盎司的该碳酸氢盐水，1分钟后志愿者摄取悬浮于剩余的1盎司碳酸氢盐水中的疫苗。接种后，志愿者不吃食物或水90分钟。
样品收集程序
大便样品：持续记录志愿者便出的全部大便：编号、稠度和特征描述。收集每一份大便样品（或若大便不通时用直肠拭子）用于培养，测量样品的体积。大便按五点体系分等：
1级-硬大便（正常）
2级-软大便（正常）
3级-稠液体（非正常）
4级-非透明水样（非正常）
5级-米汤状（非正常）
静脉切开放血：接种疫苗前和接种后的第8、21、28、60和180天取抗体测定用的血清。在第0、4、7和10天收集为分泌抗体细胞检验用的，使淋巴细胞分离的肝素化血液。在第0、28、60和180天时收集的单核细胞用于检验淋巴细胞对沙门氏菌属和对照抗原的增殖应答。最后第0、28、60和180天时的单核细胞，也可用于对伤寒沙门氏菌和对照生物体的抗体依赖性胞毒性进行检验。接种后疫苗观察期中，取第3、4、7、8、10、12和15天的血样（5ml）培养以检测疫苗生物体。在初次接种疫苗后的第180天，再取额外的血清和单核细胞样品。
空肠液的吸出：口服接种疫苗前和紧接排出液体之前（第15天），志愿者吞下聚氯乙烯肠管，其距离为由嘴量起130cm，以收集肠液，测定局部SIgA抗体。在咽下肠管以后，口服10mg灭吐灵（甲氧普胺）以加速肠管由胃通过幽门进入小肠。管在空肠中放置的位置可从距离（130cm），吸出液的颜色（黄-绿）和其PH值（6）来得到证实。每次插管排出的空肠体液大约100ml。
明胶引线胶囊：为了测量每种疫苗菌株的肠移生速率，在住院期间，志愿者要三次吞咽明胶引线胶囊（Entero试验）。
志愿者自上午6时禁食（NPO），咽下水为润湿嘴和咽喉。该胶囊（带有拉出的线的部份）随水咽下，同时拉住尼龙线的环、线停留在面部，并保持4小时。允许志愿者最多饮水1磅，但不允许吃其它的食物或饮料。4小时后取出线，为粘有粘液的胆汁所饱和的末端被切下放在消毒过的陪替氏培养皿中。为识别起见注上标志。然后用该线培养微生物，采用的方法与用大便样品相同。
扁桃体培养：为了检测接种疫苗后扁桃体淋巴组织可能的侵染，获得第3、4、7、8、10、12和15天的系列扁桃体培养物。
细菌学分析：大便、直肠拭子和吞咽明胶胶囊得到的粘胆汁的十二指肠引线15cm末端，均在***盐F浓缩液液体培养基中接种。扁桃体拭子接种在GN液体培养基中，于37℃保温过夜后，再次培养在沙门氏菌属-沙雷氏菌属（Salmonella-shigella）琼脂和XLD琼脂上进行，两者均需对疫苗菌株的营养缺陷作适当的补充。可疑菌落转移至补充三倍糖铁斜面培养上，并通过以伤寒沙门氏菌Vi，O和H抗血清的凝集作用而加以证实。这些分离物保存在-70℃的甘油中以便进一步分析（例如质粒的存在或用克隆基因的特异基因探针作Southem印迹分析）。
血培养物（5ml）接种于50ml补充过脑心浸液的液体培养基中。
免疫学分析：采用Levine等人（1987年）在J.Clin.Invest.79：888-902所描述的程序检验血清和空肠样品的对伤寒沙门菌O、H、和Vi抗原的IgA、IgM和IgG抗体（该抗原是按ELISA法测定过的）。H抗体也可使用弗吉尼亚沙门氏菌（S.Virginia）作抗原通过Widal管凝集来进行测定（S.Virginia与S.typhi共享同样鞭毛抗原）。
收集末稍血单核细胞并为研究对沙门氏菌属抗原的特异反应而加以分离，这些包括下列内容。
1.抗体-分泌细胞：按Kantele等人的方法测定穿叉（trafficking）淋巴细胞，所述细胞能分泌抗伤寒沙门氏菌O、Vi或H抗原的IgG、IgA或IgG抗体。
2.复制淋巴细胞：末稍血液单核细胞与加热苯酞失活的伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、沙氏沙门氏菌（S.thompson）和大肠杆菌混合以检测引发抗原的淋巴细胞复制，如上面Levine等人所述。
3.ADCC：伤寒沙门氏菌的血浆介导单核细胞抑制作用，按上述Levine所述的抗体依赖性细胞毒素检验法进行检验。
疫苗菌株的***作用，予期服用一剂量疫苗后，疫苗菌株的***在一周内终止。假若***持续7或更多天，就要给连续***的志愿者一定剂量的ciprofloxacin（每12小时750mg），液体***物需连续两天或两天以上为阴性培养物方可。
实施例9
本例用实例说明Δcya Δcrp伤寒沙门氏菌（S.typhi）菌株，X3927，的安全性和致免疫性，所述菌株是由野生型亲代菌株Ty2制备的。该菌株在小鼠中的LD50为1.8×104（采用腹腔注射猪胃粘蛋白）。
下列的程序基本上如上文例8所述。两群志愿者用来研究服用不同剂量的疫苗。在第一类研究中，以17名志愿者随机处于双盲方式，6名志愿者接受5×1015cfu的X3927，剩余的接受相同剂量的其它伤寒沙门氏菌（S.typhi）。在第二类研究中，19名志愿者随机处于双盲方式，6名志愿者接受5×104cfu的X3927，剩余者接受相同剂量的另外伤寒沙门氏菌（S.typhi）菌株。志愿者在隔离病房密切监视15天（第一类研究）或24天（第二类研究）。在观察期每6小时测一次生命征状。每一志愿者的全部大便都收集在塑料容器内、检查、按五等分级，若大便是松散的则测其体积。医生逐日会晤志愿者并询问征状。定义发烧为口腔温度≥38.2℃;定义腹泻为48小时内两次或更多次松散大便，其总体积至少为200ml或一次松散大便其体积≥300ml。对发烧加剧或阳性血培养的志愿者要给予抗生菌治疗。
为了制备疫苗，将维持在-70℃下具有15%甘油的胰蛋白酶大豆液体培养基上的现有的X3927中培养物解冻后在补充的变性琼脂（aro agar）培养基上培养。于37℃下保温后，从变性琼脂上挑出20-30株有代表性的疫苗菌株的菌落，悬浮于生理盐水中，并再次接种于变性琼脂上。37℃下培养过夜后，用3ml消毒磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）收集细菌，细菌的浓度用浊度测量法校对。悬浮液以PBS稀释使达到每毫升存活生物体为所需之浓度。接种物的密度由显微镜检查和与S.typhi O、H和Vi抗血清的side凝集作用来确定。涂覆于平板的复制物定量培养是由接种前后的接种物制成的，以证实存活率和接种物尺寸。
疫苗菌株与碳酸氢钠一起口服施药，碳酸氢钠（2mg）溶解于150ml的蒸馏水中，志愿者饮120ml以中和胃酸。1分钟后，志愿者饮用悬浮于剩余30ml碳酸氢钠溶液中的疫苗。接种疫苗前后90分钟内，志愿者不得吃或饮任何东西。
志愿者排出的每份大便（如无大便排出可用直肠拭子）逐日进行疫苗菌株培养。大便接种于革兰氏阴性液体培养基（BBL，cockeysvilla，MD），补充以0.1%PABA和0.1%PHB和直接在具有补充物的S-S琼脂上。37℃下保温过夜后，在补充过的S-S琼脂上进行次代培养。为了定量疫苗菌株的脱落，1克大便连续在生理盐水中稀释10倍并且每次稀释液均涂布于如上补充的S-S琼脂上，可疑菌落转移至三倍糖铁琼脂斜面培养并以伤寒沙门菌的O、H和Vi抗血清凝聚法来确定其属性。
疫苗接种后的第7、10和13天，禁食的志愿者吞下带引线装置的明胶胶囊以收集沾染胆汁的十二指肠液的样品。4小时后，取出引线并记录15cm末端的颜色和PH。由引线的终端挤压出十二指肠液并按上述方式培养。
培养疫苗生物体的血液按接种疫苗后的第4、5、7、8、10、12和15天***收集，如果出现发烧则再来一次，将5ml的血液接种到50ml的补充的变性液体培养基中。
另外，取1、2、4、5、7、8、10、12和15的扁桃体培养以检测疫苗菌株。用于扁桃体的拭子接种于具有补充物的革兰氏阴性液体培养基中24小时然后再涂于补充过的沙门氏菌属-志贺氏杆菌属（shigella）琼脂上。
为了测定免疫反应，接着进行下列程序。疫苗接种前和接种后的第7、21、28和60天取血清样品。疫苗接种前和接种后的第14天收集空肠液，如例8所述。用ELISA法测量肠液中IgA的总含量并校准每份样品使每100ml含20mg的IgA。测量血清和空肠液中的S.typhi脂多糖（LPS）、H和Vi抗原的抗体。
对LPS  O抗原的IgG抗体用ELISA法检验。试验血清以1∶100的比例稀释，接种前后，这二者之间净光密度升高≥0.20被认为是显著性升高。阳性对照血清均使用含高水平LPS  O抗体的微滴平板，它代表12名健康智利人血清汇集，这些人在免疫接种Ty21a疫苗后具有很强的IgG  LPS  O抗体反应。对LPS  O抗原的IgA抗体采用两倍血清稀释度来测量，一开始稀释为1∶25。假若接种程序前后之间出现4倍的上升，这样的IgA滴度被认为是显著的。
通过ELISA法也可测量肠分泌对伤寒沙门氏菌LPS  O抗原的IgA抗体。上升4倍被认为是显著的。
为了测定H抗体，要从伤寒沙门氏菌菌株541Ty制备H-d鞭毛抗原。血清和空肠液H-d抗体可通过ELISA法测定。滴度上升4倍被认为是显著的。
使用弗吉尼亚沙门氏菌（Salmonella  Virgina）（该菌与伤寒沙门氏菌共享鞭毛抗原d，而无其它抗原）来进行H抗体Widal管凝集试验。
测定血清和空肠液中的Vi抗体，可用ELISA法，上升4倍认为是显著的。
肠-衍生的、穿叉（trafficking）抗体分泌细胞（分泌抗伤寒沙门氏菌O、H或Vi抗原的IgG、IgA或IgM抗体），按Forrest等人（1988，Lancet  1：81）的方法，使用ELISA和ELISPOT检测法加以改良来测定。在接种前和接种后的第7天和第10天取出肝素化血液。简言之，将按Ficoll梯度法（Organon  Teknika，Durham，NC）分离的末稍血淋巴细胞加到抗原-涂布平板上。在ELISA中，由淋巴细胞分泌出的抗体结合性能，可通过底物与结合的抗-IgA共轭物的反应所产生的光密度的变化来测定。对LPS  H和Vi抗原的显著反应是用在O.D.pllus  3  S.D.中之差来测定的，该差值由取自参加该项研究的志愿者免疫前和4天时的细胞测出的。在ELISPOT检验中，由个体淋巴细胞分泌的特异IgA的测定。是通过向每个微孔上加琼脂糖，并计数底物与结合的抗-人IgA共轭物反应所产生的色斑。接种后每个孔色斑≥4，定义为阳性反应。该数目是根据接种前的斑数加上2  S.D.后的平均数得到的。
所得结果如下。
接种后志愿者的临床病症和症状以双盲方式评价。12位接受菌株X3927的志愿者中的1人发烧，该志愿者接种后的第22天，发烧出现最高温度达40.1℃。该志愿者在4-13天期间有过剧烈的腹痉挛、精神欠爽、缺乏食欲、头痛和呕吐，但22天前并未开始发烧。之后，他的症状包括晕弦，肌肉和身体持续疼痛、便泌、失眠和咳嗽产生棕色痰。该组另一志愿者在住院病人监视期内有过精神欠爽、痉挛、头痛和反呕。
细菌学研究表明，接受5×104cfu X3927的6名志愿者中有1名，接受5×105的六名中的1人，有血培养阳性反应，这些分别于15天、8天和12天出现，这些志愿者中没有一人有任何症状。接受X3927的十二位志愿者中，有一位检验其第1天的大便，发现一株疫苗生物体菌落。这些志愿者没有1人扁桃体或十二指肠引线培养是阳性的。由志愿者的血液和大便回收的X3927分离物保留着全部与存在Δcya Δcrp突变有关的予期表型。
免疫学研究表明接受X3927的12名志愿者中有6名（50%）IgG抗伤寒沙门菌LPS反应有发展。在12名志愿者中未检出1例有对H抗原或Vi抗原的抗体。在12名志愿者中只有1例空肠液中抗LPS的分泌IgA有发展。对H抗原的分泌IgA抗体反应只在1名志愿者出现，而接种后无志愿者具有分泌抗Vi抗体。通过ELISA或ELISASPOT检验法，检测抗LPS的分泌IgA的循环细胞时，12名志愿者中有5名发展。
由在环AMP调节途径中的缺失赋于的减毒程度，若志愿者不同时用突变体和亲代菌株进行试验则不能精确测出。然而，根据给志愿者相似剂量的野生菌株得出的历史实验资料表明，这种缺失使伤寒沙门氏菌减毒是很可能的。当给6名志愿者服用剂量为1×107的野生型伤寒沙门菌株Ty2而无碳酸氢钠时，83%出现伤寒发烧（定义温度为103°F、持续36小时以上）或感染（定义为低级发烧、显著的血清反应、阳性血培养、或***伤寒沙门菌5天以上）。相反，在本文所报导的12名志愿者中，接受由Ty2衍生出来的X3927疫苗，与碳酸氢钠一起使用剂量为104或105cfu（相当于无碳酸氢钠时一个高得多的剂量），仅一例志愿者发烧且血培养阳性。除此而外，出现发热的志愿者在他们的血液中并没有检测出疫苗细菌，尽管发烧的同时收集了额外的血培养。出现发烧可能是在于由疫苗的肠感染刺激的胞质***释放作出反应所致。
实施例10
本例描述含Δcdt突变的Δcrp-10 Δcya伤寒沙门氏菌构件的构建和特性鉴定。我们已将Δcya Δcrp突变引入伤寒沙门氏菌Ty2（E1型）和伤寒沙门氏菌ISP1820（智利流行性分离株46型）。具有Δcya-12和Δcrp-11突变的菌株，前者已在志愿者中进行了评价，描述于例9。接受5×104cfu Δcrp-11 Δcya-12伤寒沙门菌株X3927的6名志愿者中有一名，接受5×105cfu的6名中有1名出现阳性培养物，这些分别出现在15天和8、12天。然而这些志愿者中没有1人有任何症状。此外，并不是所有的免疫过的个体对伤寒沙门氏菌抗原都能演变成高滴度抗体反应。为了能在这些已免疫的大多数中诱导保护性免疫，需经额外减毒，使能口服较高剂量的突变体。我们已鉴定了被引入Δcya Δcrp伤寒沙门菌的附加基因缺陷，结果降低了毒性，于是可以使用较高剂量。该缺陷是使深层组织移生的一种称为cdt的基因缺失。除带Δcya和Δcrp突变外，还带Δcdt突变的菌株，与只有Δcya Δcrp突变的菌株相比，能存活于人血清中也较少，因此它们比较容易清除，并且不大可能诱发疫苗症（Vaccinemia），
菌株构建
野生型毒性伤寒沙门氏Ty2（E1型）和ISP1820（46型）菌株，按Curtiss和Kelly（1987）在Infect.Immun 55：3035-3043描述的经典遗传方法从遗传学上进行改性。鼠伤寒沙门氏菌缺失突变体，当缺少腺苷酸环化酶和环AMP受体蛋白时是无毒的和致免疫的（Infect.Immun.55：3035-3043（1））。该方法包括方便地转导crp-cdt（称为Δcrp-10）和cya基因的缺失，所述基因已分离出、已鉴定特征（在鼠伤寒沙门氏菌SL1344中），放转座子Tn10（编码四环素抗性）靠近cya或crp缺失处。因此，我们分别使用了与Δcrp-10连接的zhc-1431∷Tn10和与Δcya-12连接的zid-62∷Tn10，并且用P22HTint共转导该连接特性入高毒性伤寒沙门氏菌Ty2和ISP1820菌株，同时选择四环素抗性和筛选麦芽糖阴性表型。
首先在含Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10突变的鼠伤寒沙门氏菌菌株X3712上制成高滴度的噬菌体P22HTint溶胞产物和在含Δcya-12 zid-62∷Tn10突变的鼠伤寒沙门菌菌株X3711上制成另一溶胞产物，带连接转座子的基因缺失转导便很方便地进行。然后将所得到的P22HTint溶胞产物用于感染和转导遗传特性致受体鼠伤寒沙门氏菌Ty2（X3769）和ISP1820（X3744）菌株，其感染复制率为10。
在鼠伤寒沙门氏菌X3712（Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10）上繁殖的P22HTint用于转导有毒的伤寒沙门氏菌Ty2和ISP1820菌株成为Mal-、Tetr。噬菌体细菌感染混合物，先于37℃保温20分钟，再将100μl样品涂于含1%麦芽糖（最终浓度）并补充以12.5μg四环素/ml的MacConkey琼脂（Difco实验室Detroit，MI）上。在37℃下保温大约26-36小时后，取出转导体，并于同样培养基上纯化。所得到的Ty2衍生物称为X3792而ISP1820衍生物称为X4324。两者都具有基因型Δcrp-10 zhc-1431∷Tn10，菌株X3992和X4324在Lucria液体培养基+12.5μg四环素/ml中培养、并且每一种都用具明胶的缓冲发理盐水（BSG）以1∶10的比例稀释。将每种菌株的100ml样品涂布于含镰孢菌酸（FA）的培养基上（Maloy和Nunn（1981），J.Bacterial 145：1110-1112），该平板在37℃保温约36小时。将每种菌株的镰孢菌酸抗性菌落放入0.5ml BSG中，再于FA培养基上用划线法纯化。纯化过的镰孢菌酸抗性菌落放入Luria液体培养基上再于37℃培养至混浊、然后验证Tn10缺失（四环素敏感性）、完全LPS、Vi抗原和精氨酸，半胱氨酸及色氨酸的营养缺陷。新菌株称为X3803（Ty2）和X4325（ISP1820）。它们具有基因基Δcrp-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10。
附注1：Luria液体培养基每升含10g的Nacl，而Lennox液体培养基每升含5g  Nacl。现已证明在高渗透性培养基中生长的沙门氏菌细胞显示侵入组织培养细胞的能力，增加了（Galan和Curtiss，Infect，Immnn.（1990）58：1879-1885）;为侵入所必须的沙门氏菌基因的表达，可通过DNA超卷曲的改变来调节）。因此增加Luria液体培养基中的Nacl浓度能保证疫苗菌株的最佳效果。
由于cya-和crp-/cdt-突变体的表型是一样的（Mal-、Stl-、Mtl-等），因此质粒pSD110、载带克隆野生型crp+基因与其启动子一起（Schroeoler和Dobrogosz（1986），J.Bacteriol 167：616-622）被暂时用于补充染色体中的Δcrp突变（因此菌株恢复成野生型表型）、并且能在转导后鉴定具有Δcya突变的菌株、X3803和X4325的Luria液体培养物用在鼠伤寒沙门氏菌X3670上繁殖的P22HTint转导，其中含有质粒pSD110。选择是在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml上进行的。26小时后，挑出每种菌株的氨苄青霉素-抗性的。Mal+菌落并于MacConkey琼脂+1%麦芽糖琼脂上纯化称为X3824（Ty2）和X4331（ISP1820），它们有基因型Δcrp-10Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+。
菌株X3824和X4331在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml中生长并且每株独立用X3712上繁殖的P22HTint转导引入Δcya-12和连接zid-62∷Tn10突变。选择麦芽糖阴性，四环素抗性，氨苄青霉素抗性表型是在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml上进行的。氨苄青霉素-抗性（pSD110+）、四环素-抗性（zid-62∷Tn10）、Mal-（Δcya）菌落挑选出并在MacConkey琼脂+1%麦芽糖+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml上纯化。纯化过的菌落放入Luria液体培养基中，培养至混浊后验证菌株完全LPS、Vi抗原和精氨酸、半胱氨酸和色氨酸的营养缺陷，正确表型的分离株称为X3919（Ty2）和X4340（ISP1820），它们具有基因型Δcrp-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕pSD110+Δcya-12 zid-62∷Tn10。X3919和X4340的培养物在L液体培养基+100μg氨苄青霉素/ml+12.5μg四环素/ml内生长至混浊，用BSG按1∶10稀释，并将每种培养物100μl的样品涂布于含镰孢菌酸的培养基上，再于37℃下保温大约36小时。挑出每种菌株的镰孢菌酸-抗性菌落并于FA培养基上纯化。纯化后的FA-抗性菌落挑出放入Luria液体培养基中，生长至混浊后再验证Tn10的缺失（四环素敏感性）、完全LPB、Vi抗原和对精氨酸、半胱氨酸和色氨酸的营养缺陷型。pSD110质粒在菌株生长期在缺乏氨苄青霉素的条件下自然丧失。最终的氨苄青霉素敏感的且无质粒的菌株称为X3924（Ty2）和X4345（ISP1820），它们具有基因型Δcrp-10 Δ〔zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔zid-62∷Tn10〕。由于具有能动表现的鞭毛合成，部份取决于功能性cya和crp基因以及由于鞭毛是重要的抗原，所以我们选择具有抑制基因突变（cfs）（它允许鞭毛合成并且功能与cya和crp基因功能无关）的X3924和X4346的衍生物。X4073被挑选作为X3924的鞭毛阳性衍生物，而X4346作为X4345的鞭毛阳性衍生物被挑选出来。表10列出野生型亲代菌株及其Δcya Δcrp衍生物。
通过下列表型的特征，菌株X4073和X4346很容易与其野生型亲代菌株区分，不能在碳源麦芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇、蜜二糖和木糖中发酵或生长，不能产生H2S，增长了生殖时间和显著提高鼠类LD50值。
表10
细菌菌株
X3769，S.typhi Ty2
E1型，野生型，Vi+
从华盛顿，哥伦比亚特区（DC），L.Baron，Walter Reed Army 研究所作为Ty2得到的。
X4073S.typhi Ty2
Δcrp-10〔Zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔Zid-62∷Tn10〕;X3769的Crp-Cdt-cya-Arg-衍生物。
X3744S.typhi ISP1820
46型，野生型，Vi+
从巴尔的摩，MD，M.Levine，疫苗发展中心，作为ISP1820得到的，来源于智利病人1983分离株。
X4346S.typhi ISP1820
Δcrp-10 Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕Δcya-12 Δ〔Zid-62∷Tn10〕;X3744的crp-cdt-Cya-Arg-衍生物。
X3744、X3769、X4073和X4346的生长条件
将每种菌株的细胞从琼脂培养基内挑出放入2ml Luria液体培养基内。按静止培养于37℃保温约14小时。当培养物能看出混浊时（OD600≥0.5），将每种培养物的全环划上线在表11所列的培养基上分离菌落以验证某些表型。也检测培养物对噬菌体的敏感性、抗菌素的敏感度、产生野生型LPS的能力、营养缺陷、能动性、产生大肠杆菌素的无能、质粒DNA的缺失、平均生殖时间以及通过抗血清的凝集作用鉴定伤寒沙门菌的O、H和Vi抗原（见表11）就Δcya Δcrp菌株X4346和X4073生长明显比其亲代野生型慢这点来说，所有菌株的表型性质正如所予料的。
表11
伤寒沙门氏菌野生型和Δcrp-10  Δcya-12菌株的表型特征
表型
MacConkey 基质琼脂+X3744X4346X3769X4073
1%麦芽糖  +  -  +  -
1%山梨糖醇  +  -  +  -
1%甘露糖醇  +  -  +  -
1%蜜二糖  +  -  +  -
1%鼠李糖  -  -  -  -
1%柠檬酸  -  -  -  -
1%***糖  -  -  -  -
1%甘露糖  +  +  +  +
1%木糖  +  -  +  -
1%葡萄糖  +  +  +  +
基本琼脂a+
0.5%葡萄糖  +  +  +  +
0.5山梨糖醇  +  -  +  -
0.5%甘露糖醇  +  -  +  -
0.5%蜜二糖  +  -  +  -
表11（续）
伤寒沙门氏菌野生型和Δcrp-10  Δcya-12菌株的表型特征
表型
MacConkey基质琼脂+X3744X4346X3769X4073
0.5%鼠李糖  -  -  -  -
0.5%柠檬酸  -  -  -  -
0.5%***糖  -  -  -  -
0.5%甘露糖  +  +  +  +
0.5木糖  +  -  +  -
a基本培养基配方已附上过;补充物包括L-精氨酸HCl  22μg/ml，L-半胱氨酸HCl  22μg/ml，L-色氨酸20μg/ml。
表11（续）
表型
X3744X4346X3769X4073
三倍糖铁培养基-H2S + - + -
产生
碱性斜面培养- Lac-Lac-Lac-Lac-
Glu+Glu+Glu+Glu+
Suc-Suc-Suc-Suc-
吲哚发酵检验  -  -  -  -
噬菌体敏感性c
ViⅡ  S  S  S  S
Felix-O  S  S  S  S
p22HTint  S  S  S  S
PiL4R R R R
L  R  R  R  R
KB1  R  R  R  R
通过SDE-PAGE（银  完全  完全  完全  完全
染色）的LPB外形（comp.
=Complete）
能动性d+ + + +
大肠杆菌素产生  -  -  -  -
c  噬菌体敏感性的检验是按软琼脂涂复技术通过转导进行的。S＝敏感的;R＝抗性的。
d  能动性的测定是通过将静止过夜的Luria液体培养物的菌环穿刺放入含1.0%酪蛋白、0.5%NaCl、0.5%Difco琼脂和50μg/ml三苯基-四唑嗡氯化物的培养基;于37℃下保温并于24小时和48小时记录能动性。
表11（续）
表征
X3744X4346X3769X4073
MGTe26.6 36.5 24.3 34.5
质粒含量  无  无  无  无
营养缺陷型 Cys-Cys-Cys-Cys-
Trp-Trp-Trp-Trp-
Arg+Arg+Arg+Arg+
MICf
四环素  4  4  ＜2  4
链霉  素  64    64    16    8
氨苄青霉素  ＜2  ＜2  ＜2  ＜2
庆大霉素  ＜2  ＜2  ＜2  ＜2
氯霉素  4  4  4  4
新霉素  ＜2  ＜2  ＜2  ＜2
利福平  8  16  8  8
萘啶酮酸＜2  4  ＜2  4
放线壮观素  32  32  32  16
卡那霉素  ＜2  ＜2  ＜2  ＜2
e  平均生殖时间（分）＝37℃下用通气法（150rpm新型Srunswick平板式摇动器）在Luria液体培养基中测定。
f.抗菌素标准抑制浓度（μg/ml）的测定是在含规定浓度的抗菌素琼脂上，通过将每种菌株划线静止过夜培养。
表11（续）
表型
X3744X4345X3769X4073
以Difco抗血精凝集：
鞭毛抗原H∶1  +  +  +  +
鞭毛抗原H∶2  +  +  +  +
群D因子9  +  +  +  +
群D因子12  +  +  +  +
群D（O-1，9.12）  +  +  +  +
琼脂培养基上的生长特征
菌株于37℃下按静止过夜培养在Luria液体培养基内生长，稀释于缓冲的生理盐水和明胶（BSG）内并涂布于含1%麦芽糖的MacConkey琼脂培养基上以达到形成离体菌落单位（cfu）。所有给定菌株的菌落在其大小和颜色方面表现出是均匀的。由于ΔcyaΔcrp菌株生长速度与其野生型亲代相比较慢，需在37℃的MacConkey培养基上生长～36+小时才可以看见X4073和X4366的菌落。
突变体表型的稳定性
X4073和X4346浓缩50倍的培养物和各种稀度（-109、107、105、103cfu/平板）的培养物涂布于含0.5%麦芽糖、蜜二糖、木糖、甘油糖或鼠李糖之一（不助其生长的）的基本琼脂培养基上（补充以22μg L-精氨酸/ml，22μg L-半胱氨酸/ml和20μg L-色氨酸/ml）。一套复制平板置于UV-照射之下（5焦耳/米2/秒）并在黑暗中于37℃下保温。另外一套用照明于37℃下保温。48小时生长期之后未检测出回复突变体和/或突变体。
菌株的储存
每种菌株维持在1%胨-5%甘油悬浮液态并于-70℃下储存。
动物实验接种物的制备
下面是生长用的标准原始细胞（protocol）和小鼠腹腔（i.P.）接种用的各疫苗菌株及其亲代的悬浮液。
雌性CFM小鼠（18-20g）（charles River，Wilmington，MA）用于测定野生型伤寒沙门氏菌的LD50值和Δcrp-10 Δcya-12衍生物的毒性。静置过夜培养（37℃）用予热的Luria液体培养基以1∶20的比例稀释，并于37℃下通气（150rpm）至到OD600≤0.08。野生型和Δcrp-10 Δcya-12伤寒沙门氏菌细胞悬浮于15%（wt/vol）的猪胃粘蛋白中（American Laboratories，Omaha，NB）15%粘蛋白悬浮液按如下方法配制，中和至PH7，于15p.s.i下120°F高压灭菌10分钟，在添加适当稀释过的伤寒沙门菌细胞之前，还要加入3μg新制备的消毒柠檬铁铵/ml（Sigma，St.Louis，MO）。然后，用23计量针将细胞悬浮液500μl对小鼠腹腔给药。记录72小时内的死亡率数据后，测定野生型亲代和Δcrp-10 Δcya-12衍生物的LD50值。相对于野生型亲代伤寒沙门氏菌突变体的毒性结果见表12。
表12
ISP1820和Ty2伤寒沙门氏菌野生型和Δcrp-11 Δcrp-10菌株的毒性菌株号 基因型 LD150CFU
X3744ISP1820野生型 32
X4200Δcrp-11Δ〔Zhx-1431∷Tn10〕 600
X4300Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/107
pSD110+2
X4323Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 ＞2.8×103
Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕
X4325Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 ＞3.2×106
X4331Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/＞2.3×105
pSD110+
X4346Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 4.4×105
Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕
X3769Ty2野生型 54
X3878ΔcrP-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 1.0×103
X3880Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/＜19
pSD110+
X3927Δcrp-11Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 1.1×104
Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕
X3803Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 1.5×105
表12（续）
ISP1820和Ty2伤寒沙门氏菌野生型和Δcrp-11 Δcrp-10菌株的毒性
菌株号 基因型 LD150CFU
X3824Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕/＞1.9×106
pSD110+
X4073Δcrp-10Δ〔Zhc-1431∷Tn10〕 ＞1.0×105
Δcya-12Δ〔Zid-62∷Tn10〕
1按Reed和Muench法（1938.Am.J.Hyg.21：493-497）的方法计算LD50，收集72小时期间的发病率和死亡率。
2pSD110（Schroeder，C.J.，和W.J.Dobrogosz.1986，J.Bacteriol.167：616-622）是一种pBR322的衍生物，它含有野生型crp+基因及来自鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）的启动子。予先毒性检验表明该质粒能补充猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）和伤寒沙门氏菌（S.typhi）中的crp突变并恢复野生型的毒性水平。
哺乳动物细胞培养的粘附和侵入检验
Δcrp-10  Δcya-12和Δcrp-11  Δcya-12菌株粘附和侵入CHO细胞的能力与野生型亲代菌株对比数据列于表13。伤寒沙门氏菌突变体与野生型亲代菌株相比，在37℃下分别于2小时和4小时间隔范围内粘附和/或侵入CHO细胞的单层能力下降。
与野生型亲代相比突变体在正常人血清内的生长和持久性
完成正常人血清中的生长曲线，该血清予先吸附有野生型伤寒沙门氏菌，每ml的血清中加入大约106cfu的伤寒沙门氏菌Δcya Δcrp和野生型菌株，该血清已在5%CO2仑内于37℃下以HEPES平衡过。补体介导溶菌作用的活性由在60℃下，10分钟时间失活血清证实，60分钟后验证大肠杆菌K-12的生长。在正常的血清中，大肠杆菌K-12细胞60分钟后死去。
更具体说来，X3744（ISP1820野生型），X3769（Ty2野生型）、X4073（Ty2 Δcya-12 Δ〔crp-cysG〕-10）、X4346（ISP1829 Δcya-12 Δ〔crp-cysG〕-10）和X289（E.coli K-12）于37℃，在Luria液体培养基内静止过夜培养生长。人血清分别以同源的野生型伤寒沙门氏菌Ty2和ISP1820菌株X3769和X3744吸附，用20mM HEPES缓冲，再于5个大气压的CO2中保温以供检测。大肠杆菌K-12X289菌株表示补体介导溶菌作用的阳性对照，而同种菌株当在加热失活血清内生长时则作为阴性对照（因其净生长明显）。
图5表示各菌株在24小时的范围内于37℃下的净生长和/或持久性。
菌株的寄存：下面所列材料是按布达佩斯条约的条款寄存，寄存单位为美国典型培养物收集中心（马里兰州，Rockville.Parklawn  Drive  12301）。所示登记号是完成存活试验同时交付所需费用后给定的。在专利申请未决期间按规定条款37CFR1、14和35USC122，由被授权的行政管理官员批准，人们可以得到所述培养物。一旦根据该申请授与专利权后，公众获得所述培养物的一切限制，将不可改变地撤消。而且指定寄存物自寄存之日起可维持30年，或者距最后一个索取者5年之后，或者按该美国专利的实施年限定（以其中时间较长者计）。如果一种培养物变得不能再生存，或由于疏忽而被毁坏，或当菌株含质粒时，而质粒失去，则将允许用分类学上同一种类的存活培养物来代替。本文提到的寄存物只为方便，并不要求根据本文的描述，去实施本发明，另外，这些物质作为参考编入本文。
菌株  寄存日期  ATCC  No.
X39581990.11.2 55224
X43231990.11.2 55115
X39261990.11.2 55112
X39271990.11.2 55117
X42971990.11.2 55111
X43461990.11.2 55113
X39401990.11.2 55119
X40731990.11.2 55118
ISP2822  1990.11.2  55114
ISP1820  1990.11.2  55116
X44171991.11.6 55249
X44351991.11.6 55250
X40731991.11.6 55248
（X4073是复制培养）
工业利用
本发明提供的菌株直间和间接适用于生产致免疫组合物，包括疫苗、予防由伤寒沙门氏菌和其它肠细菌（这些细菌与对伤寒沙门菌的抗体交叉反应）引起的疫病。这些菌株也可用作载体微生物，用于生产在细菌细胞中于重组基因上编码的表达产物。另外，借助于安全性提高，这些菌株适于生产抗体、单克隆和多克隆，以抗伤寒沙门氏菌以及在无毒伤寒沙门氏菌中表达的抗原。

Claims (45)

1、一种适于个体免疫接种的致免疫组合物，包含伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的无毒衍生物，所述衍生物的 cya基因含有一突变，所述组合物在一种生理上允许的赋形剂中。
2、按照权利要求1的致免疫组合物，其中无毒衍生物能表达重组基因，该基因是由对所述个体致病的因子衍生出来的以产生能在，所述脊椎动物门中诱导出抗所述病原体的免疫应答的抗原。
3、一种刺激免疫***对伤寒沙门氏菌（S.typhi）致免疫抗原产生应答的方法，包括向所述个体施用权利要求1的疫苗。
4、一种刺激免疫***对病原体致免疫抗原产生应答的方法，包含向所述个体施用权利要求2的疫苗。
5、一种伤寒沙门氏菌（S.typhi）分离无毒菌株包含在cya基因中的突变。
6、权利要求5的伤寒沙门氏菌（S.typhi）分离无毒菌株，能表达重组基因，该基因是由对所述个体致病的因子衍生出来的，以产生能在所述脊椎动物门对所述病原体诱导免疫应答的抗原。
7、按权利要求6的菌株，其中伤寒沙门氏菌（S.typhi）含有的染色体突变是致死的，由补充致死突变的载体基因所平衡，以构成平衡致死寄主载体（balanced  lethal  host  vector）***。
8、按权利要求7的菌株，其中菌株的细胞：
a）缺少编码β一天冬氨酸半醛脱氢酶（asd）的功能性天然染色体基因;
b）已存在编码功能性Asd多肽的重组基因，该多肽补充染色体asd突变，但它不能通过重组替代有缺陷的染色体基因;
（c）编码功能性Asd多肽的重组基因和致免疫抗原间具有物理连接，当细胞所在环境中，因功能性Asd缺失引起细胞溶解时，其中编码功能性Asd多肽的重组基因的缺失也能引起细胞溶解。
9、一种个体免疫接种的致免疫组合物含伤寒沙门氏菌（S.typhi）无毒的衍生物，该衍生物包含在crp基因中的突变。
10、按权利要求9个体免疫接种的致免疫组合物，其中所述无毒衍生物能表达重组基因，该基因是由对所述个体是致病的因子衍生出来的，以产生在所述脊椎动物门中对所述病原体能诱导免疫应答的抗原。
11、一种刺激免疫***对伤寒沙门氏菌（S.typhi）的致免疫抗原产生应答的方法，包括向所述个体施用权利要求9的致免疫组合物。
12、一种刺激免疫***对病原体的致免疫抗体产生应答的方法包括向所述个体施用权利要求10的致免疫组合物。
13、一种伤寒沙门氏菌（S.typhi）的分离无毒菌株包含在crp基因中的突变。
14、一种权利要求13的伤寒沙门氏菌（S.typhi）的分离无毒菌株能表达重组基因，该基因是由对所述个体是致病的因子衍生出来的，以产生在所述脊椎动物门中对所述病原体能诱导出免疫应答的抗原。
15、按权利要求14的菌株，其中伤寒沙门氏菌（S.typhi）含有的染色体突变是致死的，由补充致死突变的载体基因所平衡，以构成平衡-致死寄主-载体（balanced-lethal  host-Vector）***。
16、按权利要求15的菌株，其中菌株的细胞：
（a）缺少编码β-天冬氨酸半醛脱氢酶（asd）的功能性天然染色体基因;
（b）已存在编码功能性Asd多肽的重组基因该多肽补充染色体asd突变，但是它不能通过重组替代有缺陷的染色体基因;
（c）在编码功能性Asd多肽的重组基因和致免疫基因之间具有物理连接，当细胞所在环境中因功能性Asd缺失引起细菌溶解时，其中编码功能性Asd多肽的重组基因缺失，也能引起细胞溶解。
17、一种个体免疫接种的致免疫组合物包含伤寒沙门氏菌（S.typhi）无毒衍生物，所述衍生物在cya基因中含有突变而在crp基因中也含有突变。
18、按权利要求17的致免疫组合物，其中所述无毒衍生物能表达重组基因，所述基因是由对所述个体致病的因子衍生出来的，以产生在所述脊椎动物门中对所述病原体能诱导出免疫应答的抗原。
19、一种刺激免疫***对伤寒沙门氏菌（S.typhi）致免疫抗原应答的方法包括向所述个体施用权利要求17的致免疫组合物。
20、一种刺激免疫***对病原体致免疫抗原产生应答的方法包括向所述个体施用权利要求18的致免疫组合物。
21、一种伤寒沙门氏菌（S.typhi）的分离无毒菌株，包含在cya基因和crp基因中的突变。
22、权利要求21的伤寒沙门氏菌（S.typhi）分离的无毒菌株，能表达重组基因，所述基因是由对所述个体致病的因子衍生出来的，以产生在所述脊椎动物门中对所述病原体能诱导出免疫应答的抗原。
23、一种按权利要求22的菌株，其中伤寒沙门氏菌（S.typhi）含有的染色体突变是致死的，为补充致死突变的载体基因所平衡，从而构成平衡-致死寄主-载体（balanced-lethal  host-Vector）***。
24、一种按权利要求23的菌株，其中菌株的细胞：
a）缺少编码β-天冬氨酸半醛脱氢酶（asd）的功能性天然染色体基因;
b）已存在编码功能性Asd多肽的重组基因，该多肽能补充染色体asd突变，但它不能通过重组替代有缺陷的染色体基因;
c）在编码功能性Asd多肽的重组基因和致免疫抗原之间有物理连接，当细胞所在的环境中因功能性Asd缺失引起细胞溶解时，其中编码功能性Asd多肽的重组基因的缺失也能引起细胞溶解。
25、一种个体免疫接种的致免疫组合物包含沙门氏菌属（Salmonella）无毒衍生物，该衍生物含在cdt基因中的突变。
26、一种按权利要求25的个体免疫接种的致免疫组合物，其中所述无毒衍生物能表达重组基因，所述基因是由对所述个体致病的因子衍生出来的，以产生能在所述脊椎动物门中对所述病原体诱导出免疫应答的抗原。
27、一种刺激个体免疫***对沙门氏菌属（Salmonella）的致免疫抗原产生应答的方法，包括向所述个体施用权利要求25的致免疫组合物。
28、一种刺激免疫***对病原体致免疫抗原产生应答的方法，包括对所述个体施用权利要求26的致免疫组合物。
29、一种沙门氏菌属（Salmonella）的分离无毒菌株包含在cdt基因中的突变。
30、权利要求29的沙门氏菌属（Salmonella）的分离无毒菌株能表达重组基因，该基因是由对所述个体致病的因子衍生出来的，产生在所述脊椎动物门内对所述病原体能诱导出免疫应答的抗原。
31、一种按权利要求30的菌株，其中沙门氏菌属（Salmonella）含有的染色体突变是致死的，为补充致死的突变的载体基因所平衡，从而构成平衡-致死寄主-载体***。
32、一种按权利要求30的菌株，其中菌株的细胞：
a）缺少编码β-天冬氨酸半醛脱氢酶（asd）的功能性天然染色体基因;
b）已存在编码功能性Asd多肽的重组基因，该多肽补充染色asd突变，但它不能通过重组替代有缺陷的染色体基因;
c）在编码功能性Asd多肽的重组基因和致免疫抗原之间有物理连接，其中当细胞所在环境中因功能性Asd缺乏引起细胞溶解时，编码功能性Asd多肽的重组基因的缺乏也能引起细胞溶解。
33、按权利要求25的致免疫组合物，其中无毒衍生物有crp基因中的突变。
34、按权利要求25的致免疫组合物，其中无毒衍生物有cya基因中的突变。
35、按权利要求33的致免疫组合物，其中无毒衍生物也有cya基因内的突变。
36、按权利要求29的沙门氏菌属的分离无毒菌株，它包含选自cya和crp基因中的一个基因的突变。
37、按权利要求29的沙门氏菌属（Salmonella）的分离无毒菌株，它含有在cya基因和crp基因中的突变。
38、一种致免疫组合物含有权利要求37的菌株和药理上允许的赋形剂。
39、一种分离菌株选自菌株X3958、X4323、X3926、X3927、X4297、X4346、X3940、X4073、X4417和X4435组成的一组及其衍生物。
40、一种含在cya基因中的突变的无毒伤寒沙门氏菌（S.typhi）的菌株的使用方法，该法包括通过悬浮菌株于生理上允许的赋形剂来制备致免疫组合物。
41、一种含在crp基因内的突变的无毒伤寒沙门氏菌（S.typhi）的菌株的使用方法，该法包括通过悬浮菌株于生理上允许的赋形剂来制备致免疫组合物。
42、一种含在cdt基因中的突变的无毒沙门氏菌属（Salmonella）的菌株利用方法，该法包括通过悬浮菌株于生理上允许的赋形剂来制备致免疫组合物。
43、一种按照权利要求41的方法，其中菌株还含有在cya基因中的突变。
44、一种按照权利要求43的方法，其中菌株还含有在cdt基因中的突变。
45、一种伤寒沙门氏菌（S.typhi）的分离菌株，它是一种cdt突变体。
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