CN106265680A - 常春藤次酸的用途 - Google Patents

Abstract

常春藤次酸的用途，涉及一种天然产物常春藤次酸。常春藤次酸分子式为C₂₉H₄₄O₃，化学名称为3‐氧代‐24‐去甲齐墩果‐12‐烯‐28‐酸。可在制备预防和治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、高血糖、胰岛素抵抗疾病、心血管疾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、肿瘤、肝损伤、炎症、肾脏疾病、胆汁阻塞、胆结石、动脉粥样硬化等疾病的药物或保健品中应用。可在制备抗氧化、防衰老的保健品或护肤品中应用。可作为活性成份与其它药物、与制药中可以接受的赋形剂/或给药载体混合后，制成药物组合物。

Description

常春藤次酸的用途

技术领域

本发明涉及一种天然产物常春藤次酸，尤其是涉及常春藤次酸在医药、保健品和护肤品等领域中的用途。

背景技术

常春藤次酸(Hedragonic acid)，分子式为C₂₉H₄₄O₃，化学名称为3-氧代-24-去甲齐墩果-12-烯-28-酸(3-oxo-24-norolean-12-en-28-oic acid)，结构式如下：

该常春藤次酸的生物学和药物学功能尚未见报道。

糖尿病、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、高血糖、胰岛素抵抗、肿瘤、肝损伤、炎症、肾脏疾病等疾病逝危害人类健康的重大疾病或常见病和多发病，抗氧化和防衰老也是人们非常关切的问题，发现预防或治疗这些疾病的新药将具有重要的社会价值和巨大的经济价值。

全反式维甲酸(ATRA)是目前主要的抗肿瘤药物之一，是目前国内治疗急性早幼粒细胞白血病、骨髓异常增生(白血病前期)、尤其是早幼粒细胞白血病的临床首选药物。但是，有不少类型的肿瘤细胞具有ATRA抵抗性，使ATRA的肿瘤治疗功效受到限制。如人的结肠癌细胞(HCT-15)是ATRA敏感性癌细胞，而HCT-116就是表现为ATRA抗性的结肠癌细胞。因此，发明能对这些具有ATRA抗药性的癌细胞的生长有抑制作用的新的抗癌药物，将对带有抗药性的癌症病患者带来生的希望。

核受体是重要的药物靶标，受核受体调控的基因更与系列重大疾病如糖尿病、肿瘤、炎症、心血管疾病等密切相关。现今全球药物前百名畅销榜上13％都是以核受体为靶蛋白标的，充分说明了核受体及其配体的巨大药物研发价值和重要的经济与社会价值。法尼醇受体FXR(Farnesoid X Receptor)是核受体超家族中的重要成员，最早发现法尼醇(farnesoids)和维甲酸(retinoids)能激活FXR的转录活性，但它们对FXR的亲和力都很低，因此FXR一直被列为孤儿核受体。直至2000年Steven课题组才首次发现了FXR的人工合成配体GW4064。作为FXR的转录激活剂，GW4064的EC50为65nmol/L。接着，人们利用GW4064对FXR的生物学功能进行了一系列的研究，发现FXR在糖代谢、脂代谢、胆固醇-胆酸代谢等代谢调节方面具有重要的功能，FXR还在炎症、肿瘤、肝硬化、脂肪分化、抗氧化、防衰老等方面有重要调控作用。核受体是一种配体激活的转录因子。FXR的配体介导的药理作用原理是配体通过与FXR的配体结合域(LBD)结合，招募各类辅激活因子(或辅抑制因子)来调节下游靶基因。FXR牵涉到许多代谢相关的信号通路，成为治疗代谢疾病如高甘油三酯血症、高胆固醇血症、胆汁阻塞、胆结石、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化和糖尿病等出色的药物靶分子。

大多数小分子药物的疗效是通过结合一种或多种蛋白质“靶标”，进而调节这些“靶标”的功能和信号转导来发挥作用的。因此，药物对蛋白质靶标的识别提供了理解药物作用行动的基础。阐明这些药物的靶标蛋白质，将为疾病的有效治疗提供理论支持，为重要新药的研发提供有效手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种常春藤次酸的用途。

常春藤次酸(Hedragonic acid)，分子式为C₂₉H₄₄O₃，化学名称为3-氧代-24-去甲齐墩果-12-烯-28-酸(3-oxo-24-norolean-12-en-28-oic acid)，结构式如下：

所述常春藤次酸可在制备预防和治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、高血糖、胰岛素抵抗疾病、心血管疾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、肿瘤、肝损伤、炎症、肾脏疾病、胆汁阻塞、胆结石、动脉粥样硬化等疾病的药物或保健品中应用。

所述常春藤次酸可在制备抗氧化、防衰老的保健品或护肤品中应用。

所述糖尿病可以包括但不限于具有高血糖症状的糖尿病。

所述肥胖症可以包括但不限于具有脂肪肝、高血糖症状的肥胖症。

所述脂肪肝可以包括但不限于非酒精性脂肪肝。

所述肝硬化可以包括但不限于具有肝脏胶原过度沉积和肝纤维化表现的肝硬化。

所述胰岛素抵抗疾病可以包括但不限于具有高胰岛素血症的胰岛素抵抗疾病。

所述心血管疾病可以包括但不限于具有高血糖、肝脏脂肪过度积累症状的心血管疾病。

所述肿瘤可以包括但不限于结肠癌、直肠癌、***癌、***、肝细胞癌、乳腺癌和白血病；所述肿瘤还包括表现为全反式维甲酸(ATRA)不敏感的肿瘤，包括但不限于ATRA抗性的结肠癌。

所述肝损伤可以包括但不限于由于服用有肝损伤副作用药物引起的肝损伤、由于酒精引起的急性肝损伤、由酒精性脂肪肝引起的肝损伤、免疫性或化学性因素引起的肝损伤、病毒感染引起的肝损伤；所述有肝损伤副作用药物包括但不限于以对乙酰氨基酚为主要活性成分的药物。

所述炎症可以包括但不限于由于服用有炎症反应副作用药物所引起的炎症、由于酒精引起的急性肝炎、由酒精性脂肪肝引起的肝炎、由非酒精性脂肪肝引起的肝炎、病毒性肝炎、由细菌引起的炎症、由于糖尿病或肥胖症并发症引起的肝炎或肾炎，所述有炎症反应副作用药物包括但不限于对乙酰氨基酚为主要活性成分的药物。

所述肾脏疾病可以包括但不限于有血尿素氮水平异常表现的肾脏疾病、各种肾实质性病变、***；所述肾实质性病变可以包括但不限于肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变等肾实质性病变。

所述常春藤次酸可作为活性成份与其它药物、与制药中可以接受的赋形剂/或给药载体混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成药物组合物，所述药物组合物可采用口服型制剂或注射型制剂药物等，所述口服型制剂可采用片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆等；所述注射型制剂可采用注射液或冻干粉针剂型等。

所述抗氧化、防衰老包括但不限于制备清除超氧阴离子自由基的保健品和护肤品和/或制备增强机体还原性物质如还原性谷胱甘肽的保健品和护肤品中的应用。

实验证明，常春藤次酸在治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝、心血管疾病、高血糖、胰岛素抵抗等疾病的作用。利用糖尿病、肥胖症模型小鼠db/db和KK-Ay，腹腔注射常春藤次酸后，检测代谢相关指标。结果表明，相比空白对照，常春藤次酸处理的模型小鼠血清中葡萄糖、胰岛素的水平明显降低。小鼠肝脏组织冰冻切片油红染色结果表明，常春藤次酸处理组的小鼠肝脏组织中脂肪的量明显低于对照组小鼠。这些结果表明，常春藤次酸在治糖尿病、脂肪肝、肥胖症、心血管疾病、高血糖、胰岛素抵抗等疾病方面具有良好疗效。

实验证明，常春藤次酸在肾脏功能上的作用。血尿素氮是肾功能主要指标之一，血尿素氮过高，预示各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变以及***等。小鼠实验结果显示常春藤次酸能有效降低血尿素氮水平，表明常春藤次酸具有治疗肾脏疾病和保护肾脏功能的作用。

实验证明，利用肝损伤模型小鼠证明常春藤次酸的肝脏保护和修复功能。本发明给C57B6/J小鼠腹腔注射常春藤次酸，然后注射过量对乙酰氨基酚(N-acetyl-para-aminophenol，缩写为APAP)引起肝损伤，24h后检测结果。结果表明，在对照组表现出严重肝损伤的情况下，注射了常春藤次酸的小鼠肝脏形态和肝功能表现基本正常。表明常春藤次酸在肝损伤方面具有优秀的预防和治疗功能。

实验证明，在小鼠模型上证明常春藤次酸在炎症方面的治疗作用。过量使用APAP会引起小鼠肝脏发生炎症。本发明给C57B6/J小鼠腹腔注射常春藤次酸，然后注射过量APAP引起肝脏炎症，检测小鼠肝脏组织中炎症因子的水平。结果表明，相比空白对照处理的小鼠，腹腔注射了常春藤次酸的小鼠肝脏组织中多种炎症因子的基因表达水平显著降低。细胞水平的实施例结果显示常春藤次酸能下调由于LPS诱导的多种炎症因子的表达。表明常春藤次酸在炎症治疗方面具有很好的功能。

实验证明，常春藤次酸能抑制多种肿瘤细胞的生长，包括全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)抗性的人结肠癌细胞HCT116细胞、ATRA敏感的人结直肠腺癌细胞HCT15细胞、人***癌细胞LNCaP细胞、人***细胞Hela细胞、人肝细胞癌细胞HepG2细胞、人乳腺癌细胞MCF7细胞和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7细胞。用常春藤次酸处理过的这些肿瘤细胞在96h的存活率明显低于空白对照处理的细胞。并且随着药物浓度的增加，抑制肿瘤细胞生长的效果越显著。表明常春藤次酸在治疗癌症疾病中的功能，尤其是对ATRA不敏感的结肠癌中的治疗功能。

实验证明，常春藤次酸能激活核受体FXR的转录活性，能诱导FXR募集辅激活因子，表明常春藤次酸是核受体FXR的激动剂，可以通过结合靶标FXR调节FXR在机体中参与的糖代谢、脂代谢、胆固醇-胆酸代谢等代谢、炎症、肿瘤、肝硬化、脂肪分化等方面的功能。

实验证明，常春藤次酸还具有抗氧化和防衰老功能。小鼠MEF细胞实验表明，常春藤次酸处理后的细胞中还原性物质如GSH水平明显高于空白对照组，而且常春藤次酸处理能显著提高小鼠原代肝细胞中抗氧化和防衰老的基因如SOD1、SOD2、SESN1和SESN2的表达水平，也能显著下调促进氧化和衰老的AC5基因的表达水平。表明常春藤次酸具有抗氧化和防衰老功能。

实验证明，常春藤次酸能下调肝脏中肝纤维化的标志基因的表达，能减缓肝细胞炎症反应，降低肝纤维化标志基因表达，能有效消除肝脏中胶原的积累，表明常春藤次酸对肝硬化的治疗功能。

常春藤次酸是从植物中提取的天然产物，迄今未见任何有关其在治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝、心血管疾病、肝硬化、高血糖、胰岛素抵抗、肿瘤、肝损伤、炎症、肾脏疾病等疾病的药物中应用的报道。因此本发明给出的常春藤次酸在这些疾病方面具有治疗功能，都是关于常春藤次酸的新功能。

糖尿病、肥胖症、脂肪肝、心血管疾病、肝硬化、高血糖、胰岛素抵抗、肿瘤、肝损伤、炎症、肾脏疾病等疾病严重影响人类的健康和生命，因此，本发明给出的这种常春藤次酸在制备治疗这些重大疾病的药物制剂方面的实用功能，而且给出常春藤次酸还能抗氧化防衰老，可用于保健品和护肤品中的应用，具有重要的社会价值和巨大的经济价值。

在一些实施方案中，本发明所述方法中的化合物可配制成药物组合物在一些给药方案中应用。本发明药物的组合物可包含所述化合物自身和其给药可用的盐或给药载体。这样的组合物还可选择性地包含其它治疗剂。

“给药载体”一词指可与本发明化合物一起用于病人且不破坏其药理学活性的无毒药物载体。上述药物组合物中的可用给药载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清白蛋白，缓冲介质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素制剂，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，羊毛脂和自乳化药物递送***如α生育酚、聚乙二醇1000琥珀酸酯，或其它类似的聚合物递送模式。

本发明所用的“代谢性疾病”指与代谢相关的任何疾病或紊乱症。例如，代谢疾病包括但不限于：高血糖症、胰岛素抵抗、高脂血症、高血胆固醇症、糖尿病、肥胖症、代谢综合征、代谢紊乱及相关疾病、肝脏的疾病(肝疾病)、脂肪肝疾病(肝脂质沉着症)、非酒精性脂肪肝疾病、肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化、肝纤维化、慢性和急性肝功能衰竭、胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、胆汁淤积、胆石动脉粥样硬化、炎症、癌症，以及上述疾病的共发症。

在某些仅以此处所述化合物作为其活性成分的药物组合物中，其给药方法还可包括用其他的药剂或疗法对所述受试者进行治疗。这样的药剂疗法包括但不限于：贫血症治疗，糖尿病疗法，高血压治疗，胆固醇疗法，神经药物，调节心血管功能的药物，调节炎症、免疫功能、血细胞生成的药物；激素和拮抗剂，影响胃肠功能、微生物疾病的化学治疗药物，和/或肿瘤疾病的化学治疗。

某些药剂或疗法可与本发明所述化合物进行联合给药，如基质金属蛋白酶抑制剂、脂氧合酶抑制剂、细胞因子拮抗剂、免疫抑制剂、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、***素或抗血管过度增生化合物。

本发明所用术语“组合”及其相关词汇依次对应的是治疗剂与本发明化合物是同时或按顺序施用的。例如，所述某化合物可以同时或相继与另一治疗剂在单一单位剂型中施用。因此，本发明提供一种单一单位剂型，包含所述化合物、一种额外的治疗剂。在许多给药方案中，当患者或个体同时暴露于两种或更多药剂时，如果患者或个体在某个特定靶组织或样本(例如，在脑部，在血清等)同时显示出所用试剂的相关治疗效果，通常认为它们是以“组合”的形式发挥作用的。

如若这些化组合物是本发明化合物的药学可用盐制品，那用到的盐应优先来自无机或有机酸和碱。酸性盐包括：乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸、甲苯磺酸盐和十一酸盐。碱盐包括铵盐、碱金属盐(如钠和钾盐)、碱土金属盐(如钙和镁盐)与有机碱盐(如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺盐、或带有氨基酸如精氨酸、赖氨酸等的盐)。

本发明所述化合物组合物还可包括，依赖所需制剂的、可药用的无毒载体或稀释剂。通常将其定义为配制动物或人用的药物组合物的媒介物。应选择合适的稀释剂从而不影响组合物的生物学活性。这样的稀释剂有：蒸馏水、生理磷酸缓冲盐溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。此外，药物组合物或制剂还可包括其他载体、佐剂、或无毒的非治疗性非免疫原性的稳定剂等。

本发明所述化合物组合物还可包括，润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。可药用的抗氧化剂包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、棓酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

本发明的药物组合物可配制成固体或液体的形式。包括以下适合的给药形式：(1)口服给药，如灌药剂(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，颊、舌下和全身吸收剂，大丸剂，散剂，颗粒剂，舌下用的糊剂；(2)肠胃外给药，制备为无菌溶液或悬浮液或持续释放剂，通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；(3)局部应用，如乳膏，软膏，用于皮肤、肺或口腔的释放受控贴剂或喷雾剂；(4)直肠内给药，如作为乳剂或泡沫；(5)其他：舌下含服，眼用，经皮或经鼻、肺和其它粘膜摄入。

所述化合物的药物组合物的制备方法包括用任意工序将本发明化合物与载体或多种辅助成分组合。通常情况下，可将本发明化合物与载体(液体载体、细碎固体载体或两者均有)均匀紧密地组合制备，且根据需要将产物赋形。

某些情况中，可通过减缓药物从皮下或肌肉注慢吸收的速度以延长药效。可以通过制备水溶性差的结晶或无定形物质的液体悬浮液来实现这一目的。药物的吸收速率取决于其溶解速度，其溶解速率又可能取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将药物溶解或悬浮于油性载体中以延迟胃肠外给药吸收。

可通过将所述化合物与微囊基质中可生物降解的聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)结合制成其可注射药物储库剂型。根据药物与聚合物的比例及所用特定聚合物的性质，可控制药物释放的速率。其它可生物降解的聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。也可通过将药物包埋在脂质体或微乳中，以制备与身体组织相容的可注射药物储库剂型。

本发明的药物成分可以任意口服可接受剂型口服给药，剂型包括但不限于：胶囊，片剂，以及水悬浮液和溶液。对于口服片剂而言，其常用包膜有乳糖和玉米淀粉，通常还会加入润滑剂，如硬脂酸镁。对于口服胶囊制剂而言，可用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当以水悬浮液和溶液及丙二醇制剂口服给药时，药物活性成分与乳化剂和悬浮剂结合。如有需要，可加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。

本发明描述的适合口服给药的剂型可以是胶囊剂，扁囊剂，丸剂，片剂，锭剂(通常用蔗糖和***胶或黄蓍胶作为矫味物质)，粉剂，颗粒剂，或溶于水性或非水性液体中制成溶液或悬浮液，或作为油包水或水包油液体乳剂，或作为酏剂或糖浆，或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油或蔗糖和***胶)和/或漱口等方式。各种剂型含有预定量的本发明化合物作为其活性成分之一。本发明所述的化合物也可以大丸剂、药糖剂或糊剂使用。

本发明化合物口服给药的液体剂型包括可药用的的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可含有在本领域中通常使用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯醇、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脂肪酸酯山梨糖醇，以及它们的混合物。

当本发明的药物组合物对目标治疗区域或器官通过局部施用更易起效时，即可选择这种给药方式。为了局部施用于皮肤，可将活性组分悬浮或溶解在给药载体中，再将此药物组合物配制成软膏剂。本发明化合物的局部给药载体包括但不限于：矿物油、液体石油、白石油、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可将活性化合物悬浮或溶解于载体中，再将该药物组合物制成适当的洗剂或霜剂，这类载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明的药物组合物还可通过制成直肠栓剂或适当的灌肠制剂局部应用于下肠道。本发明还包括将化合物制备成局部给药透皮贴剂。

可通过将本发明的药物成分制成气雾剂或吸入剂给药。这样的药剂可根据制药配方领域中广泛应用的技术制备，也将其制备为盐水溶液。这类现有技术常使用苄醇或其它适当的防腐剂、碳氟化合物和/或其他增溶剂或分散剂、吸收促进剂以提高其生物利用率。

透皮贴剂的额外优势是实现本发明化合物对机体的受控递送。可将该化合物溶解或分散在适当的介质中制作这种剂型。可以用吸收增强剂增加皮肤对化合物的吸收。也可通过采用速率控制膜或者将化合物分散于聚合物基质或凝胶中的方式，实现化合物通过皮肤速率的控制。

附图说明

图1为常春藤次酸处理48h降低人结直肠腺癌细胞HCT116细胞的存活率。

图2为常春藤次酸处理96h降低人结直肠腺癌细胞HCT116细胞的存活率。

图3为常春藤次酸处理48h降低人结直肠腺癌细胞HCT15细胞的存活率。

图4为常春藤次酸处理96h降低人结直肠腺癌细胞HCT15细胞的存活率。

图5为常春藤次酸处理48h降低人***癌细胞LNCaP细胞的存活率。

图6为常春藤次酸处理96h降低人***癌细胞LNCaP细胞的存活率。

图7为常春藤次酸处理96h能降低人***细胞Hela细胞的存活率。

图8为常春藤次酸处理96h能降低人乳腺癌细胞MCF-7细胞的存活率。

图9为常春藤次酸处理96h能降低人肝癌细胞HepG2细胞的存活率。

图10为常春藤次酸处理96h能降低小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7细胞的存活率。

图11为小鼠肝脏切片HE染色表明常春藤次酸能保护和修复APAP诱导的肝损伤。

图12为常春藤次酸处理能降低APAP诱导肝损伤的小鼠血清中的AST和ALT活性。

图13为常春藤次酸处理能降低APAP诱导肝损伤的小鼠血清中LDH活性。

图14为常春藤次酸处理能调节APAP诱导肝损伤的小鼠中与肝修复相关的基因表达水平。

图15为常春藤次酸能抑制小鼠肝脏由于APAP引起炎症反应中炎症因子的基因表达。

图16为常春藤次酸能抑制原代肝细胞由于LPS诱导引起的炎症反应中炎症因子IFNγ的表达水平。

图17为常春藤次酸能抑制原代肝细胞由于LPS诱导引起的炎症反应中炎症因子TGFβ的表达水平。

图18为常春藤次酸能抑制原代肝细胞由于LPS诱导引起的炎症反应中炎症因子TNFα的表达水平。

图19为常春藤次酸能抑制原代肝细胞由于LPS诱导引起的炎症反应中炎症因子CD36的表达水平。

图20为常春藤次酸处理能下调db/db小鼠血尿素氮水平。

图21为常春藤次酸处理能降低db/db小鼠血清胰岛素水平。

图22为常春藤次酸处理能降低db/db小鼠血清葡萄糖水平。

图23为常春藤次酸处理能降低db/db小鼠肝脏组织中脂肪的积累。

图24为常春藤次酸处理能降低KK-Ay小鼠肝脏组织中脂肪的积累。

图25为常春藤次酸处理能降低KK-Ay小鼠血清葡萄糖水平。

图26为常春藤次酸能激活核受体FXR的转录活性。

图27为常春藤次酸能诱导核受体FXR与辅激活因子SRC1结合。

图28为常春藤次酸处理能提高MEF细胞还原性物质GSH水平。

图29为常春藤次酸处理能调节原代肝细胞中与抗氧化防衰老相关基因的表达水平。

图30为Masson染色显示常春藤次酸能减少小鼠肝脏胶原沉积。

图31为常春藤次酸能下调肝脏中肝纤维化标志基因的表达。

在图12～15、20～22、25、31中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例一：常春藤次酸能抑制肿瘤细胞生长。

试验方法：MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。该方法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选。它的特点是灵敏度高、经济。本实施例利用MTT法，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养各种人的肿瘤细胞，包括ATRA抗性的人结肠癌细胞HCT116细胞、ATRA敏感的人结直肠腺癌细胞HCT15细胞、人***癌细胞LNCaP细胞、人***细胞Hela细胞、人肝细胞癌细胞HepG2细胞、人乳腺癌细胞MCF7细胞和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7细胞，用工作浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM的常春藤次酸分别处理细胞48h和/或96h后，用MTT法检测细胞存活率。

试验结果：结果如图1～10，在人结肠癌细胞HCT116细胞(图2)、人结直肠腺癌细胞HCT15细胞(图4)、人***癌细胞LNCaP细胞(图6)、人***细胞Hela细胞(图7)、人乳腺癌细胞MCF7细胞(图8)、人肝细胞癌细胞HepG2细胞(图9)和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞Raw264.7细胞(图10)中，用常春藤次酸处理过的肿瘤细胞在96h的存活率明显低于空白对照处理的细胞。并且随着常春藤次酸浓度的越大，抑制肿瘤细胞生长的效果越显著。在人结肠癌细胞HCT116细胞(图1)、人结直肠腺癌细胞HCT15细胞(图3)和人***癌细胞LNCaP细胞(图5)实验中，用常春藤次酸处理过的肿瘤细胞在48h就表现出明显的抑制细胞生长的效果。表明常春藤次酸对这些癌细胞的生长都有抑制功能。

人结肠癌细胞HCT116细胞是表现为对全反式维甲酸(ATRA)抵抗的肿瘤细胞，典型的抗肿瘤药物ATRA也不能有效治疗具有ATRA抗性的肿瘤。本实施例表明，常春藤次酸对这类ATRA抵抗性的肿瘤细胞也有抑制作用，同时也能抑制ATRA敏感性的人结直肠腺癌细胞HCT15细胞，表明了常春藤次酸对ATRA不敏感的肿瘤中优良的治疗功能。

结论：常春藤次酸在结肠癌、直肠腺、***癌、***细胞、肝细胞癌、乳腺癌和白血病治疗方面具有功效。在治疗ATRA不敏感的肿瘤中也具有优秀的功能。

实施例二：常春藤次酸的肝脏保护和修复功能试验。

试验方法：过量服用APAP致小鼠急性药物性肝损伤模型是研究保肝药物常用的模型之一，APAP是通过活性氧或活性氮引起药物性肝损伤的典型代表物。APAP过量使用会引起肝脏活性氧增多，谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT和乳酸脱氢酶LDH等活性上升，导致肝脏组织炎症或坏死。本实施例即采用该模型检测常春藤次酸对APAP诱导形成肝损伤的保护和修复功能。

用8周龄的C57B6/J野生型小鼠，在厦门大学实验动物中心SPF级别动物房，用常规饲料喂养，自由饮水。常春藤次酸用DMSO高浓度溶解，再用40％HBC(2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin)配置成工作浓度，使DMSO浓度为10％，并且使腹腔注射100μl常春藤次酸溶液最终工作浓度为10mg/kg(药物/小鼠体重)和40mg/kg。空白对照组直接用等量的DMSO稀释在40％HBC溶液。每天上午9点注射，每日一次，注射5天后，在第五天下午3点给小鼠注射500mg/kg(药物/小鼠体重)用PBS新鲜溶解配制的APAP。24h后处死小鼠，取部分肝脏组织用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色。部分肝脏组织液氮冻存，Trizol试剂提取RNA，反转录成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测肝脏组织中GCLM、GSTa3、GSTa4、GPX1、UGT1A1等肝脏修复相关基因的表达。取血清，用于检测血清中谷草转氨酶AST、谷丙转氨酶ALT和乳酸脱氢酶LDH活性。

所有实施例中对照组与药物处理组之间的差异用student’s t-test来分析。

试验结果：肝脏切片HE染色结果如图11，空白对照组病理切片可见肝小叶内细胞浸润明显，呈空泡状和坏死灶，小叶内和汇管区有大量炎性细胞浸润，细胞浑浊，核固缩或已溶解破碎，肝细胞索模糊。与空白对照组明显严重的肝损伤相比，注射了常春藤次酸的小鼠肝脏形态显示基本正常(图11)，且工作浓度为10mg/kg和40mg/kg的处理都具有很好的修复效果。使用了常春藤次酸的小鼠血清中AST和ALT活性(如图12)和LDH活性(图13)显著低于空白对照组。肝脏组织中与肝损伤相关的基因表达水平结果也表明，常春藤次酸能上调与外源毒性物质代谢密切相关的功能基因GCLM、GSTa3、GSTa4、GPX1、UGT1A1等肝脏修复相关基因的表达水平(如图14)，表明常春藤次酸能通过外源性药物代谢相关基因的表达调控从而调节保护和修复肝脏功能。

结论：本实施例表明常春藤次酸在肝损伤方面具有很好的保护和修复功能。

实施例三：常春藤次酸在药物引起的炎症反应中的治疗作用。

试验方法：炎症因子是在炎症过程中由细胞产生和分泌参与炎症反应的物质，是反应炎症的标志物。本实施例利用如实施例二APAP药物处理的八周龄的C57B6/J野生型小鼠肝脏组织，用Trizol试剂提取RNA，反转录成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测小鼠肝脏组织中iNOS、TGFβ、TNFα、COX2、IL-1β、和MIP1α炎症因子的表达水平。

试验结果：如图15，相比空白对照，常春藤次酸处理过的小鼠肝脏组织中，iNOS、TGFβ、TNFα、COX2、IL-1β、和MIP1α等多种炎症因子的表达水平都显著下调。

结论：常春藤次酸能抑制由化学药物引起的炎症反应。

实施例四：常春藤次酸在细菌性炎症方面的作用。

试验方法：炎症是动物常见且重要的基本病理过程,任何能够引起组织损伤的因素均可导致炎症的发生。细菌脂多糖(Lipopolysaccharides，简称LPS)是革兰阴性细菌致病的主要因素，它能引起机体的炎症反应。利用LPS诱导的细胞或机体炎症反应，常被用于基因或者药物在炎症中的作用及机理研究。

本实施例利用从C57B6/J野生型小鼠中提取的原代肝细胞，将细胞按5×10⁵个/孔，分在6孔细胞培养板，分成3组，每组3个孔。高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清)培养过夜后，第三组细胞换上含20μM的常春藤次酸(用DMSO溶解)的新鲜培养基(药物组)，第一、二两组细胞用加入与第三组药物等体积的DMSO的新鲜培养基作为对照(对照组)，处理18h后，在第二组对照组中加入20μg/ml的LPS(空白-诱导组)，在第三组药物组中加入20μg/ml的LPS(药物-诱导组)。第一组为空白非诱导组，不加LPS处理。加入LPS处理6h后收细胞，用Omega公司的总RNA提取试剂盒提取细胞RNA，TAKARA公司的反转录试剂盒进行反转录成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，检测细胞内炎症因子的表达水平。

试验结果：从图16～19可以看出，相比空白非诱导组，LPS诱导的细胞中各炎症因子的表达显著上升，表明LPS诱导的细胞炎症反应已经产生。在有常春藤次酸处理过的诱导组细胞中，包括IFNγ、TGFβ、TNFα和CD36等多种炎症因子的表达水平被明显下调，表明常春藤次酸能有效降低细胞内炎症因子的水平，减缓炎症症状。

结论：常春藤次酸在炎症治疗方面具有疗效，包括细菌性炎症。

实施例五：常春藤次酸在治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝、心血管疾病、高血糖、胰岛素抵抗、心血管疾病等疾病方面的作用。

试验方法：db/db小鼠(品系名称BKS.Cg-Dock7^m+/+Lepr^db/JNju)属Ⅱ型糖尿病模型，动物在一个月时开始贪食及发胖，继而产生高血糖、高血胰岛素等症状，脂肪肝、肾炎等也是该疾病模型的并发症。本实施例采用该动物模型研究常春藤次酸在治疗代谢性疾病方面的作用。

利用高脂饲料(Research Diets,D12492)喂养的8-10周龄的雄性db/db小鼠，腹腔注射如实施例二中所述方法配备的常春藤次酸溶液，使腹腔注射100μl常春藤次酸溶液最终工作浓度分别为50mg/kg(药物/小鼠体重)。每日注射一次，第7天注射后空腹6h，收集小鼠血清，用于检测血清中血清葡萄糖和血清胰岛素的水平，分别用以下试剂盒，按照说明书所述方法检测：葡萄糖测定试剂盒-氧化酶法(北京普利莱基因技术有限公司)和小鼠超敏胰岛素试剂盒(Crystal Chem.Inc.,美国)。

取肝脏组织冰冻切片，用于油红染色。油红染色方法：肝脏组织在异戊烷中，在液氮中快速冷冻，嵌入最佳切削温度，在低温恒温器上切削。

油红染料配制：油红O 0.5g，异丙醇(含量98％以上)100ml，24h 60℃烘箱中，充分溶解后作为储存液。临用时取染色原液6ml，加蒸馏水4ml，稀释，静置5～10min后过滤，此液保存不能超过1～2h。

冰冻切片10μm厚，10％多聚甲醛固定10～15min后按常规方法油红染脂肪，苏木精淡染核。

试验结果：相比空白对照组小鼠，常春藤次酸处理的db/db小鼠血清葡萄糖水平明显降低(图22)，血清胰岛素的水平也显著降低(图21)，表明常春藤次酸能通过增强机体胰岛素敏感性来达到降低血糖的效果。

油红O为脂溶性染料,在脂肪内能高度溶解,可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。在日常病理诊断和科研工作中,显示组织内的脂肪常采用油红O进行染色。本实施例油红染色结果表明，常春藤次酸处理的db/db小鼠肝脏组织中油滴明显小于对照组，脂肪积累明显好转(图23)，表明常春藤次酸对脂肪肝有良好疗效。

结论：常春藤次酸可以增加机体的胰岛素敏感性，对胰岛素抗性的疾病有疗效。常春藤次酸可以降低血糖，对糖尿病有疗效。常春藤次酸能有效治疗脂肪肝，包括非酒精性脂肪肝。

糖尿病、胰岛素抵抗和脂肪肝等疾病常常伴随着心血管疾病、肥胖症的表现，常春藤次酸对糖尿病、胰岛素抵抗和脂肪肝有良好疗效，因此分析得出结论，常春藤次酸对心血管疾病、肥胖症也会有治疗效果。

实施例六：常春藤次酸在治疗高血糖和非酒精性脂肪肝等疾病方面的作用。

试验方法：KK-Ay小鼠(KK/Upj-Ay/J)是中度肥胖、中度糖尿病动物模型，八周龄高血糖、高胰岛素、高血脂、葡萄糖耐受不良、肝脏组织脂肪过量积累等症状，其糖尿病由胰岛素抵抗引起(Ⅱ型糖尿病小鼠)。本实施例利用KK-Ay小鼠试验常春藤次酸对代谢性疾病的治疗功能。

利用高脂饲料(Research Diets,D12492)喂养的8-10周龄的雄性KK-Ay小鼠，腹腔注射如实施例二中所述方法配备的常春藤次酸溶液，使腹腔注射100μl常春藤次酸溶液最终工作浓度分别为10mg/kg(药物/小鼠体重)。每日注射一次，第14天注射后空腹6h，收集小鼠血清，用于检测血清中血清葡萄糖水平，用以下试剂盒，按照说明书所述方法检测：葡萄糖测定试剂盒-氧化酶法(北京普利莱基因技术有限公司)。

取肝脏组织冰冻切片，用于油红染色。方法同实施例五。

试验结果：相比空白对照组小鼠，常春藤次酸处理的KK-Ay小鼠血清葡萄糖水平明显降低(图25)，表明常春藤次酸能降低血糖。

油红染色结果表明，仅用10mg/kg的常春藤次酸处理的KK-Ay小鼠，肝脏组织中油滴就会明显小于对照组，脂肪积累明显好转(图24)，进一步表明常春藤次酸对非酒精性脂肪肝的良好疗效。

结论：常春藤次酸可以降低血糖，对糖尿病有疗效。常春藤次酸能有效治疗脂肪肝，包括非酒精性脂肪肝。

实施例七：常春藤次酸在治疗肾脏疾病中的作用

试验方法：肾脏为***尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，肾小管内尿流速越快，重吸收就越少。当肾功能损害时，肾小球滤过率下降，滤过率下降到正常的50％以下时，血尿素氮的浓度迅速升高。各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变均可使血尿素氮增高。因此，血尿素氮是肾功能主要指标之一。血尿素氮升高也可作为***诊断指标之一。

慢性肾脏疾病是糖尿病的并发症之一。本实施例用实施例五中处理的db/db小鼠血清，用南京建成科技有限公司的尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法，C013-2)按说明书测血清中尿素氮的水平。

试验结果：相比空白对照组，常春藤次酸处理的小鼠血尿素氮的水平显著下调(图20)，表明常春藤次酸对肾脏功能的维护和肾脏疾病方面的治疗效果。

结论：常春藤次酸在出现血尿素氮水平升高的各种肾实质性病变，如肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变，以及***等肾脏疾病中具有疗效。

实施例八：报告基因分析方法证明常春藤次酸是FXR的配体。

试验方法：使用含有10％胎牛血清的DMEM培养基进行猴肾上皮细胞COS-7细胞培养，转染前一天在24孔板进行COS-7细胞接种，接种密度为5×10⁴细胞/每孔，第二天进行转染。转染使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染试剂进行瞬时转染。每孔细胞共转染200ng的人源核受体FXR全长表达质粒pCMX-FXR，200ng的内源启动子报告基因EcRE和30ng的Renilla荧光素酶表达质粒，按质粒DNA∶转染试剂为1∶2的比例进行转染。转染5h后，每孔分别加入500μL含有0、1.25μM、2.5μM、5μM和10μM的常春藤次酸的Opti-MEM培养液，处理18h。配体药物处理18h后，用Promega公司的双荧光素梅报告基因分析试剂盒进行报告基因活性分析。裂解细胞用于荧光素酶检测实验，取10μL细胞裂解细胞转移到96孔板，加入50μL荧光素酶反应液后使用EnSpire^TM2300多功能酶标仪(Perkin Elmer)检测在560nm下的发射光信号，后加入反应液终止荧光素酶反应并检测renilla荧光素酶活力。报告基因的活性以renilla活性为内参。

试验结果：相比对照处理的细胞，加入了常春藤次酸的细胞中萤光素酶活性上升。随着常春藤次酸的浓度增加，报告基因的萤光素酶活性呈上升趋势。表明常春藤次酸能激活FXR的转录活性，而且具有浓度依赖性。该结果表明常春藤次酸是核受体FXR的激动剂(图26)。

结论：由于FXR在机体中参与的糖代谢、脂代谢、胆固醇-胆酸代谢等代谢、炎症、肿瘤、肝硬化、肝损伤、脂肪分化等方面的功能，因此常春藤次酸可以通过激活FXR，在这些生理、病理相关的疾病中具有调节功能。也进一步证明了如前面七个实施例中的功能可能就是通过FXR来实现其治疗功能的。

实施例九：AlphaScreen方法证明常春藤次酸是FXR的配体。

试验方法：AlphaScreen(Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay)分析方法是PE公司发明的一种非常灵敏的能检测化合物相互作用的生化分析方法。该方法的简要原理为：用生物素标记的辅调节因子多肽，使其能与标记有Streptavidin的供体珠子结合；用带有六聚组氨酸His6标记的FXR的配体结合结构域(LBD)蛋白，使其能与标记有镍的受体珠子结合。如果在反应体系中加入有配体化合物能诱导FXR构象发生变化从而使其与辅调节因子多肽结合，这时供体珠子与受体珠子靠近，用680nm光激发，就会检测到520－620nm荧光信号。该反应具体操作按照Perkins-Elmer公司的Alpha Screen nickel chelate detectionkit试剂盒进行，反应后用Perkins-Elmer公司的Envision Xcite Multilabel Reader酶标仪读数。

核受体的作用机理是通过与配体(ligand)相互作用而发生构象变化，从而与众多不同辅激活因子选择性结合来调控基因的协调表达。SRC1就是其中一种辅调节因子，核受体与SRC1结合后能启动其转录活性。基于实施例八中证明了常春藤次酸能激活FXR的转录活性，初步判断其为FXR的配体，本实施例通过Alphascreen分析方法，用以检测配体化合物诱导核受体FXR募集辅调节因子SRC1的结合能力。该实验的反应体系是20nM的融合组氨酸标签的FXR受体LBD蛋白，20nM生物素化标记的SRC1-2辅因子多肽，5μg/ml的供体和受体珠子，缓冲液(50mM MOPS,50mM NaF,0.05mM CHAPS,and 0.1mg/ml bovine serum albumin，pH7.4)，加入1μM工作浓度的常春藤次酸，反应体系50μL于384孔板中室温反应1h后用AlphaScreen检测仪读取680nm激发光下520～620nm的发射光信号。用于Alphascreen分析的生物素标记的多肽SRC1-2是SRC1中能与核受体结合的一个多肽序列，序列如下：SPSSHSSLTERHKILHRLLQEGSP。空白对照为用等体积的DMSO代替实验组中的常春藤次酸。

试验结果：相比空白对照组，加入了1μM工作浓度的常春藤次酸的反应中检测到显著提高的荧光信号(图27)。

结论：常春藤次酸能诱导核受体FXR与辅激活因子SRC1结合，进一步表明常春藤次酸是FXR的配体。表明常春藤次酸可以通过激活FXR，在FXR调节的各种生理、病理相关的疾病中具有调节功能，如高甘油三酯血症、高胆固醇血症、胆汁阻塞、胆结石、动脉粥样硬化等。也进一步证明了如前面七个实施例中的功能可能就是通过FXR来实现其治疗功能的。

实施例十：常春藤次酸的抗氧化和防衰老功能试验。

试验方法：还原型谷胱甘肽(GSH)的重要功能之一是作为细胞内的自然抗氧化剂发挥作用。人体衰老、感染、中毒、外源性毒素、氧化应激等都可以使细胞内GSH生物合成能力降低、含量下降，或者使GSH转变为双硫氧化型(GSSG)。

本实施例利用培养的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，用工作浓度为20μM的常春藤次酸处理细胞24h后，用还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成)按说明书所述方法检测MEF细胞中GSH水平。

按常规方法从C57B6/J小鼠中提取原代肝细胞，用工作浓度为20μM的常春藤次酸处理细胞24h后，用Trizol试剂提取细胞RNA，反转录成cDNA后，用实时荧光定量PCR法检测细胞中与抗氧化和衰老相关基因的mRNA表达水平。

试验结果：小鼠MEF细胞实验中，常春藤次酸处理后的细胞中还原性物质GSH水平明显高于空白对照组(图28)，表明常春藤次酸能促进细胞产生抗氧化功能的还原性物质。常春藤次酸处理能显著提高抗氧化基因如SOD1、SOD2、SESN1和SESN2的表达水平，也能显著下调促进氧化和衰老的AC5基因的表达水平(图29)。

结论：常春藤次酸具有抗氧化和防衰老功能。

实施例十一：常春藤次酸能清除超氧阴离子自由基

试验方法：自由基能损坏机体的免疫力、诱导癌变、干扰细胞的修复功能、干扰细胞的新陈代谢等，机体内积累过多自由基，会对造成机体的衰老、癌变、炎症以及免疫性疾病等严重后果。因此，提高机体的抗氧化能力，可以对抗由活性氧及其引起的脂质过氧化产生的疾病。

为了进一步检测常春藤次酸在抗氧化防衰老方面的功效，本实施例参考专利CN102813683 B的方法，采用邻苯三酚自氧化法检测了常春藤次酸清除超氧阴离子自由基的能力。具体操作为：取0.05mol/L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液165μl，置于25℃水浴中预热20min，分别加入40μl 1μmol/L的常春藤次酸和15μl 25mmol/L的邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min，加入40μl 8mol/L的HCl终止反应，以Tris-HCl缓冲液作对照，在299nm处测定吸光度，计算清除率。空白对照组以去离子水代替样品，每个处理均做3个重复。清除率的计算公式：超氧阴离子自由基清除率(％)＝(A1-A2)/A1×100％，其中A1为空白对照的平均吸光度，A2为常春藤次酸的平均吸光度。

试验结果：该反应中常春藤次酸对超氧阴离子的清除率为58％，标准偏差6.4％，student’s t-test分析p<0.01。

结论：表明常春藤次酸对超氧阴离子自由基具有较好的清除效果。结合实施例十的结果，表明常春藤次酸能通过调节过氧化物歧化酶等抗氧化和防衰老的基因表达，清除超氧阴离子自由基，提高细胞内还原性物质水平，从而起到抗氧化和防衰老的功效。

实施例十二:常春藤次酸对肝硬化的功效。

试验方法：脂肪肝是肝脏中过多积累脂肪导致的一种肝病。过多脂肪长期积蓄于肝脏，将影响肝脏血液和氧的供应及肝脏自身代谢，会逐渐造成大量肝脏细胞肿胀、炎症浸润及变性坏死，一旦有纤维增生及假小叶形成，就会成为肝硬化，大大增加患肝癌的危险。肝硬化患者肝脏组织中各种胶原含量都有增加。因此本实施例通过Masson氏染色法鉴定常春藤次酸处理是否能减轻肝脏有脂肪过量积累的小鼠肝脏组织中胶原沉积的症状，并通过荧光定量PCR方法检测胶原蛋白的表达水平。

方法一：

实时荧光定量PCR：将实施例五中小鼠部分肝脏组织液氮冻存，Trizol试剂提取肝脏组织RNA，Takara公司的反转录试剂盒反转录成cDNA后，用天根生化科技有限公司的RealMasterMix(SYBR Green I)试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，Bio-rad公司的CFX96荧光定量PCR仪进行反应。检测肝脏组织中肝胶原和纤维化相关基因的表达。

方法二：

Masson氏染色法师用于显示组织中纤维的染色方法之一，是胶原纤维染色权威而经典的技术方法。Masson氏染色方法是根据不同组织和细胞的空隙和大小不同，因而组织的渗透性不同，其中胶原纤维相对来说结构疏松，渗透性高，能让苯胺蓝(蓝色)这种大分子的染料进入着色，而组织中红细胞、肌纤维部分的空隙较小，因而苯胺蓝不能进入着色。该方法能区分组织中胶原纤维的存在和积累程度。广泛用于***、肌肉组织和胶原蛋白的研究等。本染色方法操作简捷，性能稳定，显色清晰。

本实施例采用南京建成科技有限公司的快速Masson染液试剂盒(货号D026)，按照该试剂盒说明书，对实施例五中处理的小鼠肝脏进行Masson染色，染色结果为：胶原纤维呈蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质呈红色，胞核蓝紫色。

试验结果：荧光定量PCR结果显示(如图31)，肝纤维化的标志基因α1(I)collagen、TIMP1、α-SMA和MCP-1基因在常春藤次酸处理的小鼠肝脏中的表达水平明显低于对照组。

在Masson染色结果中可以看出(如图30)，对照组的肝脏切片中，可以看到血管处有明显的着色蓝色的胶原蛋白沉积，而常春藤次酸处理的小鼠肝脏切片中的血管则无明显的胶原沉积蓝色表现。

结论：结合前面所述实施例中结果，常春藤次酸能减缓肝脏细胞和组织的炎症反应，能减少肝脏组织脂肪积累，常春藤次酸还能降低肝纤维化标志基因表达，有效消除肝脏中胶原的积累，因而常春藤次酸能预防和治疗肝硬化疾病。

Claims (10)

1.常春藤次酸在制备预防和治疗糖尿病、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、高血糖、胰岛素抵抗疾病、心血管疾病、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、肿瘤、肝损伤、炎症、肾脏疾病、胆汁阻塞、胆结石、动脉粥样硬化的药物或保健品中应用；

所述常春藤次酸，分子式为C₂₉H₄₄O₃，化学名称为3-氧代-24-去甲齐墩果-12-烯-28-酸，结构式如下：

2.如权利要求1所述应用，其特征在于所述糖尿病可以包括但不限于具有高血糖症状的糖尿病；所述肥胖症可以包括但不限于具有脂肪肝、高血糖症状的肥胖症；所述脂肪肝可以包括但不限于非酒精性脂肪肝；所述肝硬化可以包括但不限于具有肝脏胶原过度沉积和肝纤维化表现的肝硬化。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于所述胰岛素抵抗疾病可以包括但不限于具有高胰岛素血症的胰岛素抵抗疾病；所述心血管疾病可以包括但不限于具有高血糖、肝脏脂肪过度积累症状的心血管疾病。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于所述肿瘤可以包括但不限于结肠癌、直肠癌、***癌、***、肝细胞癌、乳腺癌和白血病；所述肿瘤还包括表现为全反式维甲酸不敏感的肿瘤，包括但不限于ATRA抗性的结肠癌。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于所述肝损伤可以包括但不限于由于服用有肝损伤副作用药物引起的肝损伤、由于酒精引起的急性肝损伤、由酒精性脂肪肝引起的肝损伤、免疫性或化学性因素引起的肝损伤、病毒感染引起的肝损伤；所述有肝损伤副作用药物包括但不限于以对乙酰氨基酚为主要活性成分的药物。

6.如权利要求1所述应用，其特征在于所述炎症可以包括但不限于由于服用有炎症反应副作用药物所引起的炎症、由于酒精引起的急性肝炎、由酒精性脂肪肝引起的肝炎、由非酒精性脂肪肝引起的肝炎、病毒性肝炎、由细菌引起的炎症、由于糖尿病或肥胖症并发症引起的肝炎或肾炎，所述有炎症反应副作用药物包括但不限于对乙酰氨基酚为主要活性成分的药物。

7.如权利要求1所述应用，其特征在于所述肾脏疾病可以包括但不限于有血尿素氮水平异常表现的肾脏疾病、各种肾实质性病变、***；所述肾实质性病变可以包括但不限于肾小球肾炎、间质性肾炎、急慢性肾功能衰竭、肾内占位性和破坏性病变等肾实质性病变。

8.如权利要求1所述应用，其特征在于所述常春藤次酸作为活性成份与其它药物、与制药中可以接受的赋形剂/或给药载体混合后，按常规的制药方法和工艺要求，制成药物组合物，所述药物组合物可采用口服型制剂或注射型制剂药物，所述口服型制剂可采用片剂、丸剂、胶囊、冲剂或糖浆；所述注射型制剂可采用注射液或冻干粉针剂型。

9.所述常春藤次酸在制备抗氧化、防衰老的保健品或护肤品中应用；

所述常春藤次酸，分子式为C₂₉H₄₄O₃，化学名称为3-氧代-24-去甲齐墩果-12-烯-28-酸，结构式如下：

10.如权利要求9所述应用，其特征在于所述抗氧化、防衰老包括但不限于制备清除超氧阴离子自由基的保健品和护肤品和/或制备增强机体还原性物质如还原性谷胱甘肽的的保健品和护肤品中的应用。