CN106248854B - 一种测定白酒中100种农药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定白酒中100种农药残留量的方法，包括白酒样品经减压蒸馏除醇，有机溶剂提取，分散固相萃取净化，离心后用配置有程序升温进样口的气相色谱‑三重四级杆串联质谱(GC‑MS/MS)测定白酒中的农药残留量。本方法能有效避免白酒中乙醇对质谱的干扰，具有操作简便、快捷、溶剂用量少、准确、灵敏等特点。

Description

一种测定白酒中100种农药残留的方法

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种白酒中多种类农药残留的测定方法。

背景技术

白酒是以高粱、小麦、玉米等粮谷作为主要原料，经发酵、蒸馏、储存、勾兑而成。高粱、小麦与玉米等粮谷在种植和储藏过程中，可能因污染或违规使用而导致农药残留，这种残留可能经蒸馏工艺迁移进入酒体而给白酒带来食品安全风险。目前，我国尚未制定白酒中农药残留限量国家标准，白酒中农药残留分析方法标准亦为空白，这不利于白酒食品安全风险的监测与管控，以及白酒的国际化发展。

目前，国内外关于白酒中多种类农药残留检测方法的研究报道少见，常用的酒类饮品中农药残留前处理方法主要有液液萃取法(LLE)，固相萃取法(SPE)，固相微萃取法(SPME)，分散固相萃取法(d-SPE)等。农药残留分析技术主要有气相色谱法(GC)，气相色谱-质谱联用法(GC-MS)，高效液相色谱法(HPLC)，液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。这些前处理方法与分析技术大部分应用于酒精度比较低的葡萄酒中多农残的检测，如中国专利CN105334277 A公开了采用GC/MS进行葡萄酒中的农药检测。然而葡萄酒中农药的测定方法并不适用于白酒中农残的测定。这是因为葡萄酒中的主要基质为多酚、糖、色素等，在分析过程中相对容易去除，如色素采用吸附就可以去除。因此，葡萄酒中农残的测定方法相对容易实现。相比于葡萄酒，白酒具有更高的酒精浓度，高浓度的酒精浓度对分析有很大的影响，如GC-MS/MS中，高浓度的酒精使大部分目标物产生基质增强效应、对质谱的峰型产生影响，使方法稳定性差，从而导致定性和定量的不准确。此外，白酒中还含有丰富的酸、酯、醇、醛、吡嗪、糠醛及酚类等风味物质，从如此复杂的基质中分析痕量农药残留，采用传统的固相萃取法(SPE)具有操作繁琐，溶剂用量大，检测限高等弊端。

由于白酒上述特性，导致其测定农残等物质时前处理要求高，在现有为数不多的白酒中农药残留检测方法相关文献的报道中，其农药种类覆盖面窄，前处理复杂，溶剂用量大，易产生假阳性结果，因此，发明一种白酒中高效准确的多农残测定方法极为必要。

发明内容

为了解决现有技术中白酒农药残留检测分析种类单一、前处理复杂、结果不准确的缺陷，本发明提供了一种高效、准确测定白酒中多种痕量农药残留的方法。

本发明目的通过以下技术手段实现：

本发明提供了一种配置有程序升温进样口的气相色谱-三重四级杆串联质谱(GC-MS/MS)测定白酒中多种农药残留的方法。

前处理为白酒样品经减压蒸馏除醇，乙腈提取，分散固相萃取净化，离心后用GC-MS/MS分析测定白酒中的农药残留量。

更具体地，所述的一种测定白酒中100种农药残留量的方法，包括以下步骤：

S1.减压旋蒸除醇及提取：取白酒样品于旋转蒸发瓶中，减压蒸馏，将剩余样品移入离心管中，量取乙腈分两次润洗旋转蒸发瓶，并转移到离心管中，漩涡振荡后加入氯化钠，漩涡振荡后静置使乙腈相与水相分层。

S2.净化：移取样品提取上清液于离心管中，加入分散固相萃取材料，立即振荡，漩涡振荡后离心，吸取上清液过滤膜。

S3.GC-MS/MS测定：按照气相色谱－质谱/质谱条件测定步骤S2中过滤后的样品和标准工作溶液，质谱采用SRM模式对每个目标物的定性定量离子对进行采集；通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果；定性时应当与标准物质的保留时间、定性离子对、离子丰度比相一致，且相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物；定量测定时采用标准曲线法；更进一步地，为外标法。

上述方法中，每5～20mL白酒样品，加入5～20mL乙腈，氯化钠3～6g氯化钠：每1mL减压除醇的上清液加入每毫升上清液加入150-200mg分散固相萃取材料。

所述的分散固相萃取材料为无水硫酸镁和乙二胺-N-丙基硅烷PSA。进一步地，所述的进一步地无水硫酸镁与乙二胺-N-丙基硅烷PSA的重量比为5-25：1-5。在本发明优选的实施例中，无水硫酸镁与乙二胺-N-丙基硅烷PSA的重量比为6：1。

考虑到白酒样品无色素，相对于谷物蔬菜样品，其基质较为干净，采用无水硫酸镁结合PSA的净化材料组合对乙腈萃取上清液进行净化，无水硫酸镁用于去除萃取液中含的少部分水，以避免其对仪器的伤害；PSA用于吸附萃取液中的极性基质成分，如脂肪酸、有机酸、酚类物质等。并以回收率、精密度、检出限等参数作为考核指标进行实验验证。实验结果显示(表1、2)，该方法回收率与精密度均良好，适用于白酒中痕量多农残的同时分析测定。

步骤S1中，旋转蒸发的转数为80-130rpm，泵的压力为20-80mbar，水浴温度为40-45℃；优选地，转速：100rpm；压力：50mbar，温度：40℃。当水浴温度低于40℃时，乙醇挥发速度慢，而当水浴温度高于45℃时，部分待测农残会挥发或降解，如大部分有机磷类农药。发明人经过多次摸索实验，发现在上述旋蒸条件下，可以快速的实现去除白酒样品中的大部分乙醇，同时保证待测化合物不发生降解。在本发明一优选的实施例中，综合考虑旋蒸效果与旋蒸时间及旋蒸温度，选择旋蒸条件为：转速：100rpm；压力：50mbar，温度：40℃。此条件下，10mL的白酒样品约5min可以旋蒸结束。

作为优选地，步骤S3中，GC-MS/MS的测定条件为以下：

色谱条件：进样体积：1μL；进样模式：PTV不分流进样；Surge压力：150kPa(1min)；进样口初始温度：90℃，进样后以10℃/s快速升至280℃；毛细管柱：TR-Pesticide II[(50％苯基)甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm+5m×0.25μm Guard(预柱)]；载气：He,纯度≥99.999％；载气流速：1.2mL/min；色谱柱升温程序：色谱柱的升温程序为88-92℃保持4-6min，然后以20--30℃/min升至175-185℃，保持14-16min，再以4-6℃/min升至270-290℃，保持3-5min。

在本发明一优选的实施例中，色谱柱的升温程序为90℃保持5min，然后以25℃/min升至180℃，保持15min，再以5℃/min升至280℃，保持4.5min；色谱-质谱接口温度：290℃。

质谱条件：离子源温度：250℃；发射电流：50μA；离子源：封闭式EI源；碰撞气压力：1.2mTorr(Ar)；溶剂延迟时间：7.0min；扫描模式：MRM(多反应离子监测)，采用“EZ-Method”设定方法，“Start time”设定为目标化合物扫描时间起点，为“目标化合物保留时间RT-0.75min”，在“End time”设定为目标化合物扫描时间终点，为“目标化合物保留时间RT+0.75min”。

本发明选择TR-Pesticide II农残柱作为分析色谱柱，通过不断修改程序升温条件，使色谱峰相对均匀的分布到保留时间轴上，并固定优化的条件。

质谱条件选择策略：质谱数据采集模式为SRM模式，SRM参数包括监测离子对、碰撞能和扫描时间窗口等参数。首先通过全扫描获得保留时间和丰度较高、质荷比较大、特征性强母离子，采用不同的能量轰击母离子，得到不同能量轰击条件下的二级质谱图，从二级质谱图中选择丰度较高、质荷比较大、特征性强的离子作为子离子，并记录对应的碰撞能量，再在记录的碰撞能量附近缩小能级，做二次能量优化得到最佳碰撞能量。扫描时间窗口一般设置为“保留时间±0.75min”，个别农药如氯氰菊酯因其同分异构的存在出现四个相连的色谱峰，其出峰时间窗口相对较宽，因此设置其扫描时间窗口为“保留时间±1.25min”，确保目标化合物在设定的扫描时间窗口出峰，同时能容忍目标化合物的保留时间在一定程度上的偏移。

作为优选地，步骤S3中标准溶液的配制方法为：

1)单一标准储备液(100μg/mL)

分别称取每种农药标准物质0.01g于不同的100mL容量瓶中，精确至0.0001g，用甲苯溶解并稀释定容。避光贮存于-18℃条件下，有效期6个月。

2)混合标准储备液(2μg/mL)

移取各农药单一标准储备液2mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释定容。避光贮存于-18℃条件下，有效期3个月。

3)基质匹配标准工作液

选取不含有待测农药残留的同类型白酒样品作为该类型空白样品。对空白酒样按所述前处理方法处理后得到空白基质溶液，用空白基质溶液、混合标准储备液配制基质匹配系列标准工作溶液。此溶液应即配即用。

作为优选地，本发明的检测方法可以同时测定白酒样品中的100种以上的农药，优选的农药为实施例中的表一所列举的，但并不限于表1，只要是可以进行GC-MS/MS分析的农药化合物均可以采用本方法测定。

高粱、小麦、玉米等粮谷作为白酒主要原料，在种植和储藏过程中，可能因污染或违规使用而导致农药残留，这种残留可能经蒸馏工艺迁移进入酒体而给白酒带来食品安全风险。因此，有必要构建一种可以及时有效的检测白酒中多种农药的检测方法。现有的含酒精饮料的检测方法主要针对葡萄酒，而较少涉及白酒。因为白酒与葡萄酒基质具有重大的差异。相比于葡萄酒，白酒中含有大量的乙醇，还含有多种极微量的风味物质，这些物质均会对痕量的农药检测带来干扰，导致现有技术中的葡萄酒检测方法不适用于白酒的检测。

本发明首次采用了减压低温旋蒸、分散固相萃取净化的前处理技术与GC-MS/MS检测技术集成，可实现同时测定白酒中的100种农药残留，现有技术中，酒精性饮料的测定方法一次只能测定几十种或者一类药物，如中国专利CN 105334277 A，测定了葡萄酒中的52中农药。而针对白酒，一般只能测定其中的一类残留农药，如李俊等(李俊，王震，庞宏宇，张艺骥，郭晓关；白酒中多种拟除虫菊酯类农药残留检测方法[J]；酿酒科技；2013年11期)等的测定了白酒中的拟除虫菊酯类农药；王蓉等(王蓉，袁东，付大友，李艳清，谭文渊，吴芳碧；气相色谱/质谱法测定白酒中的有机氯农药残留[J]；酿酒科技；2007年12期)测定了白酒中的有机氯农药；李艳清等(李艳清，谭文渊，王蓉，袁东，王海容；白酒中氨基甲酸甲酯农药残留量的GC/MS测定方法研究；酿酒科技[J]；2008年6期)。本发明可以同时对100种或以上的不同种类的农药进行测定，测定的种类包括有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类等农药，更具有显著进步的是，样品只需经过一次处理，一针进样、并在50分钟以内完成100种农药残留的同时测定(不包括前处理)。

本领域技术人员公知，采用GC-MS/MS进行化合物的测定时，分析的化合物越多，对样品及前处理还有分析的参数要求越高。本发明通过简单快速的前处理，就可以实现100种化合物的同时测定，且100种农药在白酒中的检出限低于12μg/L，定量限低于38μg/L。在4μg/L～753μg/L范围内，线性相关系数为大于0.99。

本发明一个突出点在于，将减压旋转蒸发、分散固相萃取等样品前处理技术与高通量、高灵敏度、强抗干扰能力的GC-MS/MS检测技术集成创新，突破现有技术中检出限高、同时分析种类少、易产生假阳性结果的技术瓶颈，实现对高乙醇浓度白酒中百种以上农药同时分析的检测能力。现有技术中，对于其他含酒精样品中农药残留物的分析，多采用液液萃取的前处理方式或是固相萃取前处理技术，如薛洁等(薛洁,张敬,梁萌萌,等.葡萄酒中农药残留的调查研究[J].酿酒科技,2014(7):4-8)采用液液萃取和GC-MS测定葡萄酒样品中的农残。发明人也曾尝试过液液萃取的前处理：实验选择了58种农药作为研究对象，分别用正己烷和甲苯对10μg/L和50μg/L两个浓度水平的农药进行直接液液萃取，萃取前加入氯化钠到饱和，考察其回收率情况。结果表明，大部分农药存在不同程度的基质增强效应，另外，由于受酒样中高浓度乙醇含量的影响，在反复测定时峰形不稳定，且液液萃取需要大量的有机溶剂。固相萃取则需要过柱、洗脱、除有机溶剂等多个步骤，此外，萃取柱应用成本高。针对上述的问题，本发明采取减压旋蒸除醇、乙腈提取后分散固相萃取净化的策略对样品进行处理，省时省力、成本低，且对后续的分析基质效应小。

本发明达到的有益效果：

1.本发明建立了白酒样品中农药残留物的气相色谱-质谱串联的检测方法，同时对100种农药残留物进行检测。

2.通过特定条件下的旋蒸去除白酒中的乙醇。

3.试剂种类少，只需添加乙腈和氯化钠萃取，分散固相剂净化，有机溶剂用量小。

4.简便快速，前处理操作简单，100种农药残留物在50分钟内即可测定完成。

5.准确，100种农药在白酒中的检出限低于12μg/L，定量限低于38ug/L。在4μg/L～753μg/L范围内，线性相关系数为大于0.99。

附图说明

图1 100种农药的选择性反应监测总离子流图

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。通过下述实例将有助于理解本发明，但不限制本发明的内容：

实施例1 GC-MS/MS测定白酒中100中农药残留的方法

1.标准溶液的配置：

1)单一标准储备液(100μg/mL)

分别称取每种农药标准物质0.01g于不同的100mL容量瓶中，精确至0.0001g，用甲苯溶解并稀释定容。避光贮存于-18℃条件下，有效期6个月。

2)混合标准储备液(2μg/mL)

移取各农药单一标准储备液2mL于100mL容量瓶中，用乙腈稀释定容。避光贮存于-18℃条件下，有效期3个月。

3)基质匹配标准工作溶液

选取不含有目标农药残留的同类型白酒样品作为该类型空白样品。对空白酒样按所述前处理方法处理后得到空白基质溶液，用空白基质溶液、混合标准储备液配制基质匹配系列标准工作溶液。此溶液应即配即用。

2.样品的前处理

2.1减压除醇及提取：取10mL酒样于50mL的旋转蒸发瓶中，100rpm,50mbar,40℃减压蒸馏5分钟，将剩余的样品移入50mL离心管中，准确移取10mL乙腈分两次润洗旋转蒸发瓶，并转移到50mL离心管中，涡旋振荡提取2min后再加3g氯化钠，2000rpm漩涡振荡30s后静置使乙腈相和水相分层。

2.2净化：移取1mL上清液于含有净化材料组合(含150mgMgSO4与25mgPSA)的2mL离心管中，立即手持振荡，2000rpm涡旋振荡5min，6000rpm离心5min，吸取适量上清液过0.22μm滤膜后待GC-MS-MS分析，外标法定量。

3.上样分析

仪器参数为：仪器参数为:色谱条件：进样体积：1μL；进样模式：PTV不分流进样；Surge压力：150kPa(1min)；进样口初始温度：90℃，进样后以10℃/s快速升至280℃；毛细管柱：TR-Pesticide II[(50％苯基)甲基聚硅氧烷，30m×0.25mm×0.25μm+5m×0.25μmGuard(预柱)]；载气：He,纯度≥99.999％；载气流速：1.2mL/min；色谱柱升温程序：90℃保持5min，然后以25℃/min升至180℃，保持15min，再以5℃/min升至280℃，保持4.5min；色谱-质谱接口温度：290℃。质谱条件：离子源温度：250℃；发射电流：50μA；离子源：封闭式EI源；碰撞气压力：1.2mTorr(Ar)；溶剂延迟时间：7.0min；扫描模式：MRM(多反应离子监测)，采用“EZ-Method”设定方法，“Start time”设定为目标化合物扫描时间起点，为“目标化合物保留时间RT-0.75min”，在“End time”设定为目标化合物扫描时间终点，为“目标化合物保留时间RT+0.75min”。各农药的定性离子对、定量离子对、碰撞能及保留时间见表1。

4.标准曲线、检出限、定量限、回收率和精密度的测定

用空白白酒样品即不含待测农药的白酒样品按照实施例2样品前处理步骤制备阴性基质溶液，用适量阴性基质溶液、混合农药标准溶液，配制成7个浓度梯度的标准曲线，以目标物峰面积作为纵坐标，目标物的浓度作为横坐标，作图得到线性范围和线性相关系数；以信噪比S/N≥3时的目标物浓度确认检出限(LOD)，以信噪比S/N≥10时的目标物浓度确认定量限(LOQ)。分别在阴性白酒样品中添加从低到高三个浓度水平的100种农药标准品，添加浓度在3.7～152.0μg/L之间，每个水平做三个平行样品，同时做0溶剂空白和样品空白对照，按所述方式处理后进仪器分析，每个水平重复测定6次。

当添加浓度为3.7～25.0μg/L的第一浓度水平时，回收率在66.8％～122.1％之间，相对标准偏差在2.4％～19.1％之间；当农药标准品添加浓度在7.3～76.0μg/L的第二浓度水平时，回收率在64.6％～123.5％之间，其中有96种农药的回收率在70.0％～120.0％之间，100种农药的相对标准偏差在1.3％～18.4％之间；当添加浓度在36.5～152.0μg/kg的第三浓度水平时，除α-六六六、氟氯氰菊酯、***磷的回收率分别在60.6％、69.2％、123.8％之外，其余农药回收率均在70.0％～120.0％之间，相对标准偏差在1.3％～12.8％之间。100种农药在白酒中的检出限(LOD)为0.2～11.2μg/L，定量限(LOQ)为0.7～37.5μg/L。在4μg/L～753μg/L范围内，线性相关系数为0.9937～1.0000。

各农药的线性范围、线性相关系数、检出限与定量限见表1；各农药的在相应添加浓度水平下的回收率和相对标准偏差见表2。

表1多反应监测模式下100种农药的保留时间、监测离子对、碰撞能、线性范围、线性相关系数、检出限(LOD)、定量限(LOQ)

表2 100种农药在白酒中三个添加水平的平均回收率和相对标准偏差(n＝6)

实施例2前处理条件的选择

减压旋蒸条件摸索：取10mL酒样50mL的旋转蒸发瓶中，按下表3中所述条件进行旋蒸。

表3不同条件下的旋蒸情况

结果分析：由条件1、条件2和条件3可知，在相同的旋蒸温度、转速、旋蒸时间条件下，压力越高，溜出液溜出速度越慢，在50mbar溜出液溜出速度较快，可以达到良好的旋蒸效果；由条件3、条件4和条件5可知，其他条件不变的情况下，温度越高，溜出速度越快，温度过低时，无冷凝液溜出，但温度过高会导致部分目标农药的分解。综合考虑旋蒸效果与旋蒸时间及旋蒸温度，选择旋蒸条件为：转数为80-130rpm，压力为20-80mbar，水浴温度为40-45℃；更优选，转速：100rpm；压力：50mbar，温度：40℃，时间：5min。

Claims (4)

1.一种测定白酒中农药残留的方法，包含以下步骤：

S1.除醇及提取：取白酒样品旋转蒸发去除乙醇，剩余液体加入乙腈和氯化钠混匀，静置使水相层和乙腈层分层；

S2.净化：取上清液加入分散固相萃取材料震荡后离心，取上清经过滤膜过滤；

S3.GC-MS/MS测定：取步骤S2中过滤后的液体上GC-MS/MS仪进行测定；

其中，步骤S1中，白酒样品、乙腈、氯化钠三者的比例为：5～20mL白酒样品：5～20mL乙腈：3～6g氯化钠；

其中，步骤S2中，每毫升上清液加入150-200mg分散固相萃取材料；所述的分散固相萃取材料为无水硫酸镁和乙二胺-N-丙基硅烷PSA：进一步地，无水硫酸镁与乙二胺-N-丙基硅烷PSA的重量份数比为5-25：1-5；

其中，步骤S1中，旋转蒸发的转数为80-130rpm，压力20-80mbar，水浴温度为40-45℃；

其中，步骤S3中，采用的毛细管柱为：TR-Pesticide II；气相色谱配置有程序升温进样口，色谱柱的升温程序为88-92℃保持4-6min，然后以20-30℃/min升至175-185℃，保持14-16min，再以4-6℃/min升至270-290℃，保持3-5min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的无水硫酸镁和乙二胺-N-丙基硅烷PSA的重量份数比为6：1。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤S1中，旋转蒸发的转数为100rpm，压力50mbar，水浴温度为40℃。

4.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，步骤S3中，

色谱的条件为：

进样体积：1μL；

进样模式：PTV不分流进样；

Surge压力：150kPa；

进样口初始温度：90℃，进样后以10℃/s快速升至280℃；

载气：He,纯度≥99.999％；

载气流速：1.2mL/min；

色谱柱升温程序：90℃保持5min，然后以25℃/min升至180℃，保持15min，再以5℃/min升至280℃，保持4.5min；

色谱-质谱接口温度：290℃；

质谱条件为：

离子源温度：250℃；

发射电流：50μA；

离子源：封闭式EI源；

碰撞气压力：1.2mTorr Ar；

溶剂延迟时间：7.0min；

扫描模式：MRM。