CN106282328A

CN106282328A - 一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及用途

Info

Publication number: CN106282328A
Application number: CN201510329786.6A
Authority: CN
Inventors: 骆肖群; 邢清和; 徐金华; 杨凡萍; 陈圣安; 贺林
Original assignee: Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Fudan University; Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2015-06-13
Filing date: 2015-06-13
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明属于生物医药和试剂检测领域，涉及一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及其用于筛选甲硝唑所致皮肤药物不良反应的用途，该试剂盒含有检测人类白细胞抗原基因HLA-B*39:01基因的核酸或者蛋白的试剂和人类白细胞抗原基因的扩增引物或标记探针或含有人类白细胞抗原的特异性抗体。所述HLA-B*39:01基因可作为预测甲硝唑所致药疹的标记基因；利用该检测试剂盒可进一步制备或评价甲硝唑所致药疹筛查试剂盒，为指导临床用药提供有价值的参考数据，减少甲硝唑所致药疹的发生；或用于制备或评价甲硝唑所致药疹的治疗药物尤其是靶向药物，从而阻断其在发病中与甲硝唑或其代谢产物之间的相互作用。

Description

一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及用途

技术领域

本发明属于生物医药和试剂检测领域，涉及一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒，具体而言，涉及人类白细胞抗原基因——HLA-B*39:01基因检测试剂盒,及其用于筛选甲硝唑所致皮肤药物不良反应的用途。

背景技术

皮肤药物不良反应即药疹，指药物通过各种途径进入人体后引起的皮肤黏膜炎症反应。通常临床实践中根据发病的严重程度，将药疹分为普通型药疹和重症药疹；其中，普通型药疹主要包括：发疹型药疹、固定型药疹及荨麻疹型药疹等(Roujeau JC.Clinical heterogeneity of drug hypersensitivity.Toxicology 209(2),123–129(2005))。药疹发病急，皮疹分布较广泛，严重影响患者的生活质量。

已知甲硝唑主要用于治疗滴虫性***炎细菌性***病、阿米巴病、酒渣鼻厌氧菌或混合型感染贾第虫病肠贾第虫等(Mehta DK,Martin J,Costello I,Jordan B etal editors.BNF 50；；London:BMJ publishing group,September 2005)，其引起的药疹疹型最常见为固定型药疹、荨麻疹型药疹、发疹型药疹；除了引起普通型药疹外，甲硝唑还可引起致命的重症药疹(LittJZ.Litt’s Drug Eruption Reference Manual,12th edition.London,Taylor&Francis Group,2006.)。

研究公开了人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)基因的表达产物为人类白细胞抗原，后者在免疫反应中担任至关重要的角色。有研究发现包括卡马西平、阿巴卡韦、别嘌呤醇等在内的数种药物引起的药疹与HLA等位基因相关(Bharadwaj,M.,et al.,Drug hypersensitivity and human leukocyte antigens of the majorhistocompatibility complex.Annu Rev Pharmacol Toxicol,2012.52:p.401-31.

Cao,Z.H.,et al.,HLA-B*58:01allele is associated with augmented risk forboth mild and severe cutaneous adverse reactions induced by allopurinol in HanChinese.Pharmacogenomics,2012.13(10):p.1193-201.Roujeau,J.C.,et al.,Genetic susceptibility to toxic epidermal necrolysis.Arch Dermatol,1987.123(9):p.1171-3.)。美国FDA早在2008年推荐亚洲人群在使用卡马西平前进行HLA-B*15：02基因的筛查(Ferrell PB Jr,Mcleod HL.Carbamazepine,HLA-B*15:02andrisk of Stevens-Johnson Syndrome and toxic epidermal necrolysis:US FDArecommendations[J].Pharmacogenomics,2008,9(10):1543-1546)，以指导临床用药。经过大规模的前瞻性研究，目前已有证据表明，用药前筛查药疹的风险基因可有效减少药疹的发病率(Chen P,Lin JJ,Lu CS et al.Carbamazepine-induced toxic effectsand HLA-B*1502screening in Taiwan.N Engl J Med.2011Mar 24；364(12):1126-33.)。

经对现有技术文献的检索发现，至今未见关于HLA-B*39:01基因与甲硝唑引起的药疹发病相关以及作为基因标记用于筛选该药物所致药疹的相关报道；也未见相关试剂盒的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种人类白细胞抗原基因—HLA-B*39:01基因检测试剂盒及其使用方法。

本发明的进一步目的是提供上述试剂盒的应用，尤其涉及所述试剂盒用于筛选甲硝唑所致皮肤药物不良反应的用途及其检测方法。

本发明的试剂盒通过检测所述人类白细胞抗原基因HLA-B*39:01基因，为患者服用甲硝唑后是存在有患药疹的潜在可能提供有参考价值的数据；同时为指导临床用药提供有参考价值的数据，从而有助于减少甲硝唑致药疹的发生。

本发明基于所述基因与甲硝唑所致的皮肤药物不良反应发病的相关关系将有助于建立新的筛查甲硝唑致药疹的方法。

具体而言，本发明提供了一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有检测人类白细胞抗原基因的核酸或者蛋白的试剂，和人类白细胞抗原基因的扩增引物；或者标记探针，或含有人类白细胞抗原基因的特异性抗体。

本发明所述的人类白细胞抗原基因为HLA-B*39:01基因；

本发明所述甲硝唑所致药疹的相关HLA等位基因-HLA-B*39:01基因的核酸序列如SEQ NO.1所示：

(a)序列特征：

*长度：3155碱基对

*类型：核酸

*链型：双链

*拓扑结构：线形

(b)分子类型：基因组DNA(gDNA文库)

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：人

(f)SEQ NO.1核酸序列描述如下：

进一步，本发明提供了上述检测试剂盒的应用，尤其所述试剂盒用于筛选甲硝唑所致皮肤药物不良反应的用途及其检测方法。

本发明中，采用所述的试剂盒对甲硝唑所致皮肤药物不良反应的待测样本的HLA-B*39:01基因进行分型，如本发明的实施例中，采用PCR-SSO法进行HLA-B*39:01基因进行分型；

其包括步骤：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)对HLA的多态区域进行扩增；

(3)扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记；

(4)将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断结果；

其中，所述的探针针对PCR扩增产物设计并且固定在膜上；

所述的待测样本可以是RNA、蛋白、细胞或者血清样本；最常见的情况下，所述样本是甲硝唑所致皮肤药物不良反应患者的离体的外周血。

本发明的实验结果表明，甲硝唑所致药疹的临床特点及HLA分型如表1所示；所述HLA-B*39:01基因可作为预测甲硝唑所致药疹的标记基因；

试验结果显示，甲硝唑所致药疹患者中HLA-B*39:01阳性比例相比于正常对照组之间差异有统计学意义(如表2所示)。

表1 甲硝唑所致药疹的临床特点及HLA分型

表2 甲硝唑所致药疹组与数据库中健康对照组HLA-B*39:01阳性携带比例

*差异有统计学意义(P<0.05)。

本发明中可利用所述的HLA-B*39:01基因作为预测甲硝唑所致药疹的标记基因；进一步利用所述的HLA-B*39:01基因制备甲硝唑使用前筛查或评价试剂盒；以及利用所述的HLA-B*39:01分子制备或评价甲硝唑所致药疹的靶向药物。

本发明具有如下优点

涉及的人类白细胞抗原基因——HLA-B*39:01基因，其与甲硝唑引起的药疹发病相关；

所述HLA-B*39:01基因可作为预测甲硝唑所致药疹的标记基因；从患者的外周血中抽取DNA后，用现行的方法检测HLA-B*39:01基因，如PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针)方法；

利用本发明提供的HLA-B*39:01基因检测试剂盒可进一步用于制备或评价甲硝唑所致药疹筛查试剂盒，该筛查试剂盒，可为指导临床用药提供有价值的参考数据，从而减少甲硝唑所致药疹的发生；或可用于制备或评价甲硝唑所致药疹的治疗药物，所述的评价甲硝唑所致药疹的治疗药物，主要靶向作用于HLA-B*39：01分子，从而阻断其在发病中与甲硝唑或其代谢产物之间的相互作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例，以进一步说明本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：基因的收集和抽提

甲硝唑所致药疹患者来自于中国上海复旦大学附属华山医院。其中，荨麻疹型药疹的诊断需临床满足风团样皮疹，24小时不能完全消退，可伴或不伴喉咙梗阻或阵发性腹痛；发疹型药疹为全身泛发的对称分布的红色斑片，且无粘膜累及；固定型药疹为单发或多发的靶型损害，皮疹好转后遗留色素沉着(Roujeau JC.Clinical heterogeneityof drug hypersensitivity.Toxicology 209(2),123–129(2005).Bastuji-Garin S,Rzany B,Stern RS,Shear NH,Naldi L,Roujeau JC.Clinical classification ofcases of toxic epidermal necrolysis,Stevens–Johnson syndrome,and erythemamultiforme.Arch.Dermatol.129(1),92–96(1993))；在知情同意的前提下，签署知情同意书，进行采集血液样本，所有入组患者均通过病史及皮肤病理检查排除病毒疹、毒性红斑、成人Still病等其他诊断；所有患者均在发疹前2个月内首次口服甲硝唑；本实验设对照组，为来自human MHC database(dbMHC)的283位健康人群；取样本血液300ul，按试剂盒说明书提取DNA，用紫外分光光度仪检测DNA浓度和纯度。

实施例2：检测HLA基因分型

本发明采用PCR-SSO法(推荐试剂盒-One Lambda,CA,USA)进行HLA基因的分型；其原理是先对HLA的多态区域进行扩增,在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记,然后针对PCR扩增产物根据碱基配对原则设计系列寡核苷酸探针固定在膜上,最后将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影根据信号判断结果；根据试剂盒标准步骤进行HLA基因分型：将DNA样本、底物、Taq酶、引物混合后混匀，加入扩增板中，按试剂盒说明书中条件扩增，扩增产物进行杂交、染色和读板；通过HLAFusion软件(One lambda,CA,USA,HLA Fusion 3.0)进行结果分析。

实施例3：HLA-B*39:01与甲硝唑所致药疹相关

利用SPSS16.0计算Odds Ratio(OR)及其95％的可信区间，必要时使用Haldane’s校正，选用卡方检验进行统计学分析，统计学的显著性水平设定为P小于0.05；

结果显示：搜集到甲硝唑药疹患者9例，其甲硝唑所致药疹的临床特点及HLA分型如表1所示；

表1

甲硝唑所致药疹患者中HLA-B*39:01阳性比例相比于正常对照组的阳性携带比例如表2所示；之间差异有统计学意义。

表2

*差异有统计学意义(P<0.05)。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学，复旦大学附属华山医院

<120> 一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒及用途

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3155

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

gatcaggacg aagtcccagg tcccggacgg ggctctcagg gtctcaggct ccgagggccg 60

cgtctgcaat ggggaggcgc agcgttgggg attccccact cccctgagtt tcacttcttc 120

tcccaacttg tgtcgggtcc ttcttccagg atactcgtga cgcatcccca cttcccactc 180

ccattgggtg tcggatatct agagaagcca atcagcgtcg ccggggtccc agttctaaag 240

tccccacgca cccacccgga ctcagagtct cctcagacgc cgagatgctg gtcatggcgc 300

cccgaaccgt cctcctgctg ctctcggcgg ccctggccct gaccgagacc tgggccggtg 360

agtgcgggtc gggagggaaa tggcctctgc cgggaggagc gaggggaccg caggcggggg 420

cgcaggacct gaggagccgc gccgggagga gggtcgggcg ggtctcagcc cctcctcgcc 480

cccaggctcc cactccatga ggtatttcta cacctccgtg tcccggcccg gccgcgggga 540

gccccgcttc atctcagtgg gctacgtgga cgacacgcag ttcgtgaggt tcgacagcga 600

cgccgcgagt ccgagagagg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg ggccggaata 660

ttgggaccgg aacacacaga tctgcaagac caacacacag actgaccgag agagcctgcg 720

gaacctgcgc ggctactaca accagagcga ggccggtgag tgaccccggc ccggggcgca 780

ggtcacgact ccccatcccc cacgtacggc ccgggtcgcc ccgagtctcc gggtccgaga 840

tccgcctccc tgaggccgcg ggacccgccc agaccctcga ccggcgagag ccccaggcgc 900

gtttacccgg tttcattttc agttgaggcc aaaatccccg cgggttggtc ggggcggggc 960

ggggctcggg gggacggggc tgaccgcggg gccggggcca gggtctcaca ccctccagag 1020

gatgtacggc tgcgacgtgg ggccggacgg gcgcctcctc cgcgggcata accagttcgc 1080

ctacgacggc aaggattaca tcgccctgaa cgaggacctg agctcctgga ccgcggcgga 1140

caccgcggct cagatcaccc agcgcaagtg ggaggcggcc cgtgtggcgg agcagctgag 1200

aacctacctg gagggcacgt gcgtggagtg gctccgcaga tacctggaga acgggaagga 1260

gacgctgcag cgcgcgggta ccaggggcag tggggagcct tccccatctc ctataggtcg 1320

ccggggatgg cctccaacga gaagaagagg aaaatgggat cagcgctaga atgtcgccct 1380

cccttgaatg gagaatggca tgagttttcc tgagtttcct ctgagggccc cctcttctct 1440

ctaggacaat taagggatga cgtctctgag gaaatggagg ggaagacagt ccctagaata 1500

ctgatcaggg gtcccctttg acccctgcag cagccttggg aaccatgact tttcctctca 1560

ggccttgttc tctgcctcac actcagtgtg tttggggctc tgattccagc acttctgagt 1620

cactttacct ccactcagat caggagcaga agtctctgtt ccccgctcag agactcgaac 1680

tttccaatga atagattatc ccaggtgcct gcgtccaggc tggtgtctgg gttctgtgcc 1740

ccttccccac cccaggtgtc ctgtccattc tcaggctggt cacatgggtg gtcctagggt 1800

gtcccatgag agatgcaaag cgcctgaatt ttctgactct tcccatcaga ccccccaaag 1860

acacatgtga cccaccaccc catctctgac catgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg 1920

ggcttctacc ctgcggagat cacactgacc tggcagcggg atggcgagga ccaaactcag 1980

gacaccgagc ttgtggagac cagaccagca ggagacagaa ccttccagaa gtgggcagct 2040

gtggtggtgc cttctggaga agagcagaga tacacatgcc atgtacagca tgaggggctg 2100

ccgaagcccc tcaccctgag atggggtaag gagggggatg aggggtcata tctcttctca 2160

gggaaagcag gagcccttca gcagggtcag ggcccctcat cttcccctcc tttcccagag 2220

ccatcttccc agtccaccgt ccccatcgtg ggcattgttg ctggcctggc tgtcctagca 2280

gttgtggtca tcggagctgt ggtcgctgct gtgatgtgta ggaggaagag ttcaggtagg 2340

gaaggggtga ggggtggggt ctgggttttc ttgtcccact gggggtttca agccccaggt 2400

agaagtgttc cctgcatcat tactgggaag cagcatgcac acaggggcta acgcagcctg 2460

ggaccctgtg tgccagcact tactcttttg tgcagcacat gtgacaatga aggacggatg 2520

tatcaccttg atggttgtgg tgttggggtc ctgattccag cattcatgag tcaggggaag 2580

gtccctgcta aggacagacc ttaggagggc agttggtcca ggacccacac ttgctttcct 2640

cgtgtttcct gatcctgccc tgggtctgta gtcatacttc tggaaattct ttttgggtcc 2700

aagactagga ggttcctcta agatctcatg gccctgcttc ctcccagtcc cctcacagga 2760

cattttcttc ccacaggtgg aaaaggaggg agctactctc aggctgcgtg taagtggtgg 2820

gggtgggagt gtggaggagc tcacccaccc cataattcct cctgtcccac gtctcctgtg 2880

ggctctgacc aggtcctgtt tttgttctac tccagccagc gacagtgccc agggctctga 2940

tgtgtctctc acagcttgaa aaggtgagat tcttggggtc tagagtgggc gggggggcgg 3000

ggagggggca gaggggaaag gcctgggtaa tggagattct ttgattggga tgtttcgcgt 3060

gtgtgatggg ctgttcagag tgtcatcact taccatgact aaccagaatt tgttcatgac 3120

tgttgttttc tgtagcctga gacagctgtc ttgtg 3155

Claims

1.一种人类白细胞抗原基因检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有检测人类白细胞抗原基因的核酸或者蛋白的试剂；含有人类白细胞抗原基因的扩增引物；或者标记探针或含有人类白细胞抗原的特异性抗体。

2.按权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中所述人类白细胞抗原基因为HLA-B*39:01基因，其核酸序列如SEQNO.1所示。

3.一种对待测样本的HLA-B*39:01基因进行分型的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的检测试剂盒，采用PCR-SSO法进行HLA-B*39:01基因的分型，其包括步骤：

(1)提取待测样本的DNA；

(2)对HLA的多态区域进行扩增；

(3)在扩增过程中对PCR产物进行同位素或非同位素标记；

(4)将PCR产物与膜上的探针杂交、放射自显影，根据信号判断结果。

4.按权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的探针针对PCR扩增产物设计并且固定在膜上。

5.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待测样本为RNA、蛋白、细胞或者血清样本。

6.按权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的待测样本是离体的外周血。

7.权利要求1所述的人类白细胞抗原基因在用于制备预测甲硝唑所致药疹的标记基因中的用途。

8.权利要求1所述的人类白细胞抗原基因在用于制备甲硝唑使用前筛查或评价的试剂盒中的用途。

9.权利要求1所述的人类白细胞抗原基因在用于制备或评价甲硝唑所致药疹的靶向药物中的用途。