CN106282070A - 一株多溴联苯醚(PBDEs)降解菌的筛选及应用 - Google Patents
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Abstract
一株多溴联苯醚(PBDEs)降解菌的筛选及其应用,属于环境污染物生物处理技术领域。本发明所提供的PBDEs降解菌株来源于受PBDEs污染的土壤,经人工富集、分离和纯化得到。该菌株为寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii strainWZN‑1),保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏日期为2016年8月30日,保藏编号为CGMCC No.12918。该WZN‑1菌株为革兰氏阴性菌,淡黄色,呈表面***的乳白色不透明圆形菌落。扫描电镜下该菌为杆状,直径0.5‑0.7μm×1‑2μm。在液体培养基中,该菌株对十溴联苯醚(BDE 209)和四溴联苯醚(BDE 47)均具有较好的降解能力。
Description
技术领域
本发明属于微生物及其修复PBDEs污染的应用技术领域。涉及一株PBDEs降解菌寡养单胞菌的筛选方法及其对PBDEs(BDE 47和BDE 209)的降解方法及应用。
背景技术
多溴联苯醚(PBDEs)是一种常用的溴代阻燃剂,由于其阻燃效率高,热稳定性好,所需添加量小,对材料性能影响小及价格便宜等优点,被广泛应用于电子、电器、化工、建筑、交通、纺织、石油和采矿等领域中。PBDEs的化学通式为C12H(0-9)Br(10-1)O,其中氢原子和溴原子之和为10,根据溴原子数量的不同可分为10个系组,共209种同系物。目前,国内外生产并使用的PBDEs产品主要是五溴联苯醚(主要含BDE 47、BDE 99)、八溴联苯醚、十溴联苯醚(主要含BDE 209),其中,十溴联苯醚的使用量最大,占总使用量的80%以上。
PBDEs具有高亲脂性、低水溶性、低蒸气压,可沿食物链逐级放大,并可在环境中远距离迁移。研究表明,PBDEs在土壤,水体,沉积物,大气等不同环境介质中广泛分布。PBDEs具有神经毒性,对内分泌***有干扰作用,具有生殖发育毒性,免疫毒性,并具有一定的致癌毒性。可见,长期的生产、使用PBDEs导致其在环境中的量不断积累,已经对人类健康及环境安全造成了严重威胁。因此,PBDEs的降解已经成为全球环保工作者关注的热点问题。而目前,对于PBDEs降解的研究相对较少,主要集中在化学降解、光降解、微生物降解以及一些联合降解技术。其中,微生物降解是消除环境中PBDEs的重要手段,具有高效、廉价等优点,但目前关于PBDEs微生物降解的研究还较少。因此,筛选高效的PBDEs降解菌,并对降解菌株的生理生化特性、降解特性等进行研究,能够为受PBDEs污染的土壤及水资源修复等研究提供理论依据及技术支持。
发明内容
本发明的目的是解决关于多溴联苯醚的微生物降解问题,提供一种多溴联苯醚降解菌的筛选及应用。
本发明技术方案
本发明首先提供了一株多溴联苯醚(PBDEs)降解菌株寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii strain WZN-1),该菌株已于2016年8月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所),保藏编号CGMCC No.12918,建议分类命名为Stenotrophomonaspavanii。
所述的寡养单胞菌菌株为革兰氏阴性菌,淡黄色,呈表面***的乳白色不透明圆形菌落;扫描电镜下该菌为杆状,直径0.5-0.7μm×1-2μm。
本发明所述寡养单胞菌WZN-1的筛选方法,具体步骤如下:
称取5-10g受多溴联苯醚(PBDEs)污染的土壤样品加入到50-100mL经高温灭菌的0.85%的生理盐水中,充分涡旋后,静置10-30分钟,取5mL土壤上清液过0.45μm滤膜,取1mL滤液转接到10mg/L BDE 209为唯一碳源的无机盐培养基中,于30℃,150r/min恒温摇床中培养,每周转接一次,使BDE 209的最终浓度达到30mg/L,培养3周后,在LB固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化,挑选生长较快的优势菌落,反复纯化3次,得到单一纯菌落,转接到液体LB培养基中扩大培养后,提取该菌株全基因,PCR扩增后,进行16rDNA测序,将所测序列提交GenBank进行分析,鉴定该菌株为PBDEs降解菌株寡养单胞菌。
其中,所述的无机盐培养基的组分包括:1)基础无机盐培养基:Na2HPO4·12H2O25.6g/L,KH2PO43g/L,(NH4)2SO41.77g/L;2)微量元素培养基:HCl 200μL/L,CaCO30.08g/L,FeCl3·6H2O 0.0774g/L,MnCl2·4H2O 0.0115g/L,CuSO4·5H2O 0.00146g/L,CoCl2·6H2O0.0013g/L,ZnO 0.004g/L,H3BO30.00124g/L,EDTA Na4·2H2O 0.792g/L,MgCl2·6H2O0.1342g/L,Na2MoO4·2H2O 0.0104g/L。该无机盐培养基的pH为7.4。
所述的LB培养基组成包括:10g/L蛋白胨,10g/L NaCl,和5g/L酵母浸粉。
本发明同时提供了上述寡养单胞菌WZN-1在多溴联苯醚降解中的应用。
所述的应用是指寡养单胞菌在对BDE 209的降解中的应用;所述寡养单胞菌对BDE209具有较好的降解能力,通过5因素5水平的正交实验,得出该菌株对BDE 209降解的最优条件为:pH 5,25℃,0.5%盐度,150mL培养基体积,500μg/L BDE 209浓度。
同时研究表明在pH 7,25℃,0.5%盐度,150mL培养基体积,65μg/L BDE 209浓度下,55.15%的BDE 209被该寡养单胞菌降解。
另外,所述的应用还指寡养单胞菌在对BDE47的降解中的应用;所述寡养单胞菌对BDE 47也具有较好的降解能力,研究表明在pH=4、5、6、7、8的5个pH梯度下,该菌株对BDE47降解的最优pH为pH=5。
本发明所述多溴联苯醚降解的具体过程和步骤如下:
一、PBDEs的降解
PBDEs的降解采用批实验,首先,将扩大培养后的寡养单胞菌离心清洗后,用无机盐培养基将其悬浮,以104cells/mL接入250mL含有150mL无机盐培养基的棕色血清瓶中。然后,向150mL无机盐培养液中加入一定量的PBDEs。以不接菌的处理作为实验对照。在25±2℃的培养箱中以150rpm/min的转速进行降解培养。在不同的反应时间取样,测定细菌生长量和PBDEs含量变化。
二、PBDEs降解过程中细菌的生长情况测定
实验仪器为CyFlow Space(Partec公司,德国)流式细胞仪,光源功率为50mW,发射波长488nm,采用绝对计数来测定微生物细胞数,其线性范围为2×102~1×105cells/mL,检出限为200cells/mL,绝对计数误差小于5%。荧光染料选用美国Invitrogen公司生产的SYBR Green I。染色方法:取培养液1mL于流式细胞仪专用上样管内,加入10μL SYBR GreenI,振荡混匀,室温下避光静置15min后上样检测。仪器增益设置为FSC=700,SSC=250,FL1=250,FL3=700,Speed=3。用超纯水适当稀释样品以保证测定过程中流式细胞仪计数速度小于500cells/s。
三、液相中PBDEs萃取方法的建立
BDE209和BDE47的萃取采用液液萃取方法。从250mL的棕色血清瓶中取1mL的无机盐样品于灭过菌的5mL离心管中,加入1mL异辛烷,剧烈涡旋5min,然后4℃,10000rpm离心10min。离心后,包含PBDEs的上层异辛烷过0.22μm的有机滤膜后,保存在1.5mL棕色气质小瓶内,-20℃冰箱保存待测。
四、PBDEs的检测
采用GC-MS(7890A-5975C,Agilent Technology,USA),色谱柱为Rtx-1614石英毛细管柱(15m×0.25μm×0.10μm),载气为氦气。升温程序:初始温度110℃,保留5min,然后以25℃/min的速率升至200℃,以15℃/min的速率升至280℃,以20℃/min的速率升至305℃,保留5min。质谱条件为:NCI源,离子源温度150℃,检测电压为70eV。无分流进样1μL,仪器采用选择离子模式,通过外标法对PBDEs进行定量分析。
本发明的优点和积极效果:
本发明与现有修复方法或技术相比有以下显著优点和有益效果:
(1)本发明首次发现寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii strain WZN-1)对PBDEs具有较好的降解能力。
(2)该菌株对于水体中PBDEs的降解,除了菌种以外不需投加任何化学药品和其它添加物,不会产生二次污染。且操作流程简单,对管理条件要求低,可用于PBDEs污染水体的修复。
(3)鉴于PBDEs污染的普遍性和多样性,以及当前PBDEs微生物降解研究的缺乏,利用高效PBDEs降解菌株寡养单胞菌进行PBDEs降解具有非常重要的现实意义和应用价值。
附图说明
图1为寡养单胞菌WZN-1在扫描电镜下的形态(a)和流式细胞检测图(b)。
图2为寡养单胞菌WZN-1的16S rDNA基因序列***发育树。
图3为寡养单胞菌WZN-1在不同LB培养基中36小时内的最大生长量。
图4为寡养单胞菌WZN-1对65μg/L BDE 209的降解曲线和细菌生长曲线。
图5为不同pH条件下寡养单胞菌WZN-1对500μg/L BDE 47的降解率和细菌生长曲线。
下面通过具体实施例并结合附图,对本发明的技术方案作进一步具体的说明。
具体实施方式
实施例1、寡养单胞菌的筛选
称取5-10g受多溴联苯醚(PBDEs)污染的土壤样品加入到50-100mL经高温灭菌的0.85%的生理盐水中,充分涡旋后,静置10-30分钟,取5mL土壤上清液过0.45μm滤膜,取1mL滤液转接到10mg/L BDE 209为唯一碳源的无机盐培养基中,于30℃,150r/min恒温摇床中培养,每周转接一次,使BDE 209的最终浓度达到30mg/L,培养3周后,在LB固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化,挑选生长较快的优势菌落,反复纯化3次,得到单一纯菌落,转接到液体LB培养基中扩大培养后,提取该菌株全基因,PCR扩增后,进行16rDNA测序,将所测序列提交GenBank进行分析,鉴定该菌株为PBDEs降解菌株寡养单胞菌。
其中,所述无机盐培养基的组分,以及所述LB培养基的组成参见发明内容部分。
实施例2
寡养单胞菌在不同浓度LB中的生长情况测定
将实施例1筛选的菌株接种到LB液体培养基中扩大培养后,5×104cells/mL转接至新的LB培养基中,分别于0、4、12、23、30、36h取样,以未接种的LB培养基为空白对照,通过流式细胞技术检测细菌生长情况,获得寡养单胞菌在不同浓度LB中的生长情况。图3为寡养单胞菌在不同浓度LB中,分别为LB、稀释10倍的LB(1/10LB)、稀释100倍的LB(1/100LB)和稀释1000倍的LB(1/1000LB)36小时内的最大生长量,可以看出,该菌株对不同浓度的LB均有很好的利用,36小时内,在不同浓度中的最大生长量分别达到5.0×1010,4.3×109,3.5×108,4.3×108cells/mL。
实施例3
寡养单胞菌对BDE209降解的最优条件
采用正交实验,选定5因素pH、温度、盐度、培养基体积、BDE209浓度,分别设定5水平,pH(5、7、8、9、11),温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃),盐度(0%,0.5%,1%,2%,4%),培养基体积(50mL,100mL,150mL,200mL,250mL),BDE209浓度(50μg/L、100μg/L,250μg/L,500μg/L,750μg/L),优化寡养单胞菌对BDE209降解条件。实验共25个处理,每个处理3个重复,降解时间为7天,研究结果发现,寡养单胞菌对BDE209最优的降解条件为pH为5,温度25℃,盐度为0.5%,培养基的体积为150mL,BDE209的浓度为500μg/L。
实施例4
寡养单胞菌对BDE209的降解
将寡养单胞菌于100mL的液体LB培养基中30℃活化45小时使其达到对数期。将菌株进行离心清洗后,在棕色250mL血清瓶中配制以BDE 209为唯一碳源的150mL无机盐培养基。在pH 7,0.5%盐度下,将寡养单胞菌以6×104cells/mL转接到BDE 209的浓度为65μg/L的无机盐培养基中,以不接菌的处理作为实验对照。在25±2℃的培养箱中以150rpm/min的转速进行降解培养。在不同的反应时间取样,测定细菌生长和PBDEs含量变化。实验结果表明,寡养单胞菌对65μg/L BDE20930天的降解率可达55.15%,如图4。
实施例5
不同pH下寡养单胞菌对BDE47的降解
为考察不同pH值对寡养单胞菌菌株降解BDE 47的影响,设定5个pH梯度(4、5、6、7、8),测定不同pH条件下,该菌株对500μg/L BDE 47的降解率和细菌数量的变化,见图5。结果发现,细菌的数量随pH的增大先增加后降低,pH值为5时,寡养单胞菌对BDE47的降解率最高,为58.85%,此时,菌株的数量也达到最大值为6.95×108cells/mL。
Claims (10)
1.一株多溴联苯醚(PBDEs)降解菌株寡养单胞菌(Stenotrophomonaspavanii strainWZN-1),其保藏号为CGMCC No.12918。
2.根据权利要求1所述的寡养单胞菌WZN-1,其特征在于所述的菌株为革兰氏阴性菌,淡黄色,呈表面***的乳白色不透明圆形菌落;扫描电镜下该菌为杆状,直径0.5-0.7μm×1-2μm。
3.权利要求1所述多溴联苯醚降解菌株寡养单胞菌WZN-1的筛选方法,其特征在于该方法的具体步骤如下:
称取5-10g受多溴联苯醚(PBDEs)污染的土壤样品加入到50-100mL经高温灭菌的0.85%的生理盐水中,充分涡旋后,静置10-30分钟,取5mL土壤上清液过0.45μm滤膜,取1mL滤液转接到10mg/L BDE 209为唯一碳源的无机盐培养基中,于30℃,150r/min恒温摇床中培养,每周转接一次,使BDE 209的最终浓度达到30mg/L,培养3周后,在LB固体培养基上用平板划线法对菌株进行分离纯化,挑选生长较快的优势菌落,反复纯化3次,得到单一纯菌落,转接到液体LB培养基中扩大培养后,提取该菌株全基因,PCR扩增后,进行16rDNA测序,将所测序列提交GenBank进行分析,鉴定该菌株为寡养单胞菌Stenotrophomonaspavaniistrain WZN-1。
4.根据权利要求3所述的筛选方法,其特征在于所述的无机盐培养基的组分包括:1)基础无机盐培养基:Na2HPO4·12H2O 25.6g/L,KH2PO43g/L,(NH4)2SO41.77g/L;2)微量元素培养基:HCl 200μL/L,CaCO30.08g/L,FeCl3·6H2O 0.0774g/L,MnCl2·4H2O 0.0115g/L,CuSO4·5H2O 0.00146g/L,CoCl2·6H2O 0.0013g/L,ZnO 0.004g/L,H3BO30.00124g/L,EDTA Na4·2H2O 0.792g/L,MgCl2·6H2O 0.1342g/L,Na2MoO4·2H2O 0.0104g/L;该无机盐培养基的pH为7.4。
5.根据权利要求3所述的筛选方法,其特征在于所述的LB培养基组成包括:10g/L蛋白胨,10g/LNaCl,和5g/L酵母浸粉。
6.权利要求1所述的寡养单胞菌(WZN-1)在多溴联苯醚降解中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的应用是指寡养单胞菌在对BDE209的降解中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述寡养单胞菌对BDE 209具有较好的降解能力,通过5因素5水平的正交实验,得出该菌株对BDE 209降解的最优条件为:pH 5,25℃,0.5%盐度,150mL培养基体积,500μg/L BDE 209浓度。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述寡养单胞菌对BDE 209具有较好的降解能力,研究表明在pH 7,25℃,0.5%盐度,150mL培养基体积,65μg/L BDE 209浓度下,55.15%的BDE 209被该寡养单胞菌降解。
10.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的应用是指寡养单胞菌在对BDE 47的降解中的应用;所述寡养单胞菌对BDE47具有较好的降解能力,该菌株对BDE 47降解的最优pH为pH=5。
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