CN106318997A - 硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP的高效制备、纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种运用生物酶催化法高效制备、纯化硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP的方法。本发明利用基因工程技术首先高效量产生物酶，即环二核苷酸cGAMP合成酶（cGAS），进而合成腺苷（鸟苷）5’-（α-硫代/硒代磷酸）三磷酸盐，然后运用该生物酶cGAS催化合成高效、专一性硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP，提供大规模、高产率、低成本、条件温和、快速简便的制备硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP的方法。本发明制备的硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP是人体天然免疫信号通路cGAS-STING-IRF3中STING的有效激活剂，能激活和增强该天然自身免疫***，具有较广泛的抗病毒、抗肿瘤等生物活性，具有良好的药物开发前景。

Description

硫（硒）代磷酸环二核苷酸 cGAMP 的高效制备、纯化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体为一种运用生物酶催化法高效制备、纯化硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP的方法。

背景技术

细菌和病毒的核酸会引发宿主免疫反应，宿主通过对病原体产生的核酸感应启动免疫反应。最近的研究表明环GMP-AMP 合成酶（cGAS）是一种关键的细胞质DNA 感测器。cGAS 由双链DNA 激活，催化合成一种非经典的环二核苷酸2’,3’-cGAMP。cGAMP 作为第二信使通过与内质网膜上的受体蛋白STING 结合促进对干扰素β和其他细胞因子的感应。关于STING 调节信号传导的模型表明受体的结合会引发STING 的构象变化，导致信号复合物中蛋白激酶TBK1 的召集和激活。转录因子IRF3 也随之进入信号复合物并被TBK1 磷酸化，磷酸化的IRF3 形成低聚体并转运至细胞核中，启动干扰素β的表达。干扰素β能够调控超过两百种干扰素刺激基因的表达，它们能够下调蛋白质的合成、促进细胞生长停滞和诱导细胞凋亡，从而形成一种抗病毒的状态来控制病毒的传播。

在STING介导信号传导的模型中的研究表明，cGAMP的结合会导致STING发生变构效应，从而导致信号复合物中蛋白激酶TBK1的富集和激活，进而导致转录因子干扰素调控因子3（IRF3）的磷酸化，磷酸化的IRF3会发生寡聚并转运进入细胞核中，其在细胞核内能够诱导β干扰素（IFN-β）的表达，而IFN-β对200多种干扰素诱导细胞因子基因的表达具有调节作用，从而通过下调肿瘤细胞内蛋白的表达、使得肿瘤细胞生长停滞和诱导肿瘤细胞凋亡来体现其抗肿瘤的功能。IFN-β已经被FDA批准应用于白血病、多发性硬化症等的临床治疗，而cGAMP作为STING的激活剂，增强人体先天性免疫，诱导I-型干扰素的上调表达，进而激活T细胞。因此，cGAMP具有应用于抗肿瘤临床治疗的巨大潜质。最近的两项研究表明依赖于STING通路的胞质DNA传感能够调节先天性免疫对于免疫原性肿瘤细胞的识别功能，并且能够通过激活I型干扰素依赖的免疫效应成为放射性治疗的辅助疗法。树突状细胞是体内最主要的呈递肿瘤相关抗原的一类抗原呈递细胞，当树突状细胞暴露于危险或炎症信号时，它们对这项任务具有高度敏感性，能够引起CD8+ T细胞的交叉激活反应。I型干扰素（包含干扰素α和干扰素β）作为一类众所周知的免疫激活因子家族，能够对树突状细胞诱导的交叉免疫产生最有效的活化作用。近期的体内和体外研究都表明I型干扰素诱导的针对肿瘤特异性抗原的树突状细胞交叉免疫反应是肿瘤免疫监控的一种关键的机制，并且能够促进CD8+ T细胞的肿瘤杀伤作用。最近，我们研究发现硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP显示比cGAMP更强的抗肿瘤、抗病毒活性。 因此，硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP在抗肿瘤、抗病毒药物开发领域具有潜在的重要应用价值。

发明内容

1. 鼠源cGAMP合成酶cGAS的规模化制备

2、运用重组的鼠源环二核苷酸cGMP-AMP合成酶cGAS催化,规模化制备硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP。

3、硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP高效分离纯化方法。

附图说明

图 1 是硫（硒）代磷酸环二核苷酸 cGAMP 的分子结构图

具体实施方式

实施例 1 ：鼠源 cGAMP 合成酶 cGAS 的高效制备

（ 1 ）鼠源环二核苷酸cGAMP合成酶cGAS基因从美国ATCC公司购买，通过基因工程手段将其成功克隆至购于Novagen公司的pET-28(a)载体内，鼠cGAS基因N-末端带有SMT3融合标签，SMT3标签蛋白上含有6个组氨酸Ni-NTA柱亲和标签。基因测序结果表明我们成功构建了鼠源环二核苷酸cGAMP合成酶cGAS基因表达质粒。

（ 2 ）接种：以大肠杆菌 BL21 (DE3)为宿主菌（购于Novagen公司），转化、挑斑于LB培养基培养。用于接种的摇瓶培养液使用浓度为 25 g/L 的 LB 培养液。摇瓶置于全控温摇床，240 rpm 振荡培养过夜。种子的 OD600 测定值在 2－4 之间。接种量为工作体积的 2%-5%。

（ 3 ）发酵罐培养 E. coli表达蛋白：

使用台式发酵罐培养 E. coli流加培养用的20 L 罐体及 Rushton 搅拌桨。控制调节搅拌转速、温度、pH、溶氧、泡沫 / 液位、三个蠕动泵及通气等。通过一个热质量气体流量计（TMFC）能提供供气控制。初始培养基成分为：磷酸二氢钠（NaH2PO4，3.5 g/L）， 磷酸氢二钠（Na2HPO4，5.0 g/L），硫酸铵（(NH4)2SO4，5.0 g/L）， 酵母抽提物 (5.0 g/L)，消泡剂。高温灭菌冷却后，添加：硫酸镁（25% 溶液，最终浓度为 4 ml/L），葡萄糖，（10g/L, 通常加入 50% 的溶液），K-12 微量金属（最终浓度为 1 ml/L），硫胺（加入量根据储备液浓度决定，最终浓度为 2.2 mg/L），二水氯化钙（加入量根据储备液浓度决定，最终浓度为 0.15g/L）。【K-12 微量金属溶液，包括 : 氯化钠（NaCl，5 g/L），七水硫酸锌（ZnSO4-7H2O，1 g/L），四水氯化锰（MnCl2-4H2O，4 g/L），六水氯化铁（FeCl3-6H2O，4.75 g/L），五水硫酸铜（CuSO2-5H2O，0.4 g/L），硼酸（H3BO3，0.575 g/L），二水钼酸钠（NaMoO4-2H2O，0.5 g/L），6N 硫酸（H2SO4，~ 12.5 ml/L）。】

控制参数设定值：发酵运行时间为 22 小时，控制温度为37°C, pH 为 7.0, DO 为 30%。初始搅拌转速为 200rpm，其后由 DO 关联控制转速。初始培养 5 小时后，开始进行流加培养，发酵 5 小时后，随着碳源的耗尽，pH 值止于 7.1，BioCommand® 程序自动开启补料泵。DO 和pH 也被精确控制。培养 E. coli 获得的菌体干重为 25 g/L。

（ 4 ）鼠源cGAS酶蛋白纯化

菌体细胞溶于50mM Tris.HCl（pH 7.5）,用细胞破碎仪破碎细胞，高速离心后得到含蛋白的上层清夜，然后用Ni-NTA（购于Qiagen公司）亲和柱初步分离纯化cGAS蛋白，用SDS-Page分析蛋白纯度（85%），进而用SUMO蛋白酶（购于Qiagen公司）酶切除去SMT3融合标签蛋白，再进行第二次Ni-NTA亲和柱分离纯化。 最后用HiLoad^TM Superdex 75 凝胶柱进一步纯化，得到95%纯度cGAS酶蛋白，冷冻干燥后保存与-80度超低温冷藏柜。

实施例 2: 腺苷 ( 鸟苷 )5 ’ - α硫代（硒代）磷酸三磷酸的制备

腺苷(鸟苷) 5’-α硫代（硒代）磷酸三磷酸按照文献方法合成 (Caton-Williams Julianne 等， Science China, Chemistry, 2012, 55(1), 80-89; Boyle Nicholas A., Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2005, 24, 1651-1664.)。

实施例 3: 运用重组的鼠源环二核苷酸 cGMP-AMP 合成酶 cGAS 催化 , 制备硫 ( 硒 ) 代磷酸环二核苷酸 cGAMP

运用制备的鼠源重组cGAS酶催化，高效专一性地制备硫(硒)代磷酸环二核苷酸cGAMP。反应体系为20升生物酶反应器，反应体系含鼠源cGAS （10 mM）, 腺苷5’-α硫代（硒代）磷酸三磷酸二钠盐（10 mM）, GTP 【或 鸟苷5’-α硫代（硒代）磷酸三磷酸二钠盐】(10 mM), MgCl2 (10 mM), DNA (0.2mg/ml), NaCl (100 mM)，反应温度37度，时间8小时。用分光光度计在260nm检测产物和反应物，反应产率95%以上。

4 、硫 ( 硒 ) 代磷酸环二核苷酸 cGAMP 规模化高效分离纯化方法

用100毫升体积离子交换柱(购于GE公司)分离纯化，梯度洗脱硫(硒)代磷酸环二核苷酸cGAMP,得到纯度高于95%的硫(硒)代磷酸环二核苷酸cGAMP。用-50度冷冻干燥机冷冻干燥后获得约250克硫(硒)代磷酸环二核苷酸cGAMP冻干白色粉末样品。

Claims (4)

1.硫代（硒代）磷酸环二核苷酸cGAMP的高效规模化制备方法。

2. 鼠源cGAMP合成酶cGAS的高效制备方法。

3.运用环二核苷酸cGAMP合成酶cGAS催化,规模化制备硫代（硒代）磷酸环二核苷酸cGAMP的方法。

4.硫代（硒代）磷酸环二核苷酸cGAMP高效分离纯化方法。