CN106337089A - 一种用于缺血性脑卒中诊断的lncRNA - Google Patents
一种用于缺血性脑卒中诊断的lncRNA Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于缺血性脑卒中诊断的lncRNA,该lncRNA为LOC105376505。本发明首次发现LOC105376505基因与缺血性脑卒中的发生发展相关,在缺血性脑卒中患者中表达下调,进一步丰富了缺血性脑卒中发病机制的研究。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种用于缺血性脑卒中诊断的lncRNA,具体地该lncRNA为LOC105376505。
背景技术
脑血管病与心血管病及肿瘤一起是严重危害人类健康的三大疾病之一,其具有高发病率、高致残率与高死亡率的特点,同时也与心血管病及肿瘤一起是人类三大死亡原因之一。脑血管病主要是由于脑组织血液循环障碍而导致局部神经功能缺失的神经***疾病,可分为急性脑血管病及慢性脑血管病。急性脑血管疾病又常被称为脑卒中,在美国,每年约80万人患有脑卒中类疾病,且发病率随着年龄的增加而增加,这给其不断老年化的社会带来严重的问题。在中国,脑血管病发病率逐年上升,已占据人口致死和致残原因的第一位。而随着经济水平的快速发展,我国人口老龄化问题的不断加重,以及不健康的生活方式等众多因素,使得缺血性脑血管病发病率逐年增长。脑卒中又可分为缺血性脑卒中(ischemic Stroke,IS)和出血性脑卒中(Hemorrhagic Stroke)。缺血性脑卒中占全部脑卒中发病率的80%左右,并且其发病率随年龄的增长而增高。缺血性脑卒中的发生主要是由于脑栓塞及局部血栓的形成,这可能是由动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)引起的血管狭窄、血栓栓塞,或者是来源于心脏的栓子随血流至脑部引起脑栓塞;而各种原因造成的血管损伤、血管炎症也是重要原因之一。诸多原因引起脑部血液供应障碍,而造成受损脑组织的不可逆性损害,使得脑组织缺血、缺氧导致最终坏死,给患者造成一系列的神经功能缺损和障碍。
缺血性脑卒中是遗传因素和环境因素共同作用的多因子复杂疾病,除了环境因素的影响以外,遗传因素在脑卒中的发病过程中起着十分重要的作用,现有许多分子遗传学研究也表明了脑卒中的发生具有很高的遗传易感性。遗传因素可能是通过对传统因素的诱发,或者做为独立风险因素,最终影响到组织器官。目前缺血性脑卒中的诊断多依赖于脑CT扫描、脑MRI检查、DSA、MRA、经颅多普勒超声检查等,如何对更早的缺血性脑卒中进行诊断及预防,是目前研究的重要课题。
最近人们发现,在人类基因组中除了有microRNA这一具有强大调控和表观遗传修饰功能的微小非编码RNA的存在,还存在着数以万计的另一种非编码RNA即长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)长链非编码是一类转录本长度超过200nt的RNA分子,它们不具有编码蛋白的功能。lncRNA起初被认为是RNA聚合酶II转录的副产物,是基因组转录的“噪音、垃圾”,不具有生物学功能。然而,最近的研究表明,它们可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰、转录后调控、RNA干扰、印迹基因等多种不同的机制、在多种层面上影响基因的表达水平。因此,lncRNA可能成为缺血性脑卒中研究的新方向。现有技术中已经报道microRNA在缺血性脑卒中发生发展以及耐药中具有重要作用,但是同样作为非编码产物的lncRNA,其生物学功能以及其在缺血性脑卒中发生发展过程中的作用却不清楚,需要进一步的研究。
目前,在患病组织中发现的异常表达的lncRNA可涉及全身各个***,分布较为广泛,但是由于lncRNA数量庞大,目前针对lncRNA在脑卒中领域中的研究仍处在起步阶段,因此探寻LncRNA缺血性脑卒中的分子基础具有重要意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一,提供一种检测长链非编码RNALOC105376505的产品,为实现缺血性脑卒中的早期诊断提供基础。
本发明的目的之二,提供一种缺血性脑卒中的诊断方法,通过检测lncRNALOC105376505的表达水平来诊断患者是否患有缺血性脑卒中。
本发明的目的之三,提供一种分子标志物,作为疾病检测的指标应用于临床。
本发明的目的之四,提供一种与缺血性脑卒中的发生发展密切相关的基因,为缺血性脑卒中的科学研究提供了理论依据。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了长链非编码RNA LOC105376505在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用。其中,LOC105376505指基因或从该基因转录的mRNA,在人类中,位于11号染色体短臂第1区第5带第5亚带上。
进一步,所述LOC105376505的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步,所述LOC105376505在缺血性脑卒中患者中表达下调。
进一步,所述产品包括:通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测LOC105376505基因的表达水平。
进一步,所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中,PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR),TMA和NASBA直接扩增RNA。
通常,PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环,以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数;RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA),然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝;TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝,其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝,TMA任选地包括使用阻断,部分、终止部分和其他修饰部分,以改善TMA过程的灵敏度和准确度;LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接,以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物;SDA使用以下步骤的多个循环:引物序列对与靶序列的相反链进行退火,在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物,半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻,以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链,从而引起产物的几何扩增。
本发明提供了一种体外检测样本中上述lncRNA LOC105376505表达水平的产品,所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。所述“样本”包括细胞、组织、脏器、脑脊液、体液(血液、淋巴液等)、消化液、咳痰、肺胞支气管清洗液、尿、粪便等。优选的,所述样本为组织、血液。在本发明的具体实施方式中,所选样本为血液。
进一步,所述制剂、芯片或试剂盒包括针对LOC105376505的特异性引物对或探针。
进一步,所述特异性引物对的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
进一步,所述特异性引物对对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
本发明提供了一种上面所述的产品在制备诊断缺血性脑卒中的工具中的应用。
本发明中“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出,术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性,探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记,其范围包括引物。杂交方式,包括,但不限于:溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里,所谓“互补”,只要是杂交即可,可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%以上、特别优选100%的同源性。这些探针可以是DNA,也可以是RNA,另外,可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid,肽核酸)、LNA(注册商标,locked nucleic acid,Bridged Nucleic Acid,交联化核酸)、ENA(注册商标,2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid,甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid,苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。
术语“同源性”是指互补性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即,同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可通过在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、液相杂交等)进行检查。基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子在低严格性条件下与靶标的结合(即,杂交)。这并非是说,低严格性条件是使得允许非特异性结合的条件;低严格性条件要求两个序列彼此之间的结合为特异性(即,选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上非互补(例如,低于约30%同一性)的第二靶标进行测试;在不存在非特异性结合的情况下,探针将不与第二非互补靶标杂交。
本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即,核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响:核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。
本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括LOC105376505基因在内的多个基因(例如,与缺血性脑卒中相关的多个基因)的表达水平,将缺血性脑卒中的多个标志物同时进行检测,可大大提高缺血性脑卒中诊断的准确率。
本领域技术人员将认识到,本发明的实用性并不局限于对本发明的标志物基因的任何特定变体的基因表达进行定量。作为非限制性的实例,标志物基因可具有SEQ ID NO.1指定的cDNA序列。在一些实施方案中,其具有与所列的序列至少85%相同或相似的cDNA序列,诸如上述所列的序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%相同或相似的cDNA序列。
本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如,ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本,并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交,然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学,对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针,以同时检测两种或更多种转录本。
术语“微阵列”,包括但不限于:DNA微阵列(例如,cDNA微阵列和寡核苷酸微阵列)、蛋白质微阵列、组织微阵列、转染或细胞微阵列、化学化合物微阵列和抗体微阵列。通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片的DNA微阵列是微观DNA点的集合,这些点连接到固体表面(例如,玻璃、塑料或硅芯片)上,形成用于对数千种基因同时进行表达谱分析或表达水平监测的阵列。固定的DNA片段称为探针,其数千个可用于单个DNA微阵列中。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达而识别疾病基因或转录本(例如,ncRNA)。微阵列可使用多种技术加以制造,包括但不限于:用细尖针印刷到载玻片上、使用预制的掩模进行光刻、使用动态微镜器件进行光刻、喷墨印刷或微电极阵列上的电化学方法。
将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂,在基质凝胶上通过电泳分离,然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹,其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合,而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。
本发明中的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。
本发明的优点和有益效果:
本发明发现了一种诊断缺血性脑卒中的分子标志物,通过检测标志物LOC105376505的表达水平即可对早期缺血性脑卒中进行判断,从而进行早期干预,提高患者的生存率。
本发明提供了一种与缺血性脑卒中的发生发展密切相关的基因,为缺血性脑卒中的科学研究提供了理论依据。
附图说明
图1显示利用芯片筛选缺血性脑卒中患者的差异表达基因;
图2显示利用QPCR检测LOC105376505在缺血性脑卒中患者中的表达情况。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与缺血性脑卒中相关的基因标志物
1、样品收集
各收集10例正常人血液和缺血性脑卒中患者的血液,患者均知情同意,上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
1)临床血清样本收集后12000rpm高速离心10min,重复2次,所得血清样本-80℃保存;
2)冻存血清样本4℃解冻;
3)吸取250μ1的血清样本至1.5m1EP管,加750μ1Trizol LS Reagent,吹打混匀,静置5min;
4)加氯仿(CHCl3:trizol 250μ1:750μ1),颠倒混匀,静置15min;
5)4℃,12000rpm,离心15min;
6)小心吸取上层液体至一新EP管;
7)加适量异丙醇(异丙醇:trizo1 500μ1:750μ1),颠倒混匀,静置10min;
8)4℃,12000rpm离心10min;
9)弃上层离心液,加75%乙醇(RNA酶灭活);
10)4℃,8000rpm离心5min;
11)保留沉淀,弃上层离心液,室温静置5-10min;
12)适量DEPC水溶解沉淀,取适量RNA溶液测浓度及观察RNA抽提情况;
13)标记名称、浓度及日期,-80℃保存。
3、逆转录和标记
用Low RNA Input Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA,同时用Cy3分别标记实验组和对照组。
4、杂交
基因芯片采用康城生物-Human lncRNA Array,按芯片使用说明书的步骤进行杂交。
5、数据处理
杂交后芯片用Agilent扫描仪扫描,分辨率为5μm,扫描仪自动以100%和10%PMT各扫描1次,2次结果Agilent软件自动合并。扫描图像数据采用Feature Extraction进行处理分析,得到的原始数据应用Bioconductor程序包进行后续数据处理。最后Ratio值为实验组和对照组。差异基因筛选标准:ratio≥4为上调基因,ratio≤0.25为下调基因。
6、结果
结果如图1所示,与健康人血液相比,LOC105376505在缺血性脑卒中患者中的表达水平显著低于健康人的表达水平。
实施例2 QPCR测序验证LOC105376505基因的差异表达
1、对LOC105376505基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择正常人和缺血性脑卒中患者的血样样本各100例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录:
(1)逆转录反应:
采用25μl反应体系,每个样品取1μg总RNA作为模板RNA,在PCR管中分别加入以下组分:DEPC水,5×逆转录缓冲液,10mM dNTP,0.1mM DTT,30μM Oligo dT,200U/μl M-MLV,模板RNA。42℃孵育1h,72℃10min,短暂离心。
(2)引物设计:
LOC105376505基因的引物序列为:
正向引物:5’-AACTGAAGAACCACAAGAGAAG-3’(SEQ ID NO.2)
反向引物:5’-TTGCTGTCCAGGAGAAGG-3’(SEQ ID NO.3)
管家基因GAPDH的引物序列为:
正向引物:5’-CCGGGAAACTGTGGCGTGATGG-3’(SEQ ID NO.4)
反向引物:5’-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGTT-3’(SEQ ID NO.5)
(3)QPCR扩增检验:
采用25μl反应体系,每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
配制以下反应体系:SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl,正反向引物(5μM)各1μl,模板cDNA 2.0μl,无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。
扩增程序为:95℃60s,(95℃15s,60℃15s,72℃45s)×40个循环。
以SYBR Green作为荧光标记物,在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,ΔΔCT法进行相对定量。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图2所示,与健康人相比,LOC105376505基因在缺血性脑卒中患者中表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05),同RNA-sep结果一致。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学医学院第一附属医院
<120> 一种用于缺血性脑卒中诊断的lncRNA
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2283
<212> DNA
<213> 人源
<400> 1
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Claims (10)
1.长链非编码RNA LOC105376505在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述LOC105376505的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述LOC105376505在缺血性脑卒中患者中表达下调。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述产品包括:通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测LOC105376505基因的表达水平。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。
6.一种体外检测样品中的权利要求1或2所述的lncRNA LOC105376505表达水平的产品,其特征在于所述产品包括制剂、芯片、或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的产品,其特征在于,其特征在于,所述制剂、芯片或试剂盒包括针对LOC105376505的特异性引物对或探针。
8.根据权利要求7所述的产品,其特征在于,所述特异性引物对的序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。
9.根据权利要求7或8所述的产品,其特征在于,所述特异性引物对对用于SYBR Green、Taqman探针、分子信标、双杂交探针、复合探针的检测。
10.权利要求6-9任一项所述的产品在制备诊断缺血性脑卒中的工具中的应用。
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