CN106258951B - 一种诱导茶树多倍体材料的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导茶树多倍体材料的方法。它包括以下步骤：（1）催芽剂和诱导剂的配制；（2）催芽；（3）诱导腋芽。本发明方法具有操作简单，仅需要一次诱导，耗时短，同时兼具较高的诱导率和成活率等优点。
Description
技术领域
本发明涉及茶树多倍体的栽培，尤其涉及一种诱导茶树多倍体材料的方法。
背景技术
茶是我国重要的经济作物，属于山茶科山茶属，一般为二倍体。1932年，Karasawa对茶叶细胞学进行研究时发现了茶树中有三倍体存在，正式拉开了茶树多倍体研究的序幕。
茶树多倍体具有适应性广、抗逆性强、内含物多、光合效率强、营养生长旺盛、可育性降低、发芽早等特点，可明显提高茶叶的产量、品质和抗性，且经常会出现新的性状，极大的丰富了茶树的遗传多样性，为茶树新品种的培育提供了新的种质资源。茶树多为无性繁殖并以芽叶为收获对象，这一特点使茶树能够稳定的遗传保存多倍化带来的优良性状，更好的利用多倍体优势。但与其它物种相比，茶树多倍体的育种研究较滞后且热度较低，在茶树多倍体人工诱导方面，国内研究起步较晚且研究较少。
现有的研究报道多数以茶树种子、扦插苗、实生苗以及茶树短穗等为诱导材料，采用浸渍、涂抹、滴液和注射法进行茶树多倍体诱导，这些方法均需多次重复操作，过程繁琐，工作量大，需要较多的秋水仙素，耗费较多财力且诱导率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导茶树多倍体材料的方法，它具有操作简单，仅需要一次诱导，耗时短，同时兼具较高的诱导率和成活率等优点。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种诱导茶树多倍体材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）催芽剂和诱导剂的配制
①配制催芽剂
催芽剂由下述重量百分比的各原料组成：尿素10%～15%，硝酸锌1%～3%，磷酸二氢钾5%～10%，硫酸镁1%～2%，钼酸铵0.1%～0.3%，赤霉素0.3%～0.5%，吲哚乙酸0.1%～0.3%，余量为水；
②配制诱导剂
配制重量百分比为2%的秋水仙素溶液，过滤灭菌后得无菌秋水仙素母液；
配制重量百分比为3%的琼脂溶液，灭菌，保持琼脂为不凝固状态，吸取加入无菌秋水仙素母液，配制成含秋水仙素浓度为3g/L的混合液，摇匀，冷却凝固即得到诱导剂，备用；
（2）催芽
选用萌动的二倍体茶树腋芽为诱导材料，在诱导前一天喷施催芽剂，喷施完成后遮荫；
（3）诱导腋芽
将冷却凝固的诱导剂分割成边长为1～2 cm的正方体，用保鲜膜包裹一层，胶带固定，再在正方体的一个面上扎一个洞，之后套到茶树腋芽上，处理四天后取下。
作为进一步优化，上述过滤操作选用孔径为0.22μm的无菌过滤膜。
作为进一步优化，上述遮荫操作选用遮荫率大于等于90%的遮阳网。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种诱导茶树多倍体材料的方法，与现有诱导方法相比，本方法以春季刚萌动的茶树腋芽为诱导材料，采用改良的琼脂包裹法，建立了一种新型诱导茶树多倍体材料的方法，此方法操作简单，仅需一次诱导，无需连续操作，大大减少了工作量和药剂使用量，整个处理过程只需要五天，耗时短，且同时兼具较高的诱导率和成活率，如其诱导率高达到40%以上，同时成活率高达70%以上。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例 1
一种诱导茶树多倍体材料的方法，其包括以下步骤：
（1）催芽剂和诱导剂的配制
①配制催芽剂
催芽剂由下述重量百分比的各原料组成：尿素12%，硝酸锌2%，磷酸二氢钾8%，硫酸镁1.5%，钼酸铵0.1%，赤霉素0.3%，吲哚乙酸0.3%，余量为水；此催芽剂配制简单，可现场配制；
②配制诱导剂
取1g秋水仙素置于烧杯中，滴加几滴乙醇使其溶解，待完全溶解后，再用蒸馏水定容至50ml，配制成重量百分比为2%的秋水仙素溶液，之后在超净工作台内，利用一次性注射器、孔径为0.22μm的一次性无菌过滤膜过滤，灭菌后得无菌秋水仙素母液，用无菌瓶盛装备用；
配制重量百分比为3%的琼脂溶液，盛装入三角瓶中，灭菌，在超净工作台内，保持琼脂为不凝固状态，吸取加入配制好的无菌秋水仙素母液，吸取一定量加入培养基中，配制成含秋水仙素浓度为3g/L的混合液，摇匀，冷却凝固即得到诱导剂，分装到无菌瓶中备用；
（2）催芽
供试材料为二倍体茶树---黄山苦茶，试验前一年春茶结束后将供试材料进行重修剪；试验时，选用春季刚萌动的茶树腋芽为诱导材料，在诱导前一天喷施催芽剂，以有效增加茶树腋芽的生长速度，并降低诱导死亡率，提高诱导率，喷施完成后用遮荫率90%的遮阳网遮荫；
（3）诱导腋芽
将冷却凝固的诱导剂分割成边长为1.5 cm的正方体，用保鲜膜包裹一层，胶带固定，再用牙签在正方体的一个面上扎破一个洞，之后套到茶树腋芽上，处理四天后取下，整个处理过程均在遮荫条件下进行。
实施例 2
一种诱导茶树多倍体材料的方法，其包括以下步骤：
（1）催芽剂和诱导剂的配制
①配制催芽剂
催芽剂由下述重量百分比的各原料组成：尿素15%，硝酸锌3%，磷酸二氢钾10%，硫酸镁1 %，钼酸铵0.2%，赤霉素0.4%，吲哚乙酸0.1%，余量为水；此催芽剂配制简单，可现场配制；
②配制诱导剂
取1g秋水仙素置于烧杯中，滴加几滴乙醇使其溶解，待完全溶解后，再用蒸馏水定容至50ml，配制成重量百分比为2%的秋水仙素溶液，之后在超净工作台内，利用一次性注射器、孔径为0.22μm的一次性无菌过滤膜过滤，灭菌后得无菌秋水仙素母液，用无菌瓶盛装备用；
配制重量百分比为3%的琼脂溶液，盛装入三角瓶中，灭菌，在超净工作台内，保持琼脂为不凝固状态，吸取加入配制好的无菌秋水仙素母液，吸取一定量加入培养基中，配制成含秋水仙素浓度为3g/L的混合液，摇匀，冷却凝固即得到诱导剂，分装到无菌瓶中备用；
（2）催芽
供试材料为二倍体茶树---黄观音，试验前一年春茶结束后将供试材料进行重修剪；试验时，选用春季刚萌动的茶树腋芽为诱导材料，在诱导前一天喷施催芽剂，以有效增加茶树腋芽的生长速度，并降低诱导死亡率，提高诱导率，喷施完成后用遮荫率90%的遮阳网遮荫；
（3）诱导腋芽
将冷却凝固的诱导剂分割成边长为1.6cm的正方体，用保鲜膜包裹一层，胶带固定，再用牙签在正方体的一个面上扎破一个洞，之后套到茶树腋芽上，处理四天后取下，整个处理过程均在遮荫条件下进行。
实施例 3
一种诱导茶树多倍体材料的方法，其包括以下步骤：
（1）催芽剂和诱导剂的配制
①配制催芽剂
催芽剂由下述重量百分比的各原料组成：尿素10%，硝酸锌1%，磷酸二氢钾5%，硫酸镁2%，钼酸铵0.3%，赤霉素0.5%，吲哚乙酸0.2%，余量为水；此催芽剂配制简单，可现场配制；
②配制诱导剂
取1g秋水仙素置于烧杯中，滴加几滴乙醇使其溶解，待完全溶解后，再用蒸馏水定容至50ml，配制成重量百分比为2%的秋水仙素溶液，之后在超净工作台内，利用一次性注射器、孔径为0.22μm的一次性无菌过滤膜过滤，灭菌后得无菌秋水仙素母液，用无菌瓶盛装备用；
配制重量百分比为3%的琼脂溶液，盛装入三角瓶中，灭菌，在超净工作台内，保持琼脂为不凝固状态，吸取加入配制好的无菌秋水仙素母液，吸取一定量加入培养基中，配制成含秋水仙素浓度为3g/L的混合液，摇匀，冷却凝固即得到诱导剂，分装到无菌瓶中备用；
（2）催芽
供试材料为二倍体茶树---黄观音，试验前一年春茶结束后将供试材料进行重修剪；试验时，选用春季刚萌动的茶树腋芽为诱导材料，在诱导前一天喷施催芽剂，以有效增加茶树腋芽的生长速度，并降低诱导死亡率，提高诱导率，喷施完成后用遮荫率95%的遮阳网遮荫；
（3）诱导腋芽
将冷却凝固的诱导剂分割成边长为1.2cm的正方体，用保鲜膜包裹一层，胶带固定，再用牙签在正方体的一个面上扎破一个洞，之后套到茶树腋芽上，处理四天后取下，整个处理过程均在遮荫条件下进行。
此外，本发明还选取了多个分别经实施例1、2和3处理后所得的实验材料作为多倍体，进行了以下验证试验：
1、多倍体观察鉴定
形态变异观察：在催芽和诱导处理后，定期观察诱变腋芽的生长发育状况，观察测量其叶长、叶宽、叶片形状、叶脉、叶色、叶片厚度、节间长短等性状，对差异较明显的植株挂牌标记进行初步筛选并对成活率和形态变异数进行统计。
染色体计数：选取处理后茶树新稍的叶原基，经0.002 mol/L的8-羟基喹啉常温黑暗处理 3 h后，将材料浸泡于卡诺固定液（乙醇：乙酸=3:1）中，4℃固定24h；之后采用等体积比的浓盐酸乙醇混合液常温解离20min，无菌水漂洗5次，用改良的苯酚品红溶液染色，常规压片法压片；选取染色体分散、清晰的细胞，拍摄显微照片并进行染色体计数。
2、结果分析
1）观察发现：经催芽和诱导处理后，腋芽会变褐，有些可以正常生长，有些则逐渐死亡，与同时期正常二倍体新稍相比，有些多倍化新稍会出现生长发育迟缓，节间变短，叶色变绿，叶肉增厚，叶质***，叶片凹凸不平，叶脉分义；有些会出现茎秆***，腋芽迟迟不发育，变矮胖；有些会出现叶片尖端皱缩，向内凹陷，叶片生有麻斑，扭曲；有些会出现叶片形状发生改变，叶片狭长，叶色深绿；有些会出现叶缘锯齿较稀或消失，叶片生长怪异，叶片之上再生叶片；有些会出现嫩叶颜色发生改变，变为***等变异。
2）对其成活率、形态变异率和多倍体诱导率进行统计后发现，经实施例1、2和3处理后所得的实验材料的形态变异率，分别高达53.33%、55.43%和56.67%，多倍体诱导率为40%、43.33%和42.67%，同时其茶树腋芽的成活率分别高达73.33%、71.52%和75.24%。
Claims (3)
1.一种诱导茶树多倍体材料的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）催芽剂和诱导剂的配制
①配制催芽剂
催芽剂由下述重量百分比的各原料组成：尿素10%～15%，硝酸锌1%～3%，磷酸二氢钾5%～10%，硫酸镁1%～2%，钼酸铵0.1%～0.3%，赤霉素0.3%～0.5%，吲哚乙酸0.1%～0.3%，余量为水；
②配制诱导剂
配制重量百分比为2%的秋水仙素溶液，过滤灭菌后得无菌秋水仙素母液；
配制重量百分比为3%的琼脂溶液，灭菌，保持琼脂为不凝固状态，吸取加入无菌秋水仙素母液，配制成含秋水仙素浓度为3g/L的混合液，摇匀，冷却凝固即得到诱导剂，备用；
（2）催芽
选用萌动的二倍体茶树腋芽为诱导材料，在诱导前一天喷施催芽剂，喷施完成后遮荫；
（3）诱导腋芽
将冷却凝固的诱导剂分割成边长为1～2 cm的正方体，用保鲜膜包裹一层，胶带固定，再在正方体的一个面上扎一个洞，之后套到茶树腋芽上，处理四天后取下。
2.如权利要求1所述诱导茶树多倍体材料的方法，其特征在于：所述过滤操作选用孔径为0.22μm的无菌过滤膜。
3.如权利要求1或2所述诱导茶树多倍体材料的方法，其特征在于：所述遮荫操作选用遮荫率大于等于90%的遮阳网。
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