CN106278534A - 一种复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法。先将新鲜的海洋藻类植物洗净、除杂、浸泡、磨浆，然后分别制备菌种的种子液，将种子液分多次接种到海藻底料中，实现分级发酵。实验表明，本发明采用的复合分级发酵技术效果明显好于单一菌种发酵以及普通多菌种混合发酵，而且发酵效率高，时间短，整个工艺操控性强，绿色节能，环保。采用本技术制备的海洋生物有机液态肥料的有效活菌数为15亿CFU/ml以上,pH值为6.5‑7.0，N、P、K含量比例为1‑2:1:0.8‑1.5。

Description

一种复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法
技术领域
本发明属于农业肥料领域，具体涉及通过复合微生物发酵技术制备海洋生物有机液态肥料的方法。
背景技术
目前，海洋生物有机液态肥料的生产方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解释放内源物质，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏程度相当大，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力、温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，整个生产过程安全环保无污染。
利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用普通微生物对海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一、稳定、可控的标准，产品的质量难以保障。
发明内容
本发明目的在于提供一种复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，通过复合菌种发酵，使各类菌株发挥协同作用，提高有机液态肥料的肥效。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备产品A：将新鲜的海洋藻类植物洗净、除杂，浸泡12-48h后，磨浆，转入发酵罐内，110-150℃灭菌15-30min，冷却至20-35℃得到产品A；
2)制备种子液：将蜡样芽孢杆菌活化与扩培，制备蜡样芽孢杆菌种子液X；将嗜糖芽孢 杆菌活化与扩培，制备嗜糖芽孢杆菌种子液Y；将解淀粉芽孢杆菌活化与扩培，制备解淀粉芽孢杆菌种子液Z；
3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的10％-20％，发酵温度为30-37℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40％，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品B；
4)制备产品C：调整产品B的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～5天，然后将温度恢复至20℃～35℃，得到产品C；
5)制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的10％-20％，发酵温度为30-34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40％，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品D；
6)制备产品E：调整产品D的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品E；
7)制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，种子液Z用量为产品E质量的10％-20％，发酵温度为30-34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40％，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品F；
8)制备产品G：调整产品F的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品G；
9)制备海洋生物有机液态肥料：向产品G中加入硫酸铵10-15重量份、硫酸钾8-20重量份、磷酸二氢铵5-15重量份、尿素10-15份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋生物有机液态肥料。
所述的步骤1)中的海洋藻类植物为铜藻、海带、褐藻、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。
所述的步骤2)中的蜡样芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：豆粕粉20g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，牛胆盐0.05g，磷酸二氢钾0.04g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇9.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：33℃培养20h。
所述的步骤2)中的嗜糖芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，碳酸钙0.1g，水1000mL，调节pH7.2-7.5，扩培条件为：30℃培养22h。
所述的步骤2)中的解淀粉芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：淀粉20g，豆粕40g，酵母膏6g，磷酸二氢钾2.0g，乙酸钠5.0g,硫酸锰0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.3g，水1000ml，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：35℃培养24h。
所述的步骤3)至步骤8)中的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，磷酸氢二钾，碳酸钠，醋酸钠中的一种或几种。
所述的步骤9)中的海洋生物有机液态肥料的有效活菌数为15亿CFU/ml以上,pH值为6.5-7.0，N、P、K含量比例为1-2:1:0.8-1.5。
所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，其保藏号为CGMCC No12155。
本发明的有益效果：
1.本发明的复混肥的有效活菌数高，均在10亿CFU/g以上。
2.本发明采用复合菌种发酵，各类菌株发挥协同作用，效果肥效均明显优于单一的菌种发酵。
3.本发明采用的复合菌种发酵不同于简单的将不同的菌种种子液混合发酵，而是根据微生物的作用不同，按照先后次序依次分级发酵，避免了微生物菌群间的相互竞争拮抗，减少内耗，将各自菌群的作用发挥到最大化，保证了最好的效果。
4.本发明采用的菌种均经过严格筛选，具有极高的生存繁殖能力和发酵效率，发酵时间不超多24h，最低仅需6h，传统的发酵则要几天到十几天不等。大大提高了生产效率，节省了能耗和成本。
5.使用本发明的工艺生产的海洋生物有机液态肥料肥料重金属含量低，各项指标明显高于行业标准，可明显提高作物产量和抵抗力。
附图说明
图1是显微观察YIC～Alg3菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。
图2是基于16SrDNA序列构建的YIC～Alg3菌株***发育树示意图。
具体实施方式
结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不作为对本发明的限定。
实施例1
1)制备产品A：将新鲜的铜藻和褐藻(质量比1:1)洗净、除杂，浸泡24h后，磨浆，转入发酵罐内，在115℃下灭菌30min，冷却至25℃得到产品A，备用。
2)制备种子液：将蜡样芽孢杆菌活化与扩培，制备蜡样芽孢杆菌种子液X；将嗜糖芽孢杆菌活化与扩培，制备嗜糖芽孢杆菌种子液Y；将解淀粉芽孢杆菌活化与扩培，制备解淀粉芽孢杆菌种子液Z；
所述的蜡样芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：豆粕粉20g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，牛胆盐0.05g，磷酸二氢钾0.04g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇9.5g，水1000mL，调节pH6.8。扩培条件为：33℃培养20h。
所述的嗜糖芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，碳酸钙0.1g，水1000mL，调节pH7.2。扩培条件为：30℃培养22h。
所述的解淀粉芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：淀粉20g，豆粕40g，酵母膏6g，磷酸二氢钾2.0g，乙酸钠5.0g,硫酸锰0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.3g，水1000mL，调节pH7.0。扩培条件为：35℃培养24h。
3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，接种量为10％(所述接种量是指种子液占发酵培养基的质量百分比，下同)，发酵温度为33℃，用柠檬酸和碳酸钠调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在25％，转速为150r/min.通气量在600L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为16h，得到产品B。
4)制备产品C：调整产品B的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至2℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品C；
5)制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，接种量为10％，发酵温度为31℃，用柠檬酸和氨水调节反应的pH值为6.5，溶氧控制在20％，转速为200r/min.通气量在700L/min，发酵罐压应维持在0.03Mpa，发酵时间为16h，得到产品D。
6)制备产品E：调整产品D的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至5℃，保存5天，然后将温度恢复至25℃，得到产品E；
7)制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，接种量为15％，发酵温度为33℃，调节反应的pH值为7.3，溶氧控制在25％，转速为200r/min.通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.04Mpa，发酵时间为17h，得到产品F。
8)制备产品G：调整产品F的pH至5.0，并将发酵罐内温度冷却至2℃，保存4天，然后将温度恢复至25℃，得到产品G；
9)制备海洋生物有机液态肥料(以产品总重量为100份计)：向47重量份产品G中加入硫酸铵10重量份、硫酸钾16重量份、磷酸二氢铵12重量份、尿素15份，搅拌使溶解均匀。
实施例2
1)制备产品A：将新鲜的海带和马尾藻(质量比为1:1)洗净、除杂，浸泡36h后，磨浆，转入发酵罐内，在125℃下灭菌30min，冷却至30℃得到产品A，备用。
2)制备种子液：操作方法与实施例1相同。
3)制备产品B：将种子液X接种到产品A中，接种量为15％，发酵温度为35℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为7.0，溶氧控制在30％，转速为200r/min.通气量在1000L/min，发酵罐压应维持在0.05Mpa，发酵时间为16h，得到产品B。
4)制备产品C：调整产品B的pH至4.0，并将发酵罐内温度冷却至3℃，保存4天，然后将温度恢复至25℃，得到产品C；
5)制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，接种量为15％，发酵温度为33℃，用醋酸和氨水调节反应的pH值为6.8，溶氧控制在25％，转速为200r/min.通气量在800L/min，发酵罐压应维持在0.04Mpa，发酵时间为12h，得到产品D。
6)制备产品E：调整产品D的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至2℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品E；
7)制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，接种量为15％，发酵温度为30℃，调节反应的pH值为7.2，溶氧控制在20％，转速为200r/min.通气量在900L/min，发酵罐压应维持在0.05Mpa，发酵时间为18h，得到产品F。
8)制备产品G：调整产品F的pH至4.0，并将发酵罐内温度冷却至3℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品G；
9)制备海洋生物有机液态肥料(以产品总重量为100份计)：向47重量份产品G中加入硫酸铵10重量份、硫酸钾20重量份、磷酸二氢铵8重量份、尿素15份，搅拌使溶解均匀。
对比例1
1)制备产品A：操作方法同实施例2。
2)制备种子液：只制备单一菌种的种子液，所述的单一菌种为嗜糖芽孢杆菌，活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，碳酸钙0.1g，水1000mL，调节pH7.2。扩培条件为：30℃培养22h。得到产品B。
3)制备产品C：调整产品B的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至2℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品C。
4)制备海洋生物有机液态肥料(以产品总重量为100份计)：向产品C中加入硫酸铵10重量份、硫酸钾20重量份、磷酸二氢铵8重量份、尿素15份，搅拌使溶解均匀。
对比例2
1)制备产品A：操作方法与实施例2相同。
2)制备种子液：操作方法与实施例2相同。
3)制备产品B：将种子液X、种子液Y、种子液Z按照质量比1:1:1混合后接种到产品A中，接种量为15％，发酵温度为35℃，用草酸和醋酸钠调节反应的pH值为7.0，溶氧控制在30％，转速为200r/min.通气量在1000L/min，发酵罐压应维持在0.05Mpa，发酵时间为20h，得到产品B。
4)制备产品C：调整产品B的pH至4.5，并将发酵罐内温度冷却至2℃，保存3天，然后将温度恢复至30℃，得到产品C。
5)制备海洋生物有机液态肥料(以产品总重量为100份计)：向产品C中加入硫酸铵10重量份、硫酸钾20重量份、磷酸二氢铵8重量份、尿素15份，搅拌使溶解均匀。
产品检测：按照中华人民共和国农业行业标准NY/T 884-2012对产品各项指标进行检测，检测结果见表1。
表1：本发明实施例及对比例的质量检测结果
以上结果表明，本发明生产的微生物肥料各项指标均明显高于国家标准，杂菌率明显降低，蛔虫死亡率100％。
将本发明的实施例和对比例相关肥料施于茄子种植地块，亩用量为40kg。种植期为1年，与施用市场购买的类似产品对比，肥效结果见表2。
表2：肥效对比结果
结果表明：在施肥量相当的情况下，使用本发明的海洋生物有机液体肥产品，明显提升作物品质，大大降低了作用病虫害，有效增强作物的抗性，能提高作用产量10-12％；
无论从产品质量以及肥效表现上，本发明采用的复合分级发酵技术效果明显好于单一菌种发酵以及普通多菌种混合发酵。
本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年03月02日，拉丁文分类命名：Bacillus halosaccharovorans。
所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：
YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团(图1)。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素，。菌株16SrDNA序列见附件1，***发育树如图2所示。根据其生理生化特征，16SrDNA序列及***发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。
注：+表示可以利用，～表示不能利用。
本发明所述蜡样芽孢杆菌为公知商品，其拉丁学名：Bacilluscereus.Frankland。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌为公知商品，其拉丁学名：Bacillusamyloliquefaciens。

Claims (8)

1.一种复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）制备产品A：将新鲜的海洋藻类植物洗净、除杂，浸泡12-48h后，磨浆，转入发酵罐内，110-150℃灭菌15-30min，冷却至20-35℃得到产品A；
2）制备种子液：将蜡样芽孢杆菌活化与扩培，制备蜡样芽孢杆菌种子液X；将嗜糖芽孢杆菌活化与扩培，制备嗜糖芽孢杆菌种子液Y；将解淀粉芽孢杆菌活化与扩培，制备解淀粉芽孢杆菌种子液Z；
3）制备产品B：将种子液X接种到产品A中，种子液X用量为产品A质量的10%-20%，发酵温度为30-37℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40%，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品B；
4）制备产品C：调整产品B的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～5天，然后将温度恢复至20℃～35℃，得到产品C；
5）制备产品D：将种子液Y接种到产品C中，种子液Y用量为产品C质量的10%-20%，发酵温度为30-34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40%，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品D；
6）制备产品E：调整产品D的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品E；
7）制备产品F：将种子液Z接种到产品E中，种子液Z用量为产品E质量的10%-20%，发酵温度为30-34℃，用酸碱调节剂调节反应的pH值为5-8，溶氧控制在10-40%，转速为100-250r/min，通气量在500-2000L/min，发酵罐压应维持在0.02-0.08Mpa，发酵时间为8-24h，得到产品F；
8）制备产品G：调整产品F的pH至4.0～5.5，并将发酵罐内温度冷却至0℃～5℃，保存2～7天，然后将温度恢复至25℃～35℃，得到产品G；
9）制备海洋生物有机液态肥料：向产品G中加入硫酸铵10-15重量份、硫酸钾8-20重量份、磷酸二氢铵5-15重量份、尿素10-15份，搅拌使溶解均匀得到100重量份的海洋生物有机液态肥料。
2.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述的步骤1）中的海洋藻类植物为铜藻、海带、褐藻、鼠尾藻和马尾藻中的一种或者任意比例的两种以上。
3.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述的步骤2）中的蜡样芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：豆粕粉20g，酵母膏6g，海藻酸钠1.2g，牛胆盐0.05g，磷酸二氢钾0.04g，氯化钠0.2g，硫酸镁0.2g，甘露醇9.5g，水1000mL，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：33℃培养20h。
4.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述的步骤2）中的嗜糖芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：红薯粉22g，谷氨酸0.03g，酵母膏5g，蛋白胨11g，二氧化锰0.02g，磷酸二氢钾0.02g，氯化铁0.005g，硫酸镁0.2g，碳酸钙0.1g，水1000mL，调节pH7.2-7.5，扩培条件为：30℃培养22h。
5.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述的步骤2）中的解淀粉芽孢杆菌活化与扩培的培养基配方为：淀粉20g，豆粕40g，酵母膏6g，磷酸二氢钾2.0g，乙酸钠5.0g,硫酸锰0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.3g，水1000ml，调节pH6.8-7.0，扩培条件为：35℃培养24h。
6.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述的步骤3）至步骤8）中的酸碱调节剂为柠檬酸，草酸，醋酸，磷酸氢二钾，碳酸钠，醋酸钠中的一种或几种。
7.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述的步骤9）中的海洋生物有机液态肥料的有效活菌数为15亿CFU/ml以上,pH值为6.5-7.0，N、P、K含量比例为1-2:1:0.8-1.5。
8.如权利要求1所述的复合微生物发酵制备海洋生物有机液态肥料的方法，其特征在于：所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，其保藏号为CGMCC No12155。
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