CN106317063A - 一种反应型汞离子荧光探针的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种反应型汞离子荧光探针及其制备方法和应用。该方法包括:(1)将5‑氨基苯基‑10,15,20‑三磺酸基苯基卟啉(PNH2)溶于蒸馏水中,形成7.5mg/mL的溶液,将三光气溶于二氯甲烷中,形成5μL/mL的溶液,两者等体积混合后常温下反应3~5h后提纯,得到5‑异硫氰酸基苯基‑10,15,20‑三磺酸基苯基卟啉(PNCS);(2)5‑异硫氰酸基苯基‑10,15,20‑三磺酸基苯基卟啉(PNCS)与乙二胺衍生物以等摩尔比混合后溶于丙酮与蒸馏水的混合溶剂,形成总浓度为20mg/mL的溶液,在常温下反应6~10h,提纯后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT)。该探针水溶性好,对汞离子显示出高的灵敏度和选择性,在检测汞离子时显示明显的颜色和荧光变化;结合激光共聚焦扫描显微技术,还可获得该探针在活细胞内的汞离子检测成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种反应型汞离子荧光探针的制备,具体涉及一种以乙二胺硫脲衍生物为反应基团、卟啉分子为荧光发色团的卟啉–硫脲(PT)类水溶性汞离子荧光探针的制备方法,以及该探针分子应用于水溶液及细胞中汞离子的灵敏检测。
背景技术
汞是一种具有严重生理毒性的重金属,对人体及生态环境可造成严重的危害,即便在浓度很低的情况,也会对人类和动植物产生相当大的毒害作用。最典型的例子就是发生在日本的水俣病,对整个社会产生了极其恶劣的影响。基于上述原因,汞被优先列在全球环境监控***(GEMS)清单上,环境中汞的检测及含汞废水的治理已引起人们极大关注,亦引起了我国政府的高度重视,被列为“十三五规划”重大专项,对重点地区、重点企业切实加强监测和监管。汞的分析与监测技术是汞污染防治的基础,然而目前成熟的汞离子检测技术多是借助大型分析仪器,成本高、耗时长,难以实现快速的现场检测需求。而商品化的快速检测仪器和汞试纸条,其灵敏度低(检测下限为0.1mg/L),达不到国家标准规定的限值(污水0.05mg/L,饮用水0.001mg/L),且选择性差、易受其他离子干扰,无法满足灵敏、准确的检测要求。因此,发展灵敏度高、选择性好、方便快捷的汞离子检测新方法迫在眉睫。
光化学传感检测是近年来应运而生的一种新型汞离子检测方法,因其兼备便捷、灵敏、不破坏样品和易于实现实时原位检测而倍受人们青睐。目前,国内外众多的研究小组着眼于不同的传感机制报道了很多对汞离子具有光学响应的体系。其中,为了弥补基于金属离子结合机理的传感器在选择性方面的不足,发展基于探针分子与汞离子之间特定、专一化学反应原理构建的反应型汞离子光化学探针引起了研究者的广泛关注。这种探针分子通常由两部分组成:一部分是起到信号报告作用的发色团;另一部分是识别基团,可与汞离子发生特定、 专一的化学反应改变整个探针分子结构,从而引起发色团光物理性质的变化,达到对汞离子特异性检测的目的。在反应型汞离子光化学探针的设计中,识别单元的选择十分重要,它决定了整个探针分子与汞离子的结合灵敏性和选择性,并进一步影响发色团的信号输出。汞离子具有嗜硫性,可以拔除某些硫脲及硫酮衍生物的硫原子,生成相应的脱硫产物。因此可通过巧妙的分子结构设计,将此类反应活性基团与发色团相结合,利用其与汞离子发生脱硫反应前后生成具有不同结构的产物,从而改变所连发色团分子的光物理性能来实现对汞离子的检测。其中,硫脲衍生物是最为常用的汞促有机反应活性基团。专利号为CN103980728B的专利“一类用于汞离子检测的尼罗蓝荧光染料”,专利号为CN201410341346.8的专利“来自罗丹明B、二亚乙基三胺和异硫氰酸苯酯的荧光探针及其制备方法和应用”,专利号为CN201510892168.2的专利“一种含双碳硫键结构罗丹明的Hg2+荧光探针及其制备方法与应用”均报道了硫脲衍生物在汞离子探针中的应用。然而,这些反应型汞离子荧光探针虽然具有较高的灵敏度与选择性,但在实际应用中、尤其是在生物成像和检测中仍然面临着很多问题:例如有些探针分子水溶性差,在检测中需添加一定比例的有机溶剂,这对于生物体内汞离子的检测十分不利;有些探针分子中荧光发色团的荧光发射波长小于590nm,对生物样品而言,其样品基体和一些杂质在此区域也会有吸收或荧光,往往会产生较为严重的背景干扰,限制了荧光分析法灵敏度的提高;此外,一些探针自身荧光的易漂白性给实时、高分辨动态汞离子监测也带来极大困难。改善探针分子的水溶性、选择具有良好稳定性、适用于生命体系与荧光成像分析的近红外荧光发色团,最终实现生物体内汞离子的高选择性灵敏检测是解决上述问题的关键所在。
卟啉是一类由四个吡咯环通过次甲基相连构成的共轭大环化合物,具有高的荧光量子产率、大的Stokes位移,是一类性能优异的近红外荧光发色团信号分子,广泛应用于荧光分子探针的构建。卟啉化合物的易修饰性可使其大环***联接不同的取代基与活性官能团,为调控该荧光信号基团的光物理性质及改 善整个探针分子的亲疏水性能提供了极大方便。因此,可通过分子设计和化学反应将其与汞离子识别单元结合,合成一系列光物理和光化学性质可调的功能化荧光探针,应用于水体及生物体内汞离子的检测。
发明内容
本发明针对现有荧光探针所存在的制备复杂、水溶性差及背景干扰严重等问题,提供了一种以乙二胺硫脲衍生物为反应基团、卟啉分子为荧光发色团的卟啉–硫脲类水溶性汞离子荧光探针及其制备方法,以及该探针分子在水体与细胞中汞离子检测的应用。
一种卟啉–硫脲类水溶性汞离子荧光探针(PT),具有如下结构通式:
其中,R1=R2=H,或R1=H,R2=CH3,或R1=H,R2=C2H5
一种卟啉–硫脲类水溶性汞离子荧光探针(PT)的制备方法,包括如下步骤:
将5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)溶于蒸馏水中,将三光气溶于二氯甲烷中,两者等体积混合后常温下反应3~5h后,提纯、冷冻干燥后得到5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS);将5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)与乙二胺衍生物混合后溶于丙酮与蒸馏水的混合溶剂,在常温下反应6~10h后,采用旋转蒸发仪旋干溶剂,于1000kDa的透析袋中透析48~56h,冷冻干燥36~42h后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT)。
所述的卟啉–硫脲类水溶性汞离子荧光探针(PT)的制备方法,具体包括如下步骤:
(1)以市售四苯基卟啉(TPP)为起始原料,参照文献:硝基苯基卟啉的合成及反应(R.Luguya,L.Jaquinod,F.R.Fronczek,A.G.H.Vicente,K.M.Smith,Synthesis andreactions of meso-(p-nitrophenyl)porphyrins,Tetrahedron 60(2004) 2757-2763)中记载的制备方法,将TPP经过三氟乙酸/亚硝酸钠混合体系硝化、氯化亚锡/盐酸混合体系还原,制备得到5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)。
TPP的结构式为:
ATPP的结构式为:
(2)将5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)溶于浓硫酸中,形成0.04g/mL的溶液,加热至回流,反应6~9h后停止加热;反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液中和至溶液的pH为7,于1000kDa的透析袋中透析45~50h,冷冻干燥22~28h后得到5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)。
PNH2的结构式为:
(3)将5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)溶于溶剂一中,将三光气溶于溶剂二中,两者等体积混合后常温下反应3~5h后,于1000kDa的透析袋中透析45~50h,冷冻干燥34~38h后得到5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)。
PNCS的结构式为:
(4)5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)与乙二胺衍生物以等摩尔比混合后溶于丙酮与蒸馏水的混合溶剂,形成总浓度为20mg/mL的溶液,在常温下反应6~10h后,采用旋转蒸发仪旋干溶剂,于1000kDa的透析袋中透析48~56h,冷冻干燥36~42h后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT)。
所述的乙二胺衍生物分别为乙二胺(EA)、N-甲基乙二胺(MEA)、N-乙基乙二胺(EEA),结构式如下:
选用这几种化合物的原因在于其廉价易得、分子体积小,与PNCS反应效率高,且生成的PT水溶性较好。
所述溶剂一是蒸馏水。
所述溶剂二是二氯甲烷。
所述的步骤(1)中5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)的合成严格按照文献报道方法合成。
所述的步骤(2)中5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)的合成参照文献:一种简便的方法合成与纯化四(4-磺酸基)苯基卟啉(T.S.Srivastava,M.Tsutsui,Preparation and purification of tetrasodium meso-tetra(p-sulfopheny1)porphine.An easy procedure)中报道的方法,通过优化ATPP与浓硫酸的比例,调整加热回流时间,获得产率与纯度较高的5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)。
所述的步骤(3)中5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)与溶剂一的加入量之比优选为7.5mg/mL,三光气与溶剂二的加入量之比优选为5 μL/mL,这两个比例可使得5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉与三光气分别在溶剂用量最少的情况下能最充分溶解,更利于反应充分进行。
所述的步骤(3)中5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)的水溶液与三光气的二氯甲烷溶液体积比优选1:1,这个体积比可以使得溶液中5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉与三光气的摩尔比为1:7.5,该比例可最高效率促进5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉转化为5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS),避免副产物的生成。
所述的步骤(4)中丙酮与蒸馏水的混合溶剂,其中,丙酮、蒸馏水的体积比为1:1。选用这两种溶剂的原因在于PNCS易溶于水,乙二胺衍生物易溶于丙酮,且丙酮与水互溶,两者混合可达到溶液混合均一,充分反应的效果。
所述的步骤(4)中5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)与乙二胺衍生物混合物的摩尔比为1:1。实验表明,当二者摩尔比为1:1时,反应效率最高、副反应最少。
所述的制备方法制得的探针分子,其特征在于,所述的卟啉–硫脲(PT)分子为水溶性分子。
所述的卟啉–硫脲(PT)分子可通过硫脲基团与汞离子发生特有的胍化成环反应,引起PT分子结构变化,造成卟啉信号基团的颜色及荧光特性发生改变,实现汞离子的专一性检测。如下式所示:
R1=H或CH3或C2H5
所述的卟啉–硫脲(PT)分子具有良好的膜穿透性,可用于细胞内汞离子的检测。
本发明具有如下优点:
(1)本发明的卟啉–硫脲(PT)探针分子的合成方法,条件温和、步骤简单,后处理简便;
(2)本发明利用汞离子可促使硫脲衍生物发生特殊的分子内胍化成环反 应,其它离子无明显干扰,实现了汞离子检测的专一性与准确性;
(3)本发明使用卟啉分子作为信号报告基团,该分子为近红外荧光发色团分子,光学性能优异、对微环境敏感、可获得较大的Stocks位移,增强了反应信号的灵敏度;
(4)本发明的卟啉–硫脲(PT)探针分子具有良好的水溶性,能够对汞离子显示出比色/荧光的双重敏感性质,可实现水溶液中微量汞离子的快速检测,且能够对汞离子的检测显示出高选择性;
(5)借助于激光共聚焦扫描显微技术,本发明的卟啉–硫脲(PT)探针可用于细胞内汞离子检测成像。
附图说明
图1为实施例1制备的卟啉–硫脲(PT)探针溶液对不同金属离子的颜色变化图;
图2为实施例2制备的卟啉–硫脲(PT)探针的汞离子滴定荧光光谱图;
图3为实施例3制备的卟啉–硫脲(PT)探针的细胞内汞离子检测的荧光显微镜图片。
具体实施方式
实施例1
将四苯基卟啉(TPP)(800mg,1.31mmol)溶于三氟乙酸(50mL),加入亚硫酸钠(100mg,1.45mmol)。室温下反应3min后,加入500mL水将反应淬灭。采用二氯甲烷萃取反应液,将有机层分别用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水洗涤后,旋转蒸发得到紫色固体。硅胶色谱柱分离,二氯甲烷为展开剂,收集第二色带产物。旋转蒸干溶剂,继续加入浓盐酸(50mL),氯化亚锡(1100mg,4.875mmol)。将混合液加热至65℃,在氩气保护下反应1h后,加入500mL蒸馏水。加入氨水中和至pH为8。采用二氯甲烷萃取反应液后旋转蒸干溶剂,硅胶色谱柱分离,二氯甲烷为展开剂,收集第三色带产物。得到5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)。
将5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)(320mg,3.9mmol)溶于8mL浓硫酸中,形成0.04g/mL的溶液,加热至回流,反应8h后停止加热;反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液中和至溶液的pH为7,于1000kDa的透析袋中透析46h,冷冻干燥24h后得到5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉 (PNH2)。
将5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)(150mg,0.172mmol)溶于20mL蒸馏水中,将三光气(100μL,1.3mmol)溶于20mL二氯甲烷中,两者混合后常温下反应4h后,于1000kDa的透析袋中透析48h,冷冻干燥36h后得到5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)。
5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)(40mg,0.041mmol)与乙二胺(2.46mg,0.041mmol)混合后溶于2.1mL丙酮、蒸馏水的混合溶剂中(丙酮与蒸馏水的体积比为1:1),在常温下反应6h后,采用旋转蒸发仪旋干溶剂,于1000kDa的透析袋中透析50h,冷冻干燥38h后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT),采用核磁共振氢谱、高分辨质谱验证其化学结构。其结构式如下:
实施例2
将四苯基卟啉(TPP)(800mg,1.31mmol)溶于三氟乙酸(50mL),加入亚硫酸钠(100mg,1.45mmol)。室温下反应3min后,加入500mL水将反应淬灭。采用二氯甲烷萃取反应液,将有机层分别用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水洗涤后,旋转蒸发得到紫色固体。硅胶色谱柱分离,二氯甲烷为展开剂,收集第二色带产物。旋转蒸干溶剂,继续加入浓盐酸(50mL),氯化亚锡(1100mg,4.875mmol)。将混合液加热至65℃,在氩气保护下反应1h后,加入500mL蒸馏水。加入氨水中和至pH为8。采用二氯甲烷萃取反应液后旋转蒸干溶剂,硅胶色谱柱分离,二氯甲烷为展开剂,收集第三色带产物。得到5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)。
将5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)(480mg,4.35mmol)溶于12mL浓硫酸中,形成0.04g/mL的溶液,加热至回流,反应9h后停止加热; 反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液中和至溶液的pH为7,于1000kDa的透析袋中透析50h,冷冻干燥28h后得到5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)。
将5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)(300mg,0.344mmol)溶于40mL蒸馏水中,将三光气(200μL,2.6mmol)溶于40mL二氯甲烷中,两者混合后常温下反应5h后,于1000kDa的透析袋中透析50h,冷冻干燥38h后得到5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)。
5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)(40mg,0.041mmol)与N-甲基乙二胺(3.05mg,0.041mmol)混合后溶于2.15mL丙酮、蒸馏水的混合溶剂中(丙酮与蒸馏水的体积比为1:1),在常温下反应8h后,采用旋转蒸发仪旋干溶剂,于1000kDa的透析袋中透析48h,冷冻干燥40h后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT),采用核磁共振氢谱、高分辨质谱验证其化学结构。其结构式如下:
实施例3
将四苯基卟啉(TPP)(800mg,1.31mmol)溶于三氟乙酸(50mL),加入亚硫酸钠(100mg,1.45mmol)。室温下反应3min后,加入500mL水将反应淬灭。采用二氯甲烷萃取反应液,将有机层分别用饱和碳酸氢钠水溶液、蒸馏水洗涤后,旋转蒸发得到紫色固体。硅胶色谱柱分离,二氯甲烷为展开剂,收集第二色带产物。旋转蒸干溶剂,继续加入浓盐酸(50mL),氯化亚锡(1100mg,4.875mmol)。将混合液加热至65℃,在氩气保护下反应1h后,加入500mL蒸馏水。加入氨水中和至pH为8。采用二氯甲烷萃取反应液后旋转蒸干溶剂,硅胶色谱柱分离,二氯甲烷为展开剂,收集第三色带产物。得到5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)。
将5-氨基苯基-10,15,20-三苯基卟啉(ATPP)(240mg,2.93mmol)溶于6mL浓硫酸中,形成0.04g/mL的溶液,加热至回流,反应8h后停止加热;反应液加入1mol/L的氢氧化钠溶液中和至溶液的pH为7,于1000kDa的透析袋中透析49h,冷冻干燥28h后得到5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)。
将5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)(150mg,0.172mmol)溶于20mL蒸馏水中,将三光气(100μL,1.3mmol)溶于20mL二氯甲烷中,两者混合后常温下反应4h后,于1000kDa的透析袋中透析47h,冷冻干燥36h后得到5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)。
5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)(50mg,0.051mmol)与N-乙基乙二胺(4.51mg,0.051mmol)混合后溶于2.73mL丙酮、蒸馏水的混合溶剂中(丙酮与蒸馏水的体积比为1:1),在常温下反应7.5h后,采用旋转蒸发仪旋干溶剂,于1000kDa的透析袋中透析46h,冷冻干燥42h后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT),采用核磁共振氢谱、高分辨质谱验证其化学结构。其结构式如下:
应用例1
卟啉–硫脲(PT)探针分子对水溶液中汞离子的选择性检测:由于只有汞离子可诱导硫脲基团发生分子内胍化成环反应,引起卟啉信号基团发生颜色及光谱信号响应,因此可将一定浓度的PT分子水溶液中分别加入等浓度的不同金属离子水溶液中,肉眼观察PT溶液的颜色变化。具体过程如下:在5mL菌种瓶中加入实施例1中制备的PT水溶液0.4mL(10μM),再分别加入10倍当量的Mg2+,Ca2+,Ba2+,Zn2+,Ni2+,Al3+,K+,Cd2+,Na+的水溶液0.4mL,采用蒸馏水稀释定容至4.0mL,静置5分钟后,肉眼观察溶液颜色变化,发现只有Hg2+ 可引起PT溶液的颜色由粉红转变为黄绿色,其他均无明显颜色变化,说明PT探针对有汞离子较高的选择性(图1)。
应用例2
卟啉–硫脲(PT)探针分子对水溶液中不同浓度汞离子的荧光滴定:在10mL容量瓶中加入实施例2中制备的PT水溶液1.0mL(10μM)后,再分别加入不同浓度的汞离子水溶液1.0mL,采用蒸馏水稀释定容至10.0mL,静置5分钟后,采用荧光光谱测定加入不同浓度汞离子的荧光变化谱图。结果如图2所示。随着汞离子浓度的增强,651nm处的荧光强度逐渐减弱,602nm处的荧光强度逐渐增强,说明PT溶液对于汞离子表现出比率型荧光响应。
荧光光谱仪的参数如下:激发波波长为420nm;接收波波段为525nm~775nm。
应用例3
实验之前采用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)配制1mM的由实施例3制备的卟啉–硫脲(PT)探针分子储备液。取上述15μL PT分子储备液分别加入含有贴壁细胞的培养基中,置于37℃的5%培养箱中孵育15min后,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)清洗3次,以除去培养基中过量的未进入细胞的探针分子。取其中一个经PT分子孵育的细胞培养基,进一步加入2当量的汞离子水溶液15μL,置于37℃的5%培养箱中孵育15min后,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)清洗3次,以除去培养基中过量的未进入细胞的汞离子。将以上两组细胞分别固定在96孔板上后,采用奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜观察成像情况。结果如图3所示。可以看出,未加入汞离子之前,细胞内无明显荧光;汞离子加入后,细胞内呈现出明显的荧光增强。说明所合成的PT分子具有良好的细胞膜穿透性,且对细胞内汞离子表现出优异的检测性能。
激光共聚焦显微镜的参数如下:a.激光功率是氩离子激光器总输出功率50mW的20%,激发光波长405nm,分光镜为TD 488/543/633nm,检测发射波段为575nm~620nm;b.激光扫描强度是激光输出功率的10%;c.探测针孔为1Airy单位;d.光电倍增管电压为1000V。
Claims (9)
1.一种反应型汞离子荧光探针,其特征在于,所述的探针分子的结构式如下:
其中,R1=R2=H,或R1=H,R2=CH3,或R1=H,R2=C2H5 。
2.一种反应型汞离子荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
(1)将5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNH2)溶于溶剂一中,将三光气溶于溶剂二中,两者等体积混合后常温下反应3~5h后,于1000kDa的透析袋中透析45~50h,冷冻干燥34~38h后得到5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)。
(2)5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)与乙二胺衍生物混合后溶于丙酮与蒸馏水的混合溶剂,形成浓度为20mg/mL的溶液,在常温下反应6~10h后,采用旋转蒸发仪旋干溶剂,于1000kDa的透析袋中透析48~56h,冷冻干燥36~42h后得到最终的产物卟啉–硫脲(PT)。
3.根据权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述溶剂一是蒸馏水,所述溶剂二是二氯甲烷。
4.根据权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法,其特征在于,步骤(1)中5-氨基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉与溶剂一的加入量之比为75mg/mL,三光气与溶剂二的加入量之比为5μL/mL。
5.根据权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述的丙酮与蒸馏水的混合溶剂,其中,丙酮、蒸馏水的体积比为1:1。
6.根据权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法,其特征在于,所述的乙二胺衍生物分别为乙二胺(EA)、N-甲基乙二胺(MEA)、N-乙基乙二胺(EEA),结构式如下:
。
7.根据权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法,其特征在于,步骤(2)中5-异硫氰酸基苯基-10,15,20-三磺酸基苯基卟啉(PNCS)与乙二胺衍生物混合物的摩尔比为1:1。
8.如权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法制备的卟啉–硫脲(PT)荧光探针在水溶液中微量汞离子检测的应用。
9.如权利要求2所述的一种反应型汞离子荧光探针的制备方法制备的卟啉–硫脲(PT)荧光探针在活细胞中微量汞离子检测的应用。
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