CN106338546A - 一种高空间分辨质谱成像装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高空间分辨质谱成像装置，在高精度三维电动样品平台(1)上设有第一高精度三维探针扫描平台(2)和第二高精度三维探针扫描平台(3)，样品(9)位于第一高精度三维探针扫描平台(2)与第二高精度三维探针扫描平台(3)之间，正置物镜(5)位于样品(9)的上部，倒置物镜(4)位于样品(9)的下部，扫描探针(6)位于样品(9)的一侧，由光纤(7)连接至光源(8)；毛细吸管(10)位于样品(9)的另一侧，与质谱(11)连接。本发明装置可以方便的实现高空间分辨率多模态成像，有望广泛用于单细胞、组织等的高分辨成像分析。

Description

一种高空间分辨质谱成像装置
技术领域
本发明涉及超衍射极限聚焦、质谱成像及多模态成像领域，具体是一种利用扫描探针和对置物镜***构建质谱离子源，通过扫描探针将激发光聚焦到亚波长范围对样品进行激发，通过样品平台的高精度扫描实现高空间分辨的质谱成像。
背景技术
最早的质谱成像技术出现在1997年，利用基质辅助激光解吸电离(MALDI，matrixassisted laser desorption ionization)实现质谱分子成像。该技术通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。后来，二次离子质谱(SIMS，secondary ion mass spectrometry)成像方法出现，可以对样品进行完整扫描，三维成像。虽然SIMS可以达到几个纳米的分辨率，但是SIMS需要高真空条件，而且对分析的样品成分有一定的限制。微纳技术的发展，利用基底表面辅助激光解吸附/离子化(Surface-assisted laser desorption/ionization，SALDI)的研究越来越多，例如Scripps研究所提出的Nanostructure-initiator mass spectrometry(NIMS)，乔治华盛顿大学的Vertes提出的laser-induced silicon microcolumn arrays(LISMA)质谱，Silicon nanopostarray(NAPA)辅助解吸/离子化质谱等。这些方法主要利用了光与硅纳米结构基底的相互作用，特别是通过对光能量分布的调控以对局域的样品进行烧蚀(ablation)，以及通过纳米结构基底与样品之间的电子转移以离子化来实现。但是这些方法所用激光的光斑大小在微米量级，空间分辨率一般在5微米左右，在生物医学中仅用于组织成像，对单个细胞等需要高空间分辨率的样品仍然无能为力(大的***如鸵鸟蛋、鸡蛋等除外)。因此质谱成像分辨率的提高是一个难点和普遍关注的问题，亚微米级分辨的质谱成像将使单细胞的非标记成像分析实现突破，并为质谱成像和单细胞分析的发展打开更为广阔的空间。
发明内容
技术问题：为了提高样品质谱成像空间分辨率，获得更丰富的样品质谱信息，本发明提供了一种实现高空间分辨质谱成像的设备，以解决现有质谱成像方法需要高真空，分辨率低，需要基质以及成像模态单一等问题。
技术方案：本发明的一种高空间分辨质谱成像装置主要包括高精度三维电动样品平台，第一高精度三维探针扫描平台和第二高精度三维探针扫描平台，倒置物镜，正置物镜，扫描探针，光纤，光源，毛细吸管和质谱；其中，在高精度三维电动样品平台上设有第一高精度三维探针扫描平台和第二高精度三维探针扫描平台，样品位于第一高精度三维探针扫描平台与第二高精度三维探针扫描平台之间，正置物镜位于样品的上部，倒置物镜位于样品的下部，扫描探针位于样品的一侧，由光纤连接至光源；毛细吸管位于样品的另一侧，与质谱连接。
所述的质谱，其离子源为基质辅助激光解吸附离子化(MALDI)离子源或者表面辅助激光解吸附离子化(SALDI)离子源，激发光通过扫描探针激发样品，扫描探针发出的激发光经过近场光学结构或者超表面聚焦到亚波长范围内，激发样品。
所述第一高精度三维探针扫描平台与第二高精度三维探针扫描平台位于高精度三维电动样品平台上，处在相对位置；质谱成像过程中，通过高精度三维探针扫描平台将扫描探针定位到样品表面，毛细吸管通过第二高精度三维探针扫描平台精确定位到扫描探针尖端位置吸取激发的样品，通过高精度三维电动样品平台对样品进行逐点扫描，激发光激发出的样品通过毛细吸管进入质谱。
所述高精度三维电动样品平台带有透明样品池，可以通过倒置物镜对样品进行观察，观察方式为荧光、暗场、相差、DIC、全内反射荧光、超分辨荧光或者明场。
所述正置物镜位于样品的上部，通过正置物镜对样品进行观察，观察方式为荧光、暗场、DIC、相差、或者明场；通过正置物镜对扫描探针进行观察，辅助扫描探针的定位以及对样品的扫描。
所述光源为纳秒、皮秒或者飞秒脉冲激光光源，波长范围在紫外到近红外150nm～3000nm，激发光通过光纤波导进入扫描探针对对样品进行激发，或通过正置物镜或者倒置物镜远场投射到扫描探针上对样品进行激发。
所述扫描探针通过调音叉反馈对样品形貌进行AFM或者扫描近场成像，扫描探针或通过偶联电化学工作站完成扫描电化学成像。
所述倒置物镜和正置物镜偶联光谱仪采集样品光激发过程中的光谱信号，或同步实现光谱学成像。
所述质谱成像的离子源是大气压离子源，或是真空离子源，真空离子源时高精度三维电动样品平台，第一高精度三维探针扫描平台、第二高精度三维探针扫描平台、扫描探针位于真空腔中；毛细吸管上施加辅助电场或者加热以辅助离子的运输；激发光激发出的样品通过毛细吸管直接进入质谱，或进入质谱之前二次离子化，二次离子化的方式可以是电喷雾或者激光电离。
扫描探针具有超表面或者近场光学结构，能够对光进行亚波长聚焦，样品激发所用激光光源通过扫描探针聚焦到亚波长范围内，实现对样品的高空间分辨激发。同时，扫描探针也可以对样品表面的形貌进行AFM成像或者电化学成像。毛细吸管通过高精度三维探针扫描平台精确定位到扫描探针尖端的激发位点，将激发的样品吸入质谱进行进一步离子化或者质荷比分析。倒置物镜和正置物镜构成双物镜模块，方便从样品的上表面和下表面观察样品以及扫描探针的定位，同时也可以从双物镜激发样品或者收集样品激发过程中的光谱信号。
有益效果：与现有的质谱成像装置相比，本发明装置可以利用近场光学扫描探针或者具有超表面结构的扫描探针实现样品的亚波长激光解吸附和离子化；该装置高精度三维电动样品平台和高精度三维探针扫描平台可以分别控制和精确定位，从个人可以对样品进行精确三维扫描，大大降低了质谱成像过程中的操作与控制复杂性；装置的双物镜***和光学扫描探针不但保证了灵活多变的激发模式，例如远场激发和近场激发都可以使用，另外也保证了样品和探针、毛细吸管调整过程中的监控方便性，同时还保证了获取光学信息的多通道与多光路，也就是信息获取方便性。本装置可以很方便的与光谱成像与电化学成像***偶联，从而可以在一个装置上实现对样品的多模态成像，保证了信息获取的全面性。由于本装置有双扫描探针平台和双物镜***，因此***的开放性非常强，可以方便的根据应用需求设置仪器，使用灵活。
附图说明
图1为本发明装置的总体结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明做详细说明：
如图1所示，为本发明装置的总体结构示意图，所述装置包括高精度三维电动样品平台1，第一高精度三维探针扫描平台2和第二高精度三维探针扫描平台3，倒置物镜4，正置物镜5，扫描探针6，光纤7，光源8，毛细吸管10和质谱11。倒置物镜4位于一个倒置显微镜上，正置物镜5位于一个正置显微镜上，正置显微镜通过架子架在倒置显微镜正上方，两个物镜通过光路调中，共享同一个光轴。高精度三维电动样品平台1安装在倒置显微镜上，扫描范围为80μm X 80μm，然后在评上安装第一高精度三维探针扫描平台2和第二高精度三维探针扫描平台3，并使两者相对，第一高精度三维探针扫描平台2和第二高精度三维探针扫描平台3上分别固定有调音叉反馈器并与扫描探针6和毛细吸管10相连；第一高精度三维探针扫描平台2和第二高精度三维探针扫描平台3扫描范围同为30μm X 30μm。355nm脉冲激光光源脉宽5ns，单脉冲能量100mJ通过单模光纤耦合至近场光学扫描探针6，探针的尖端有含有100nm微孔牛眼透镜结构，激发光通过牛眼透镜结构聚焦到样品9上，激发焦点的大小在100nm左右。
在进行质谱成像的时候，将细胞的切片放置在高精度三维电动样品平台1上，通过60倍倒置物镜4观察细胞的位置，通过50倍正置物镜5观察扫描探针6的位置和毛细吸管10的位置，调节控制器，移动扫描探针6至样品的上方，开启AFM模式，对样品进行表面形貌扫描，并定位扫描探针6至细胞切片表面的一个起始点。在正置物镜5的观察下，移动尖端10μm内径毛细吸管10至扫描探针6的附近，并使毛细吸管10接近至扫描探针6探头距离2μm处。开启激光光源8脉冲，对样品进行激发，于此同时同步质谱的分析，得到该点的质谱图。控制高精度三维电动样品平台1移动200nm，并同步激光脉冲和质谱探测，得到第二个点的质谱图。最后通过扫描若干位点的质谱图，通过数据处理软件，重构质谱成像图。
在进行拉曼光谱与质谱双模态成像的时候，将细胞的切片放置在高精度三维电动样品平台1上，通过60倍倒置物镜4观察细胞的位置，通过50倍正置物镜5观察扫描探针6的位置和毛细吸管10的位置，调节控制器，移动扫描探针6至样品的上方，开启AFM模式，对样品进行表面形貌扫描，并定位扫描探针6至细胞切片表面的一个起始点。在正置物镜5的观察下，移动尖端10μm内径毛细吸管10至扫描探针6的附近，并使毛细吸管10接近至扫描探针6探头距离2μm处。拉曼共聚焦显微镜与正置物镜5连接。首先通过正置物镜激发扫描探针6尖端位置样品的拉曼光谱，然后，开启激光光源8脉冲，对样品进行激发，于此同时同步质谱信号采集，得到该点的质谱图。控制高精度三维电动样品平台1移动200nm，采集拉曼光谱后，同步激光脉冲和质谱探测，得到第二个点的拉曼光谱和质谱信号。依次类推，完成对整个样品的扫描，最后，通过数据处理软件，重构样品的拉曼光谱图像和质谱成像图。

Claims (9)

1.一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：该装置主要包括高精度三维电动样品平台(1)，第一高精度三维探针扫描平台(2)和第二高精度三维探针扫描平台(3)，倒置物镜(4)，正置物镜(5)，扫描探针(6)，光纤(7)，光源(8)，毛细吸管(10)和质谱(11)；其中，在高精度三维电动样品平台(1)上设有第一高精度三维探针扫描平台(2)和第二高精度三维探针扫描平台(3)，样品(9)位于第一高精度三维探针扫描平台(2)与第二高精度三维探针扫描平台(3)之间，正置物镜(5)位于样品(9)的上部，倒置物镜(4)位于样品(9)的下部，扫描探针(6)位于样品(9)的一侧，由光纤(7)连接至光源(8)；毛细吸管(10)位于样品(9)的另一侧，与质谱(11)连接。
2.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述的质谱(11)，其离子源为MALD离子源或者SALDI离子源，激发光通过扫描探针(6)激发样品(9)，扫描探针(6)发出的激发光经过近场光学结构或者超表面聚焦到亚波长范围内，激发样品(9)。
3.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于所述第一高精度三维探针扫描平台(2)与第二高精度三维探针扫描平台(3)位于高精度三维电动样品平台(1)上，处在相对位置；质谱成像过程中，通过高精度三维探针扫描平台(2)将扫描探针(6)定位到样品表面，毛细吸管(10)通过第二高精度三维探针扫描平台(3)精确定位到扫描探针(6)尖端位置吸取激发的样品，通过高精度三维电动样品平台(1)对样品(9)进行逐点扫描，激发光激发出的样品通过毛细吸管(10)进入质谱(11)。
4.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述高精度三维电动样品平台(1)带有透明样品池，可以通过倒置物镜(4)对样品(9)进行观察，观察方式为荧光、暗场、相差、DIC、全内反射荧光、超分辨荧光或者明场。
5.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述正置物镜(5)位于样品(9)的上部，通过正置物镜(5)对样品(9)进行观察，观察方式为荧光、暗场、DIC、相差、或者明场；通过正置物镜(5)对扫描探针(6)进行观察，辅助扫描探针(6)的定位以及对样品(9)的扫描。
6.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述光源(8)为纳秒、皮秒或者飞秒脉冲激光光源，波长范围在紫外到近红外150nm～3000nm，激发光通过光纤(7)波导进入扫描探针(6)对对样品(9)进行激发，或通过正置物镜(5)或者倒置物镜(4)远场投射到扫描探针(6)上对样品(9)进行激发。
7.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述扫描探针(6)通过调音叉反馈对样品(9)形貌进行AFM或者扫描近场成像，扫描探针(6)或通过偶联电化学工作站完成扫描电化学成像。
8.根据权利要求1所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述倒置物镜(4)和正置物镜(5)偶联光谱仪采集样品(9)光激发过程中的光谱信号，或同步实现光谱学成像。
9.根据权利要求2所述的一种高空间分辨质谱成像装置，其特征在于：所述质谱成像的离子源是大气压离子源，或是真空离子源，真空离子源时高精度三维电动样品平台(1)，第一高精度三维探针扫描平台(2)、第二高精度三维探针扫描平台(3)、扫描探针(6)位于真空腔中；毛细吸管(10)上施加辅助电场或者加热以辅助离子的运输；激发光激发出的样品通过毛细吸管(10)直接进入质谱(11)，或进入质谱之前二次离子化，二次离子化的方式可以是电喷雾或者激光电离。
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