CN106282132A - 伪狂犬病毒变异株的弱毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种伪狂犬病毒变异株的弱毒株，该弱毒株是伪狂犬病毒变异株PRVJS-2012株的基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：PRV JS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的全部或部分DNA序列。本发明还公开了上述伪狂犬病毒变异株的弱毒株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。本发明伪狂犬病毒变异株的弱毒株，对PRV变异株和PRV经典强毒株都具有很好的免疫保护效果，接种2周龄内PRV阴性仔猪，没有出现任何临床不良症状，安全性高，适于作为防控伪狂犬病的疫苗候选株。

Description

伪狂犬病毒变异株的弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种伪狂犬病毒变异株的弱毒株及其应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病。PRV能感染多种宿主，但猪是该病毒主要的天然宿主、贮存者和传播者。不同年龄段的猪都可感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪高死亡率，及种猪不育。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组为线状双链DNA,长约150kb,由长独特区(UL)、短独特区(US)及US两侧的重复序列所组成，编码70多种蛋白。病毒粒子由核衣壳、外壳及囊膜三层组成。核衣壳是由6种衣壳蛋白包裹病毒基因组形成的二十面体结构；外壳介于核衣壳与囊膜层间，由14种蛋白组成；囊膜由15种蛋白镶嵌于双层脂膜组成，其中糖蛋白11种。病毒表面蛋白决定了病毒的细胞嗜性，也是主要的保护性抗原。一些重要的病毒基因，如tk和gI/gE，对病毒毒力存在显著影响，其缺失能使病毒致病力减弱。

伪狂犬病最早发生于美国，我国于上世纪40年代末在猫中首次发现了PRV，60年代初在猪群中也出现了该病毒流行，至今伪狂犬病毒仍在我国广泛流行，严重威胁着我国猪群的健康，并造成了严重经济损失。猪感染PRV后，有的呈隐性感染，但长期携带病毒；出现临床症状的耐过猪也能成为病毒的携带者，成为传染源，这增加了PRV防治的难度。为了控制PRV，我国猪场自上世纪90年代开始广泛使用基因缺失的PRV弱毒活疫苗(如PRV Bartha株活疫苗)，猪伪狂犬发病率明显下降，部分种猪场实际已经根除了此病毒。但自2011年以来，许多使用PRV活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等伪狂犬的临床症状。童武、彭金美等人也分别从发病猪中分离到了PRV野毒株，并通过基因序列分析与抗体中和试验证实了分离的野毒株较疫苗株和经典毒发生了较大的变异。这表明，我国猪场中出现了PRV变异株，而目前使用的商品化疫苗对变异株的保护效果差，导致了我国猪场伪狂犬发病率的抬头。为了有效控制PRV变异株的流行，需要开发更为高效的PRV疫苗。而以PRV变异株为基础，研制新的PRV疫苗，将能提高针对PRV变异株的免疫保护效果。

发明内容

本发明要解决目前国内出现PRV变异株，而现有商品化PRV疫苗对变异株保护效果差，亟需开发新的PRV疫苗的技术问题，提供一种伪狂犬病毒变异株的弱毒株，该弱毒株对PRV变异株和PRV经典强毒株都具有很好的免疫保护效果，接种2周龄内PRV阴性仔猪，没有出现任何临床不良症状，安全性高，适于作为防控伪狂犬病的疫苗候选株。

此外，还需要提供一种上述伪狂犬病毒变异株的弱毒株的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种伪狂犬病毒变异株的弱毒株，该弱毒株是伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012株的基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：PRV JS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的全部或部分DNA序列。该PRV JS-2012变异株gE基因CDS区的全部DNA序列如SEQ ID NO.20所示。

优选的，所述缺失的基因序列还包括：PRV JS-2012变异株基因组中US2基因CDS区的全部或部分DNA序列。该PRV JS-2012变异株US2基因CDS区的全部DNA序列如SEQ ID NO.21所示。

更优选的，所述缺失的基因序列包括：PRV JS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的部分DNA序列和US2基因CDS区的部分DNA序列。最优选的，所述缺失的基因序列包括：PRVJS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的第437位碱基至US2基因CDS区的第396位碱基之间的DNA序列，共计连续缺失2307bp，该连续缺失的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的伪狂犬病毒变异株的弱毒株。

所述疫苗组合物适于以滴鼻或注射的方式接种。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述伪狂犬病毒变异株的弱毒株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述伪狂犬病毒变异株的弱毒株与变异株或野毒株感染的检测试剂盒，其特征在于，包含：针对所述弱毒株缺失基因序列设计的引物对。利用设计合成的引物对，通过PCR扩增反应，能区分鉴别出本发明的伪狂犬病毒变异株基因缺失弱毒株与变异株或野毒株。

本发明伪狂犬病毒变异株的弱毒株，是以PRV变异株为基础，通过将伪狂犬变异株JS-2012用Vero细胞在40℃高温下连续传代获得。该弱毒株具有良好的安全性，接种2周龄内PRV阴性仔猪，没有出现任何临床不良症状，能产生gB抗体，但不产生gE抗体。该弱毒株免疫2周龄PRV阴性仔猪后，仔猪能有效抵抗变异和经典伪狂犬强毒的攻击，因此该弱毒株能作为有效防控猪伪狂犬病的疫苗候选株。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的PRV JS-2012-F50毒与亲本毒PRV JS-2012在Vero细胞上的细胞病变图；

图2是本发明实施例1的PRV JS-2012-F120毒在Vero细胞上的早、中、晚期细胞病变图；

图3是本发明实施例1的PRV JS-2012-F120毒及亲本毒PRV JS-2012在Vero细胞上的蚀斑形态图；

图4是本发明实施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因组的gB,gC,gD基因的PCR鉴定结果图；

图5是本发明实施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因组的gI基因的PCR鉴定结果图；

图6是本发明实施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因组的gE基因的PCR鉴定结果图；

图7是本发明实施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因组的US2基因的PCR鉴定结果图；

图8是本发明实施例2的PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比对结果前半段图；

图9是本发明实施例2的PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比对结果后半段图；

图10是本发明实施例2的PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失示意图；

图11是本发明实施例2的PRV JS-2012-F120病毒及亲本毒的PCR鉴定结果图；

图12是本发明实施例3高温传代不同代次病毒接种阴性仔猪后体温动态变化图；

图13是本发明实施例3高温传代不同代次病毒接种阴性仔猪后不同时间点的存活率图；

图14是本发明实施例3高温传代不同代次病毒接种阴性仔猪后不同时间点的gB抗体动态变化图；

图15是本发明实施例3高温传代不同代次病毒接种阴性仔猪后不同时间点的gE抗体动态变化图；

图16是本发明实施例4的PRV JS-2012-F120免疫仔猪后攻毒的不同时间点体温变化图；

图17是本发明实施例4的PRV JS-2012-F120免疫仔猪后攻毒的不同时间点存活率图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

由于目前的猪伪狂犬病毒疫苗不能对现今流行的伪狂犬病毒变异毒株提供较好的免疫保护效果，因此有必要研制PRV新型疫苗。本实验室2012年分离到一株伪狂犬病毒变异强毒株PRV JS-2012。将该变异强毒株用Vero细胞，在40℃高温条件下，连续传代得到的一株弱毒株PRV JS-2012-F120。该弱毒株不仅毒力致弱且gE基因有缺失，该基因缺失为连续缺失，缺失位置在gE基因CDS区的第436位碱基之后至US2基因CDS区的397位碱基之前，共计缺失2307个碱基。该弱毒株具有较好的安全性，接种2周龄内PRV阴性仔猪，没有出现任何不良的临床症状，且将该弱毒株免疫2周龄PRV阴性仔猪后，能有效抵抗变异和经典伪狂犬强毒的攻击。因此本发明弱毒株能作为防控猪伪狂犬病的疫苗候选株。

在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下：

病毒和细胞:Vero细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,保藏号为：GN010)，伪狂犬病毒JS-2012株(本实验室保存；发表文章见：童武，张青占，郑浩，刘飞，姜一峰，单同领，周艳君，童光志.免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.中国动物传染病学报，2013，21(3):1-7)。

其他试剂:胎牛血清，胰酶，DMEN,Life technologies公司产品；DNA提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；2×GC BufferⅡ，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq，DL-15000,DL-2000DNA Marker购自TakaRa；细胞培养耗材购自上海百赛生物科技有限公司。

在本发明的实施例中，Vero细胞的培养方法如下：

Vero细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10％FBS的DMEM培养基，以1:6的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。

实施例1PRV JS-2012高温传代弱毒株的构建

以伪狂犬变异株PRV JS-2012株为基础，将该PRV JS-2012株在Vero细胞上通过40℃连续高温传代，获得了传代毒株PRV JS-2012-F120。PRV JS-2012-F120株在Vero细胞上增殖，其病毒滴度可达10^8.5TCID₅₀/0.1mL，且该毒在Vero细胞上所造成的细胞病变形态及蚀斑形态明显不同于其亲本毒PRV JS-2012。经PCR验证，PRV JS-2012-F120毒株的gE及US2基因均有缺失。

1方法

1.1引物设计

根据PRV JS-2012株的全基因组序列，用Oligo 6.0软件设计了多条引物(见表1)，gBU/gBD，gCU/gCD,gDU/gDD，gIU/gID，gEU/gED，US2U/US2D用于扩增伪狂犬病毒gB,gC,gD,gI,gE,US2基因的部分或全长序列。

表1引物序列

1.2PRV JS-2012病毒的高温传代

37℃，5％的CO₂的培养条件下，Vero细胞在25cm²的细胞培养瓶中培养至单层后，接种含10⁶个TCID₅₀的PRV JS-2012病毒液5ml。将接毒后的Vero细胞放至40℃，5％的CO₂的培养条件下培养，约24h后，待80％-90％的细胞病变后，将病毒放至-20℃冻融一次，再将病毒液转至1.5ml的EP管中10000g离心2min，取上清装置干净的1.5ml的EP管中，将该病毒记为PRV JS-2012-F1。

将PRV JS-2012-F1以含2％FBS的DMEM作1:50稀释，取5ml稀释病毒接种T25细胞瓶中的单层Vero细胞，放至40℃，5％的CO₂的培养条件下培养，待80％-90％的细胞病变后，放至-20℃冻融一次，再将病毒液转至1.5ml的EP管中10000g离心2min，取上清分装于1.5ml的EP管中，将该病毒记为PRV JS-2012-F2。再参照上述方法进行连续传代，直至传至120代，将第120代的病毒记为PRV JS-2012-F120。传代过程中每传至30n-3(n为1,2,3,4)代时通过连续3代蚀斑克隆纯化(过程如下)传代病毒。

将传代病毒以DMEM稀释，接种至60mm细胞培养皿中的Vero细胞单层上，在37℃、5％的CO₂的培养条件下孵育1h后，弃吸附病毒液，并以PBS洗一次，加入含1％琼脂和2％FBS的覆盖层，室温放至琼脂凝固后，将细胞放至37℃、5％的CO₂的培养条件下培养，2至3天后，挑取单一的蚀斑置于0.5mL DMEM中。经1次冻融后，以DMEM稀释蚀斑液，接种60mm细胞培养皿中的Vero细胞单层进行第二轮蚀斑纯化。将第三轮蚀斑液以含2％FBS的DMEM稀释至5mL,接种T25细胞瓶中的单层Vero细胞，放至40℃，5％的CO₂的培养条件下继续传代。

1.3PRV JS-2012-F120病毒的PCR鉴定、毒价测定及蚀斑形态观察

用DNA提取试剂盒提取PRV JS-2012-F120的DNA，用gBU/gBD，gCU/gCD,gDU/gDD，gIU/gID，gEU/gED，US2U/US2D六对引物分别进行PCR鉴定。PCR反应体系均为20μL：2×GCBufferⅡ10ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul；上游引物0.5ul(10pmol/ul)；下游引物0.5ul(10pmol/ul)；LA-Taq 0.5ul；ddH₂O 4.5ul；病毒的DNA 2ul。反应条件均为:94℃预变性5min；94℃变性30s，69℃退火30s，72℃延伸2.5min，循环35次；最后于72℃延伸10min。PCR产物以1％的琼脂糖电泳，凝胶成像仪中观察。

将PRV JS-2012-F120病毒接种Vero细胞，待80％细胞出现CPE时，收获病毒。参照文献(殷震等，动物病毒学，科学出版社，1997),用96孔组织培养板方法测定该病毒的滴度。将该病毒用含2％FBS的DMEM作10倍系列稀释后，将稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的Vero单层细胞。每稀释度接种8孔，设8孔对照(以含2％FBS的DMEM接种),置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，每天观察至接种后第4天，记录出现CPE的孔数，根据Reed-Muench法计算TCID₅₀。

将PRV JS-2012-F120病毒以适当的毒量接种至单层的Vero细胞上，在37℃，5％的CO₂的培养条件下孵育1h，将混合好的琼脂(2％的琼脂与2＊MEM培养基1:1混合，再加入总体积2％的胎牛血清)加到Vero细胞，室温放至琼脂凝固后，将细胞放至37℃，5％的CO₂的培养条件下培养，2至3天后，以5％结晶紫进行染色，观察蚀斑形态。

2结果

2.1PRV JS-2012病毒的高温传代

随着病毒的高温传代，到传至第50代时，PRV JS-2012-F50病毒在Vero细胞上所形成的细胞病变与亲本病毒PRV JS-2012的细胞病变完全不同。亲本病毒感染能导致细胞形成合胞体，感染细胞出现聚集，并成团脱落；而PRV JS-2012-F50感染则呈现单个细胞变圆、脱落，不出现感染细胞聚集(结果见图1，其中A为亲本毒PRV JS-2012在Vero细胞上的细胞病变图，B为PRV JS-2012-F50毒在Vero细胞上的细胞病变图)。50代之后直至第120代时，各代次的传代病毒在Vero细胞上所形成的细胞病变与PRV JS-2012-F50病毒的细胞病变完全一致，图2为PRVJS-2012-F120病毒在Vero细胞上的早期，中期及晚期病变图，图2中，A为早期，B为中期，C为晚期。

蚀斑形态显示：如图3所示，PRV JS-2012-F120病毒与亲本病毒PRV JS-2012的蚀斑形态完全不同，亲本病毒的蚀斑呈圆形(图3A)，而PRV JS-2012-F120病毒的蚀斑呈梭形(图B)。

2.2PRV JS-2012-F120病毒的PCR鉴定及毒价测定

PRV JS-2012-F120在Vero细胞上增殖，经TCID₅₀测定，其病毒滴度可达10^8.5TCID₅₀/0.1mL。PCR鉴定结果显示，gBU/gBD，gCU/gCD,gDU/gDD，gIU/gID引物的结果均呈阳性，说明这些基因均未发生缺失，见图4，图5。图4A、B、C分别为gB、gC、gD的全基因扩增结果，其中数字编号1-3均为PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，4均为阳性对照，5均为阴性对照。图5为gI的全基因扩增结果，其中1-10均为PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，11为阳性对照，12为阴性对照。

gEU/gED，US2U/US2D引物的结果呈阴性，说明这两基因出现缺失，见图6，图7。图6为gE的全基因扩增结果，其中1-20均为PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，21为阳性对照，22为阴性对照。图7为US2的全基因扩增结果，其中1-6均为PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，7为阳性对照，8为阴性对照。

实施例2 PRV JS-2012-F120病毒基因组的缺失序列分析

实施例1中经过PCR验证发现PRV JS-2012-F120病毒的gE，US2基因存在缺失，本实施例针对这两基因设计了1对引物(gE330up/US2down)分别扩增亲本毒PRV JS-2012和传代毒PRV JS-2012-F120的gE至us2基因(见SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.15)，经测序发现，传代毒较亲本毒而言，gE基因CDS区的437位碱基至US2基因CDS区的396位碱基间的DNA序列连续缺失，共计缺失2307个碱基。参照该缺失设计了1对引物(DF120up/DF120down)用于区分PRV JS-2012-F120毒与亲本毒PRV JS-2012。

1材料和方法

1.1引物设计

根据PRV JS-2012株的全基因组序列，用Oligo 6.0软件针对gE和us2基因设计了1对引物gE330up/US2down，gE330up:5’‐GCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGAC‐3’(SEQ ID NO.16)；US2down:5’‐GCCCCGCTCTGTTCTTCCTCCACCC‐3’(SEQ ID NO.17)，用于来扩增PRV JS-2012及PRV JS-2012-F120传代毒的gE至US2的序列。

1.2PRV JS-2012-F120基因组的提取

将PRV JS-2012-F120株接种融合单层的BHK-21细胞，待70％-80％的细胞都产生病变，弃掉四分之三培养液，用细胞刮将细胞刮下，并将细胞液移入50ml离心管，1500rmp离心5min,弃上清，以TNE溶液将沉淀细胞重悬。以酚-氯仿法从感染细胞中提取总DNA,并溶于TE中，于-30℃保存备用。

1.3PCR扩增及测序

将1.2中提取的DNA作为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为20μL：2×GC BufferⅡ10ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul；gE330up 0.5ul(10pmol/ul)；US2down 0.5ul(10pmol/ul)；LA-Taq 0.5ul；ddH₂O 4.5ul；病毒的DNA 2ul。反应条件均为:94℃预变性5min；94℃变性30s，69℃退火30s，72℃延伸2.5min，循环35次；最后于72℃延伸10min。PCR产物以1％的琼脂糖电泳，凝胶成像仪中观察。

回收PRV JS-2012-F120扩增的目的片段，以pMD-18T进行克隆，转化感受态细胞后，筛选阳性菌落进行基因序列测定。

1.4传代缺失株鉴定PCR方法

根据PRV JS-2012-F120缺失区域及两侧序列，设计合成了1对引物：DF120up/DF120down，DF120up：5'-GGCCGGGATCTGGACGTT-3'(SEQ ID NO.18)；DF120down：5'-CGGGTCACGATCTGGGCAT-3'(SEQ ID NO.19)。以PRV JS-2012-F120和PRV JS-2012基因组为模板，参照1.3中的试验方法进行PCR扩增。

2.结果

2.1PRV JS-2012-F120的缺失序列分析

用胶回收试剂盒回收引物gE330up/US2down扩增的PRV JS-2012-F120病毒条带，经连接，转化后挑阳性菌落进行测序，测序结果表明：PRV JS-2012-F120病毒的gE基因CDS区的第437位碱基至US2基因CDS区的第396位碱基均缺失，共计缺失2307bp，见图8、9、10。图8是PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比对结果前半段图，图9是PRVJS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比对结果后半段图。图10A、B均为PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失示意图，其中图10B的红色区域为2307bp连续缺失的位置。

2.2鉴定PCR结果

引物DF120up/DF120down的PCR结果显示，PRV JS-2012病毒扩增出了2728bp的目的片段，与预期结果相符；而PRV JS-2012-F120病毒的目的片段为421bp左右，两片段刚好相差2307bp，与预期结果相符，见图11。这表明，引物DF120up/DF120down检测PRV JS-2012-F120，仅扩增出特异性的421bp的条带，这可区分PRV JS-2012-F120与其它PRV株。在图11中，1为PRV JS-2012-F120毒的目的片段，2为PRV JS-2012毒的目的片段，3为阴性对照,左边的M为2000DNA maker，右边的M为15000DNA maker。

实施例3 PRV JS-2012不同代次的高温传代病毒对14日龄仔猪的致病性实验

选取实施例1中PRV JS-2012-F5，PRV JS-2012-F50，PRV JS-2012-F91，PRV JS-2012-F120，通过滴鼻接种14日龄的PRV阴性仔猪，验证病毒的致弱效果。结果发现PRV JS-2012-F5毒能100％致死试验猪；PRV JS-2012-F50毒能使猪100％发病，但致死率为40％；PRV JS-2012-F91毒能使猪80％发病，但不能使猪致死；PRV JS-2012-F120对14日龄仔猪非常安全。通过分析攻毒后血清中的抗体，结果表明：所有未死的试验猪从第7天之后均能检测到gB基因的抗体，而直至第21天实验结束gE抗体均呈阴性，说明PRV JS-2012-F50，PRV JS-2012-F91，PRVJS-2012-F120病毒gE基因均有缺失。

1材料和方法

1.1试验猪

本实验选取14日龄的阴性仔猪(猪伪狂犬病，病原与抗体均为阴性；猪蓝耳病，猪瘟，猪圆环病毒2型的抗体也均为阴性)20头

1.2动物实验分组与攻毒

将1.1中的20头阴性仔猪随机分成4组，每组5头。第1组5头试验猪分别滴鼻接种PRVJS-2012-F5病毒10⁶个TCID₅₀2ml；第2组5头试验猪分别滴鼻接种PRV JS-2012-F50病毒10⁶个TCID₅₀2ml；第3组5头试验猪分别滴鼻接种PRV JS-2012-F91病毒10⁶个TCID₅₀2ml；第4组5头试验猪分别滴鼻接种PRV JS-2012-F120病毒10⁶个TCID₅₀2ml。攻毒后每天通过直肠检测各组试验猪的体温，并采血分离血清，观察临床症状及死亡情况，并做好记录。

1.3PRV特异性抗体检测

按照说明书，用IDEXX的伪狂犬病毒gB、gE抗体检测试剂盒分别对1.2收集的血清检测PRVgB和gE抗体。

2结果

PRV JS-2012-F5组在攻毒后第2天体温均发烧至41℃以上，攻毒后第4天出现死亡，第5天全部死亡。PRV JS-2012-F50组在攻毒后第2天体温均发烧至40.5℃以上，攻毒后第6天和第8天各死亡1头猪。PRV JS-2012-F91组在攻毒后第2天有4头猪体温发烧至40.5℃以上，其中3头猪持续2至3天后体温恢复正常，1头猪发烧持续7天，另有1头猪整个实验过程中均未见任何临床反应。PRV JS-2012-F120组试验猪在整个实验过程中均未见任何临床症状。结果见图12，图13。这表明，随着病毒传代次数增高，病毒毒力不断下降，120代的病毒PRV JS-2012-F120已对两周龄仔猪不具有致病性，是一株弱毒株。

抗体检测结果显示，PRV JS-2012-F5接种仔猪，在其存活的5d内，gB抗体和gE抗体均为阴性；而PRV JS-2012-F50、PRV JS-2012-F91、PRV JS-2012-F120三组接种存活仔猪，接种后第7d gB呈阳性，而至接种后第21天，gE抗体仍呈阴性(见图14、图15)。PRV野毒感染猪，感染后第7天产生gB抗体，2周后则能检测到gE抗体。本次实验中，接种后存活超过1周的猪，均产生gB抗体，且所有存活的实验猪，到3周时仍不产生gE抗体，表明PRV JS-2012-F50，PRVJS-2012-F91，PRV JS-2012-F120均存在gE基因缺失。PRV JS-2012-F120的gE基因序列检测也证实，其gE基因存在缺失，这与血清学检测结果相一致。

实施例4 PRV JS-2012-F120病毒对14日龄仔猪的免疫保护性试验

将PRV JS-2012-F120接种14日龄仔猪，28天后用变异强毒株PRV JS-2012和经典强毒株PRVSC进行攻击，能获得100％的保护。因此PRV JS-2012-F120毒能作为疫苗候选株，来防控猪伪狂犬病。

1材料和方法

1.1实验仔猪

本实验选取14日龄的阴性仔猪(猪伪狂犬病，病原与抗体均为阴性；猪蓝耳病，猪瘟，猪圆环病毒2型的抗体也均为阴性)20头

1.2动物实验分组与攻毒

将1.1中的20头仔猪，将其随机分成4组，每组5头：第1组与第2组，共10头猪均滴鼻接种PRV JS-2012-F120病毒10⁵个TCID₅₀2ml；第3组与第4组，共10头猪均滴鼻接种不含血清的DMEM 2ml。接种28天后，第1组与第3组，共10头猪均滴鼻接种PRV JS-2012强毒10⁵个TCID₅₀2ml；第2组与第4组，共10头猪均滴鼻接种PRV SC强毒10⁵个TCID₅₀2ml。攻毒后每天通过直肠检测各组试验猪的体温，观察临床症状及死亡情况，并做好记录。

2结果

第1组和第2组在攻强毒后整个实验过程中试验猪均未见任何临床症状。第3组在攻PRVJS-2012强毒后的第2天体温均发烧至41℃以上，攻毒后第4天出现死亡，第7天全部死亡。第4组在攻PRV SC强毒后的第3天体温均发烧至41℃以上，攻毒后第6天死亡2头，第7天和第9天各死亡1头。结果见图16，图17。这表明，以10⁵TCID₅₀PRV JS-2012-F120接种仔猪，能有效抵抗变异强毒和经典强毒的攻击，对仔猪提供完全保护。

鉴于PRV JS-2012-F120对仔猪无致病性，能提供良好的免疫保护效果，且接种仔猪后不产生gE抗体，可作为疫苗候选株，来开发新型PRV疫苗。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种伪狂犬病毒变异株的弱毒株，其特征在于，该弱毒株是伪狂犬病毒变异株PRVJS-2012株的基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：PRV JS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的全部或部分DNA序列。

2.根据权利要求1所述的弱毒株，其特征在于，所述缺失的基因序列还包括：PRV JS-2012变异株基因组中US2基因CDS区的全部或部分DNA序列。

3.根据权利要求2所述的弱毒株，其特征在于，所述缺失的基因序列包括：PRV JS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的部分DNA序列和US2基因CDS区的部分DNA序列。

4.根据权利要求3所述的弱毒株，其特征在于，所述缺失的基因序列包括：PRV JS-2012变异株基因组中gE基因CDS区的第437位碱基至US2基因CDS区的第396位碱基之间的DNA序列，该缺失的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种疫苗组合物，其特征在于，所述组合物包含与佐剂或药用载体混合的权利要求1至4中任一项所述的伪狂犬病毒变异株的弱毒株。

6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物适于以滴鼻或注射的方式接种。

7.权利要求1至4中任一项所述的伪狂犬病毒变异株的弱毒株在制备预防或治疗伪狂犬病的疫苗中的应用。

8.一种区分权利要求1至4中任一项所述伪狂犬病毒变异株的弱毒株与变异株或野毒株感染的检测试剂盒，其特征在于，包含：针对所述弱毒株缺失基因序列设计的引物对。