CN106290240A - 一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，包括酵母菌种平行扩大培养，样品的制备，常规方法测定酵母菌生长曲线，样品的近红外光谱采集，优化近红外光谱数据，建立酵母菌生长过程中各个时期的分类模型。本发明通过近红外光谱对酵母菌发酵物中C‑H、N‑H、O‑H等含氢基团倍频与合频的吸收来收集光谱信息，分析酵母菌在不同的生长阶段对培养基利用状况的差异，提取相应的光谱信息，再把常规方法检测的结果作为光谱模型的输出，构建出能准确反映酵母菌生长曲线的模型。本发明交叉融合发酵工艺学、应用数学和信息科学等多学科知识，具有较高的理论深度和研究价值。

Description

一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法

技术领域

本发明涉及一种工业发酵过程检测的方法，更具体地说，是涉及一种基于近红外光谱技术对酵母菌生长检测的方法和装置，属于工业发酵过程无损检测与控制领域。

背景技术

酵母菌发酵食品可以改善其风味、提高营养价值。随着生物技术的发展，在改造和培育酵母方面的技术也获得了很多成功，使酵母获得了很多对人类有益的性状。在能源匮乏的今天，利用酵母发酵生物质产酒精作为能源替代品已越来越引起重视。在工业生产过程中，通过对微生物生长曲线的测定，可以知道当前微生物生长所处的生长时期；可以较为准确地选择终止培养的时机，使得产量最大化；还可以比较不同批次的细胞生长状况以及培养过程中，选择最佳补料时机。

微生物生长一般要经历延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。目前对生长曲线的测定方法主要有血球计数板计数法、平板菌落计数法和称重法等。但检测过程繁琐、时间长，有些甚至需要在实验中配备一定数量的化学分析试剂，并要经过一系列复杂冗长的化学反应过程才能得到理想结果，这很难适应在短期时间内大量取样的工作需要，而且采样和获取分析结果之间有较多的时间拖延，会严重影响数据分析结果，并且分析过程破坏样品、费时费力。近年来，出现了光电比浊计数法测定微生物生长曲线，该方法简便、迅速。但是，由于光密度或透光度除了受菌体浓度影响之外，还受细胞大小、形态、培养液成分以及所采用的光波长等因素的影响，导致检测结果可能会存在一定偏差；此外，对于颜色太深的样品或在样品中还含有其他干扰物质的悬液不适合用此法进行测定。近红外光谱信息主要反映的是有机物分子中C-H、N-H、O-H等含氢基团的倍频与合频吸收,这些含氢基团吸收频率特征性强,受分子内外环境的影响小,而且在近红外谱区比中红外谱区的样品光谱特性更稳定。近红外光谱分析兼备了可见区光谱分析信号容易获取与近红外区光谱分析信息量丰富的两方面的优点,加上该谱区自身具有的谱带重叠、吸收强度较低、需要依靠化学计量学方法提取信息等特点,使近红外光谱分析成为一种新型的分析技术。仪器测量信号的数字化和分析过程的绿色化程度的不断提高,使该技术具有分析对象广泛、吸收强度低，穿透深度大、可以在玻璃或石英介质中穿透，可使用光纤传输、分析快速简便、不破坏样品、不用溶剂，无污染环境、可用于样品定性，也可得到精度较高的定量结果、可用于测定样品的非化学性质、近红外技术的重现性好，效率高等特点。基于近红外光谱以上特点，再结合现有的技术。因此，本发明将近红外光谱分析技术引入到酵母菌生长曲线测定方面的研究是可行的，并能提高其测定的时效性和准确性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种快捷、准确和样品无伤检测的基于近红外光谱对酵母菌生长过程的测定方法，以解决常规检测方法繁杂、费时费力等问题。

本发明的技术方案为：一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，包括以下步骤：步骤1，实验室培养酵母菌，主要利用平行扩大培养原则，获得接种的母菌，并将母菌分别接入各个烧瓶中；步骤2，利用光电比浊法和血细胞计数法对酵母菌液进行检测，获得放映酵母菌生长状况的关键参数OD值和细胞总数；步骤3，样品的近红外光谱采集；步骤4，酵母菌生长曲线模型的建立，把近红外光谱仪采集所得的光谱信息随机分为训练集和测试集，采用siPLS-IRIV-ELM算法对酵母菌生长的各个时期进行分类。

进一步，所述步骤1具体包括：

首先是培养基的制备，取麦芽浸粉300g，加入2300ml蒸馏水加热溶解，待冷却至室温分装到20个三角烧瓶，并分别进行编号0，1-1到1-6，2-1到2-6，3-1到3-6和4号；然后是进行平行扩大培养，每次扩培的培养基取自编号为0的烧瓶中，原代菌种接入后，每次取生长状况良好的菌种作为下级扩培的母菌，直至扩培50ml菌液结束；最后把扩培后的菌液各取0.5ml，接种到装有250ml的培养基的烧瓶，从1-1到1-6，2-1到2-6，3-1到3-6，4号为培养基对照组。

进一步，所述步骤2具体过程为：

步骤2.1，在0h～72h间，每隔4个小时取酵母菌液放入紫外分光光度计内进行检测，得到每个时间的OD值；

步骤2.2，将不同时间收集的培养液摇匀后做10倍递增稀释，稀释倍数为10^-1、10^-2、10^-3，在取一滴稀释液滴入血细胞计数板上，用电子显微镜进行计数，得到细胞总数；

步骤2.3，将所测得的OD值与细胞总数输入计算机用Excel求出其回归方程，得到二者之间的相关性，已验证实验的准确性。

进一步，所述的步骤3具体过程为：在不同的时间点取出酵母菌培养液放入近红外光谱中，进行光谱扫描，获得的光谱信息。

进一步，所述步骤4具体过程为：

步骤4.1，预处理方法的选择：标准正态标量校正用来消除表面散射、光程变化对近红外光谱的影响；设各波长变量点的吸光度值满足标准正态分布，运算过程为光谱值减去光谱平均值，然后除以光谱的标准差，实际上是将原始光谱标准化；

步骤4.2，联合区间偏最小二乘算法筛选最优波长区间：将全光谱分为10-25个等间距的波长区间，选择2、3、4个波长区间联合构建所有可能的偏最小二乘模型，计算每个偏最小二乘模型的交互验证均方根误差值；根据交互验证均方根误差最低原则选择最优波长区间；

步骤4.3，迭代保留信息变量算法获取最佳变量集：迭代保留信息变量，将所有变量分成四类：“强信息变量”、“弱信息变量”、“无信息变量”和“干扰变量”；迭代保留信息变量算法需要进行多轮迭代，每轮迭代会生成大量模型同时消除大量变量；迭代保留信息变量算法在每轮的迭代中保留“强信息变量”和“弱信息变量”，消除“无信息变量”和“干扰变量”，最后进行反向消除获得最佳的变量集；其主要步骤如下：

f)生成一个只包含1和0的二进制矩阵，矩阵的行代表变量之间的随机组合，矩阵的列代表变量；1代表变量用作建模，0代表变量不用作建模；

g)在二进制矩阵的每一行建立偏最小二乘算法模型，计算模型的交互验证均方根误差值；

h)将二进制矩阵的每一列的1和0互换，在互换后的矩阵每一行建立偏最小二乘算法模型，计算模型的交互验证均方根误差值；

i)根据变量的重要性将变量分成“强信息变量”、“弱信息变量”、“无信息变量”和“干扰变量”四种；

j)保留“强信息变量”和“弱信息变量”，移除“无信息变量”和“干扰变量”；对保留的变量进行反向消除。

步骤4.4，把前几个步骤筛选出的波段作为极限学习机算法的输入，建立酵母菌生长过程中各个时期的分类模型。

本发明有益效果为：

通过本发明研究，建立基于近红外光谱分析技术的酵母菌生长曲线描述方法，可实现快速准确地判定酵母菌生长情况及其所处阶段，能为工业发酵过程带来准确的指导，提高酵母菌发酵产物得率。另外，结合近红外光谱技术的特征，相对于常规方法，近红外光谱技术避免了检测时对样本所造成的破坏，同时也避免了化学试剂的使用，保护环境，降低成本，省时省力。此方法不仅可以应用于实验室快速检测、分析，还可以广泛地推广到工业发酵中使用。本发明交叉融合发酵工艺学、应用数学和信息科学等多学科知识，具有较高的理论深度和研究价值，对提升我国酵母菌发酵工艺信息化和装备智能化都有着十分重要的意义，也对其他发酵过程智能化监控研究起到借鉴作用。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明：

图1为本发明基于近红外光谱技术测定酵母菌生长曲线的检测装置结构示意图。

图2为本发明研究技术路线图。

图中：①酵母菌培养液；②紫外分光光度计；③计算机；④近红外光谱仪；⑤血球计数板；⑥电子显微镜。

具体实施方式

下面将结合本发明实施的附图，对本发明实施的技术方案进行清楚、完整地描述。

如图1所示，***组成包括：酵母菌培养液①、近红外光谱仪④、紫外分光光度计②、电子显微镜⑥、恒温震荡培养箱、操作净台、高压蒸汽灭菌锅、血细胞计数板⑤、计算机③等。其中，近红外光谱为Antaris II型傅里叶变换近红外光谱仪，波段范围为12000cm^-1～3800cm^-1，光谱分辨率为4cm^-1，波数精度为0.1cm^-1；紫外分光光度计为TU-1901系列紫外分光光度计，其波长范围为190nm～900nm,波长准确度为±0.3nm，波长重复性为0.1nm，光谱带宽有0.1nm、0.2nm、0.5nm、1.0nm、2.0nm、5.0nm，杂散光为≤0.01％T，基线漂移为0.0004Abs/h，光度噪声为±0.0004Abs；电子显微镜为Nikon ECLIPSE TS100型，其镜头为焦距可变型，载物台为170×225mm，载物高度距桌面195mm，照明器预对中6V-30W卤素灯，滤色片有隔热片和弥散片，目镜为C-W10X和C-W15X，聚光镜为ELWD聚光镜；计算机型号为X1-10JX0010CD,CPU为i7-6600u，运行速度为2.6GHz-3.4GHz,内存8GB，硬盘容量256GB固态硬盘。***具体工作过程：取出两批酵母菌发酵液①放入紫外分光光度计②和近红外光谱仪④中分别测定吸光度OD值和获取光谱信息。另外，用胶头滴管吸取少量酵母菌发酵液滴在血细胞计数板⑤上，再用电子显微镜⑥计算出酵母菌总数N。之后，把OD值和细胞总数N，输入计算机③，采用Excel求出其回归方程，得到二者之间的相关性，绘制出准确的酵母菌生长曲线，从而判断出酵母菌生长过程中的各个时期，并按每个时期所得的光谱信息随机分为训练集和测试集，采用siPLS-IRIV-ELM算法对酵母菌生长的各个时期进行分类。

图2为本发明研究技术路线图，通过把常规方法光电比浊法和血细胞计数法所测得的OD值和细胞总数(N)用Excel求出其回归方程，得到二者之间的相关性，若呈现相关性，即可绘制出准确的酵母菌生长曲线，从而判断出酵母菌生长过程中的各个时期，并按每个时期所得的光谱信息随机分为训练集和测试集，采用siPLS-IRIV-ELM算法对酵母菌生长的各个时期进行分类。

下面进一步详细描述本发明的具体实施步骤：

步骤1，酵母菌的培养研究：实验室培养酵母菌，主要利用平行扩大培养原则，获得接种的母菌，并将母菌分别接入各个烧瓶中。

首先，培养基的制备，取麦芽浸粉300g，加入2300ml蒸馏水加热溶解，待冷却至室温分装到20个三角烧瓶，并分别进行编号0,1-1到1-6,2-1到2-6,3-1到3-6,和4；然后，进行平行扩大培养，每次扩培的培养基取自编号为0的烧瓶中，原代菌种接入后，每次取生长状况良好的菌种作为下级扩培的母菌，直至扩培50ml菌液结束；最后，把扩培后的菌液各取0.5ml，接种到装有250ml的培养基的烧瓶(1-1到1-6,2-1到2-6,3-1到3-6)，4号为培养基对照组。

(1)酵母菌种扩大培养：从上海瑞楚生物科技有限公司购买工业发酵酵母菌种1ml，再配置麦芽汁培养基，然后将原代酵母菌菌种接种到培养基中做平行扩大培养，每次取生长状况良好的菌种作为下一次接种母菌，直到培养酵母菌种40ml结束。

(2)酵母菌的分装培养：用18个250ml的容量瓶编号分别装入无菌麦芽汁培养基125ml，同时各接种0.5ml酵母液，另外再取1个50ml的三角烧瓶接入30ml无菌培养基作为对照组其编号为4；将它们同时放入恒温震荡培养箱中培养，分别在0h～24h内每隔4个小时从编号1-1到1-6的容量瓶中各取出5ml用光谱扫描、OD值测量和细胞计数，光谱扫描时前4个样品作为训练集，后2个作为验证集。为了防止多次采样造成培养基污染，影响实验结果的准确性，故在28h～48h间检测时从编号为2-1到2-6中进行取样，在52h～72h之间从编号为3-1到3-6中取样。这样一共可收集到114个样品，其中76个训练集，38个验证集。

步骤2，利用光电比浊法和血细胞计数法对酵母菌液进行检测，获得放映酵母菌生长状况的关键参数OD值和细胞总数(N)。

步骤2.1，在0h～72h间，每隔4个小时取酵母菌液①放入紫外分光光度计②内进行检测，得到每个时间的OD值；

步骤2.2，将不同时间收集的培养液摇匀后做10倍递增稀释，稀释倍数为10^-1、10^-2、10^-3，在取一滴稀释液滴入血细胞计数板⑤上，用电子显微镜⑥进行计数，得到细胞总数(N)；

步骤2.3，将所测得的OD值与细胞总数(N)输入计算机③用Excel求出其回归方程，得到二者之间的相关性，已验证实验的准确性。

近红外分析方法是二次分析方法，建立校正模型所需的样品组成或性质通常采用现行标准或传统方法进行测定，因此，选择合适的常规方法是保证近红外光谱分析方法的准确和精密性的关键。本研究分别采用光电比浊法和血球计数法测定114个样品中酵母菌的生长，如图2所示，将光电比浊法测得的OD值与血球计数法测得的细胞数进行相关性分析，若具有相关性，则说明试验成功；另外，分别把所测得的OD值和细胞数绘制出准确的生长曲线，判断出酵母菌生长过程中的各个时期，并按每个时期所得的光谱信息随机分为训练集和测试集，采用siPLS-IRIV-ELM算法对酵母菌生长的各个时期进行分类。若不相关，则试验失败，分析原因后，重新进行常规方法检测。

步骤3，样品的近红外光谱采集

在不同的时间点取出酵母菌培养液①放入近红外光谱④中，进行光谱扫描，获得的光谱信息。

采用美国Thermo Nicolet公司ANTARIS II型傅里叶变换近红外光谱仪，选择、调整仪器扫描参数、扫描分辨率、样品状态等，探索最佳仪器参数设置，测定所有样品的近红外光谱。

步骤4，酵母菌生长曲线模型的建立：把近红外光谱仪检测所得的光谱信息随机分成训练集和测试集，采用siPLS-IRIV-ELM算法对酵母菌生长的各个时期进行分类。。

光谱区间的选择，减少用于建模的数据量，提高模型的计算速度，消除一些干扰数据的影响。预处理方法的选择，本发明将采用标准正态标量校正(Standard NormalVariate,SNV)来消除基线漂移，减小或消除不必要的误差，建立准确，可靠，稳定的模型。联合区间偏最小二乘(Synergic interval partial least square,siPLS)算法进行波长区间优选，采用交互验证均方根误差(Root mean square error of cross-validation,RMSECV)评估模型的性能并选择最优的波长区间。迭代保留信息变量(Iterativelyretaining informative variables,IRIV)算法进一步删除“无信息变量”和“干扰变量”，同时最大程度的保留“强信息变量”和“弱信息变量”。极限学习机(extreme learningmachine,ELM)算法把前几个步骤筛选出的波段作为ELM的输入，建立酵母菌生长过程中各个时期的分类模型。

(1)预处理方法的选择

标准正态标量校正用来消除表面散射、光程变化对近红外光谱的影响。设各波长变量点的吸光度值满足标准正态分布，运算过程为光谱值减去光谱平均值，然后除以光谱的标准差，实际上是将原始光谱标准化，公式如下：

$z_i=\frac{x_i-\stackrel{\‾}{x_i}}{s}$

上式中，x_i为光谱值，为光谱平均值，s为光谱的标准差。

在近红外光谱仪采集的原始光谱数据中包含了不必要的信息。因此，校准阶段之前，光谱数据必须进行预处理以减少或消除不必要误差，建立准确，可靠，稳定的模型。在这项工作中，本试验将使用SNV预处理，以消除基线漂移和增强的光谱之间的小差异。

(2)联合区间偏最小二乘算法筛选最优波长区间

联合区间偏最小二乘(Synergic interval partial least square,siPLS)算法的基本步骤如下：将全光谱分为10-25个等间距的波长区间，选择2、3、4个波长区间联合构建所有可能的PLS模型，计算每个PLS模型(偏最小二乘模型)的交互验证均方根误差(Rootmean square error of cross-validation,RMSECV)值。根据RMSECV最低原则选择最优波长区间。

为了评估所建近红外光谱分析模型的优劣，本发明将选取以下几个评价指标：

1)交互验证均方根误差(Root mean square error of cross-validation,RMSECV)：用于评估所建模型的可行性，计算步骤如下：

a)从训练集中剔除一份样本，利用剩余样本建立PLS模型，用PLS模型对剔除。

b)的样本进行预测，得到对应预测值；

c)将上一步骤剔除的样本放回训练集，重复上一步骤，直至每份样本都被剔除一份；

d)由下列公式计算模型对应的RMSECV值。

$RMSECV=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_i-y_i)}^2}{n}}$

式中，n为训练集中样本的数目，y_i为训练集中第i个样本的实际值，y_i为PLS模型对第i个样本的预测值。

2)预测均方根误差(Root mean square error of prediction,RMSEP):用于评估所建模型对测试样本的预测能力。公式如下：

$RMSEP=\sqrt{\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_i-y_i)}^2}{n}}$

式中，n是测试样本的数目，y_i是第i个测试样本的实际值，y_i是PLS模型对第i个样本的预测值。

3)相关系数(R)：用于评估样本实际值与预测值的相关程度。公式如下：

$R=\sqrt{1-\frac{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_i-y_i)}^2}{\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{(y_i-\stackrel{\‾}{y_i})}^2}}$

式中，n是测试样本的数目，y_i是第i个测试样本的实际值，y_i是PLS模型对第i个样本的预测值，是样本实际值的平均数。

(3)迭代保留信息变量算法获取最佳变量集

迭代保留信息变量(Iteratively retaining informative variables,IRIV)，将所有变量分成四类：“强信息变量”、“弱信息变量”、“无信息变量”和“干扰变量”。

IRIV算法需要进行多轮迭代，每轮迭代会生成大量模型同时消除大量变量。一般情况下，“强信息变量”总是对模型有益的，但是“弱信息变量”也对模型提供了有益的贡献。因此IRIV算法在每轮的迭代中保留“强信息变量”和“弱信息变量”，消除“无信息变量”和“干扰变量”，最后进行反向消除获得最佳的变量集。其主要步骤如下：

k)生成一个只包含1和0的二进制矩阵，矩阵的行代表变量之间的随机组合，矩阵的列代表变量。1代表变量用作建模，0代表变量不用作建模。

l)在二进制矩阵的每一行建立PLS模型，计算模型的RMSECV值。

m)将二进制矩阵的每一列的1和0互换，在互换后的矩阵每一行建立PLS模型，计算模型的RMSECV值。

n)根据变量的重要性将变量分成“强信息变量”、“弱信息变量”、“无信息变量”和“干扰变量”四种。

o)保留“强信息变量”和“弱信息变量”，移除“无信息变量”和“干扰变量”。

p)对保留的变量进行反向消除。

(4)极限学习机分类模型的建立

极限学习机算法(Extreme Learning Machine)是一种针对单隐含层前馈神经网络(single-hidden layer feedforward neural network，SLFN)的新算法。前馈神经网络通常采用梯度下降方法，该方法存在着一些缺点，如训练速度慢，需要多次迭代才能达到修正权值和阈值的目的；容易陷入局部极小值点，无法达到全局最小和学习率η的选择敏感，由于学习率对神经网络的性能影响很大，所以选择一个合适的学习率η对于获得一个理想的网络至关重要。ELM正是在这种情况下提出来的，由于ELM在训练之前可以随机生成输入层与隐含层间的连接权值w和隐含层神经元的阈值b，而对于隐含层与输出层的连接权值β，只需要隐含层神经元个数小于K小于等于训练集样本数Q，则对于任意的w和b，SLFN都可以零误差逼近训练样本，因此当隐含层神经元的激活函数g(x)(常用激活函数有sigmoidal,sin和hardlim)无限可微时，β可以通过求解以下方程组的最小二乘解获得：

$\underset{\mathrm{\β}}{\min }\left|\right|H\mathrm{\β}-T^{\′}\left|\right|$

其解为

$\widehat{\mathrm{\β}}=H^{+}{T}^{\′}$

其中，H⁺为隐含层输出矩阵H的Moore-penrose广义逆；T为网络输出矩阵。

另外，把迟滞期标为“1”，对数期标为“2”，稳定期标为“3”，衰亡期标为“4”。以其训练集和测试集预测准确率为模型的判断标准。

综上，本发明的一种基于近红外光谱分析技术预测酵母菌生长曲线的方法，包括如下步骤：酵母菌种平行扩大培养，样品的制备，常规方法测定酵母菌生长曲线，样品的近红外光谱采集，优化近红外光谱数，建立定性定量模型。本发明通过近红外光谱对酵母菌发酵物中C-H、N-H、O-H等含氢基团倍频与合频的吸收来收集光谱信息，分析酵母菌在不同的生长阶段对培养基利用状况的差异，提取相应的光谱信息，再把常规方法检测的结果作为光谱模型的输出，构建出能准确反映酵母菌生长曲线的模型。本发明交叉融合发酵工艺学、应用数学和信息科学等多学科知识，具有较高的理论深度和研究价值，不仅可以应用于实验室快速检测、分析，还可以广泛地推广到工业发酵中使用，对提升我国酵母菌发酵工艺信息化和装备智能化都有着十分重要的意义，也对其他发酵过程智能化监控研究起到借鉴作用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤1，实验室培养酵母菌，主要利用平行扩大培养原则，获得接种的母菌，并将母菌分别接入各个烧瓶中；步骤2，利用光电比浊法和血细胞计数法对酵母菌液进行检测，获得放映酵母菌生长状况的关键参数OD值和细胞总数；步骤3，样品的近红外光谱采集；步骤4，酵母菌生长曲线模型的建立：把近红外光谱仪检测所得的光谱信息随机分成训练集和测试集，采用联合区间偏最小二乘算法、迭代保留信息变量算法以及极限学习机算法对酵母菌生长的各个时期进行分类。

2.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，其特征在于：所述步骤1具体包括：

首先是培养基的制备，取麦芽浸粉300g，加入2300ml蒸馏水加热溶解，待冷却至室温分装到20个三角烧瓶，并分别进行编号0，1-1到1-6，2-1到2-6，3-1到3-6和4号；然后是进行平行扩大培养，每次扩培的培养基取自编号为0的烧瓶中，原代菌种接入后，每次取生长状况良好的菌种作为下级扩培的母菌，直至扩培50ml菌液结束；最后把扩培后的菌液各取0.5ml，接种到装有250ml的培养基的烧瓶，从1-1到1-6，2-1到2-6，3-1到3-6，4号为培养基对照组。

3.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，其特征在于：所述步骤2具体过程为：

步骤2.1，在0h～72h间，每隔4个小时取酵母菌液放入紫外分光光度计内进行检测，得到每个时间的OD值；

步骤2.2，将不同时间收集的培养液摇匀后做10倍递增稀释，稀释倍数为10^-1、10^-2、10^-3，在取一滴稀释液滴入血细胞计数板上，用电子显微镜进行计数，得到细胞总数；

步骤2.3，将所测得的OD值与细胞总数输入计算机用Excel求出其回归方程，得到二者之间的相关性，已验证实验的准确性。

4.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，其特征在于：所述的步骤3具体过程为：在不同的时间点取出酵母菌培养液放入近红外光谱中，进行光谱扫描，获得的光谱信息。

5.根据权利要求1所述的一种基于近红外光谱分析技术对酵母菌生长曲线测定的方法，其特征在于：所述步骤4具体过程为：

步骤4.1，预处理方法的选择：标准正态标量校正用来消除表面散射、光程变化对近红外光谱的影响；设各波长变量点的吸光度值满足标准正态分布，运算过程为光谱值减去光谱平均值，然后除以光谱的标准差，实际上是将原始光谱标准化；

步骤4.2，联合区间偏最小二乘算法筛选最优波长区间：将全光谱分为10-25个等间距的波长区间，选择2、3、4个波长区间联合构建所有可能的偏最小二乘模型，计算每个偏最小二乘模型的交互验证均方根误差值；根据交互验证均方根误差最低原则选择最优波长区间；

步骤4.3，迭代保留信息变量算法获取最佳变量集：迭代保留信息变量，将所有变量分成四类：“强信息变量”、“弱信息变量”、“无信息变量”和“干扰变量”；迭代保留信息变量算法需要进行多轮迭代，每轮迭代会生成大量模型同时消除大量变量；迭代保留信息变量算法在每轮的迭代中保留“强信息变量”和“弱信息变量”，消除“无信息变量”和“干扰变量”，最后进行反向消除获得最佳的变量集；其主要步骤如下：

a)生成一个只包含1和0的二进制矩阵，矩阵的行代表变量之间的随机组合，矩阵的列代表变量；1代表变量用作建模，0代表变量不用作建模；

b)在二进制矩阵的每一行建立偏最小二乘算法模型，计算模型的交互验证均方根误差值；

c)将二进制矩阵的每一列的1和0互换，在互换后的矩阵每一行建立偏最小二乘算法模型，计算模型的交互验证均方根误差值；

d)根据变量的重要性将变量分成“强信息变量”、“弱信息变量”、“无信息变量”和“干扰变量”四种；

e)保留“强信息变量”和“弱信息变量”，移除“无信息变量”和“干扰变量”；对保留的变量进行反向消除。

步骤4.4，把前几个步骤筛选出的波段作为极限学习机算法的输入，建立预测酵母菌生长过程中各个时期的分类模型。