CN106232125A - 用于调节pkk表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开用于减少PKK mRNA和蛋白质表达的反义化合物和方法。此类方法、化合物以及组合物适用于治疗、预防或减轻PKK相关疾病、病症以及病状。

Description

用于调节PKK表达的组合物和方法
序列表
本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表是提供为2015年4月27日建立的大小为约636KB的题为BIOL0252WOSEQ_ST25.txt的文档。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。
领域
本文提供用于减少动物中的人血浆前激肽释放酶(PKK)mRNA和蛋白质的表达的化合物、组合物和方法。此类组合物和方法可用于治疗、预防或改善炎性和血栓栓塞病状。
背景技术
血浆前激肽释放酶(PKK)为由KLKB1基因编码的血浆激肽释放酶(PK)的前体。PKK为参与血液凝聚、纤维蛋白溶解、激肽形成以及炎症的表面依赖性激活的糖蛋白。PKK通过因子XIIa通过内部的Arg-Ile肽键的裂解转化成PK。PK从激肽原释放出激肽并且还自纤溶酶原形成纤溶酶。PK为由在炎症、血压控制、凝聚以及疼痛中起作用的若干蛋白质组成的激肽-激肽释放酶途径的成员。
发明内容
本文提供用于调节PKK mRNA和蛋白质表达的化合物和方法。在某些实施方案中，适用于调节PKK mRNA和蛋白质的表达的化合物为反义化合物。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸。
在某些实施方案中，可在细胞或组织中进行调节。在某些实施方案中，细胞或组织处于动物体内。在某些实施方案中，动物为人。在某些实施方案中，PKK mRNA水平降低。在某些实施方案中，PKK蛋白水平降低。所述降低可以时间依赖性方式或以剂量依赖性方式出现。
还提供适用于预防、治疗和改善与PKK相关的疾病、病症和病状的化合物、组合物和方法。在某些实施方案中，所述PKK相关疾病、病症和病状为炎性疾病。在某些实施方案中，所述炎性疾病可以为急性或慢性炎性疾病。在某些实施方案中，所述炎性疾病可以包括遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑的血管性水肿、眼水肿、黄斑水肿以及脑水肿。在某些实施方案中，所述PKK相关疾病、病症和病状为血栓栓塞疾病。在某些实施方案中，所述血栓栓塞疾病可以包括血栓、栓、血栓栓塞、深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞、中风以及梗塞。
所述疾病、病症和病状可共同具有一个或多个风险因素、成因或结果。
发展炎性疾病的某些风险因素和成因包括对炎性疾病的遗传素质和环境因素。在某些实施方案中，受试者具有突变的补体1酯酶抑制剂(C1-INH)基因或突变的因子12基因。在某些实施方案中，受试者携带或具有紧张素-转换酶抑制剂(ACE抑制剂)或紧张素II受体阻滞剂(ARB)。在某些实施方案中，受试者已具有过敏反应，导致血管性水肿。在某些实施方案中，受试者具有I型HAE。在某些实施方案中，受试者具有II型HAE。在某些实施方案中，受试者具有III型HAE。
某些与炎性疾病的发展相关的结果包括各种身体部分的水肿/肿胀，所述各种身体部分包括肢端(即手、脚、手臂、腿)、肠(腹腔)、面、生殖器、喉(即喉头)；血管渗透性；血管泄漏；全身炎症；腹痛；气胀；呕吐；腹泻；瘙痒的皮肤；呼吸(哮喘性)反应；鼻炎；过敏反应；支气管收缩；低血压；昏迷以及死亡。
发展血栓栓塞疾病的某些风险因素和成因包括对血栓栓塞的遗传素质、外科手术(具体地讲矫形手术)、恶性肿瘤、妊娠、年纪大、口服避孕药的使用、心房颤动、先前的血栓栓塞病状、慢性炎性疾病以及遗传性或获得性预防血栓剂凝血病症。某些与血栓栓塞病状的发展相关的结果包括通过受影响的血管的血液流降低、组织死亡和死亡。
在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用PKK反义化合物。在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用PKK反义寡核苷酸。
附图列表
图1为来自如实施例124中所述的血液样本的HMWK的蛋白质印记量化。
图2为来自如实施例127中所述的血液样本的HMWK的蛋白质印记量化。
详述
要理解，以上概述和以下详述都仅是示例性和解释性的，并且不限制要求保护的本发明。在本文中，除非另外确切说明，否则单数的使用包括复数。如本文所使用，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“包括(includes)”和“包括(included)”的使用不是限制性的。另外，除非另外确切说明，否则术语诸如“元件”或“组分”既涵盖包含一个单元的元件和组分，又涵盖包含多于一个子单元的元件和组分。
除非提供确切的定义，否则结合本文所描述的分析化学、合成有机化学和医药化学所使用的命名法和这些化学领域的工序和技术为本领域熟知和常用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。某些此类技术和工序可见于“Carbohydrate Modifications inAntisense Research”，Sangvi和Cook编，美国化学学会，Washington D.C.,1994；“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，第21版，2005；和“Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications”，Stanley T.Crooke编，CRC Press,Boca Raton,Florida；和Sambrook等,“MolecularCloning,A laboratory Manual,”第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989，所述文献出于任何目的而以引用方式并入本文。如果允许，本公开通篇提及的所有专利、申请、已公布的申请和其他出版物以及其他数据以引用的方式整体并入本文。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍及论文)关于本文所论述的文献部分明确地以引用方式特此并入以及以引用方式特此整体并入。
定义
除非提供具体定义，否则关于本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学所用的命名及本文所述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的工序及技术为本领域中熟知且常用的。标准技术可用于化学合成和化学分析。在允许的情况下，贯穿本公开中所提及的所有专利、申请、公布的申请及其他公布、可经由数据库(如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))获得的GENBANK登录号及相关序列信息及其他数据关于本文所论述的文献部分以引用方式并入本文以及以引用方式整体并入本文。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
“2'-O-甲氧基乙基”(又为2'-MOE和2’-OCH2CH2-OCH3以及MOE)是指呋喃糖环的2'位上的O-甲氧基乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是修饰的糖。
“2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷”(又为“2’-MOE核苷”)意谓包含2'-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2'-取代的核苷”意谓在呋喃糖环的2'位上包含除H或OH以外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2'-取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
“2’-脱氧核苷”意谓在核苷的糖部分的2’位上包含氢的核苷。
“3’靶位点”是指与特定反义化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5’靶位点”是指与特定反义化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意谓用连接至5位的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在值的±7％以内。例如，如果指出“化合物影响PKK至少约70％的抑制”，那么表示63％至77％范围内的PKK水平被抑制。
“伴随施用”是指在相同时间以任何方式对两种药剂同时施用，其中两种药剂的药理作用均在患者中显现。伴随施用不需要在单一药物组合物中、以相同剂型或通过相同施用途经对两种药剂进行施用。两种药剂的作用不需要在相同时间显现。所述作用仅需要重叠一段时间但不需要同延。
“施用”意谓向动物提供药剂，且包括但不限于由医学专业人员施用和自行施用。
如本文所使用的“烷基”意指含有最多至二十四个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基通常包括1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子(C1-C12烷基)，其中1至约6个碳原子更优选。
如本文所使用，“烯基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳双键的直链或支链链烃基。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙烯基、丁烯基、1-甲基-2-丁烯-1-基、二烯如1,3-丁二烯等。烯基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的烯基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“炔基”意指含有最多至二十四个碳原子并且具有至少一个碳-碳三键的直链或支链烃基。炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基等。炔基通常包括2至约24个碳原子，更通常地2至约12个碳原子，其中2至约6个碳原子更优选。如本文所使用的炔基可任选地包括一个或多个另外的取代基。
如本文所使用，“酰基”意指通过从有机酸中去除羟基形成的基团并且具有通式-C(O)-X，其中X通常为脂肪族、脂环族或芳香族。实例包括脂肪族羰基、芳香族羰基、脂肪族磺酰基、芳香族亚硫酰基、脂肪族亚硫酰基、芳香族磷酸酯、脂肪族磷酸酯等。如本文所使用的酰基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂环族”意指其中环为脂肪族的环***。环***可包含一个或多个环，其中至少一个环为脂肪族。优选的脂环族包括其中具有约5至约9个碳原子的环。如本文所使用的脂环族可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“脂肪族”意指含有最多至二十四个碳原子的直链或支链烃基，其中任何两个碳原子之间的饱和度为单键、双键或三键。脂肪族基团优选含有1至约24个碳原子，更通常地1至约12个碳原子，其中1至约6个碳原子更优选。脂肪族基团的直链或支链可被一个或多个杂原子中断，所述杂原子包括氮、氧、硫和磷。被杂原子中断的所述脂肪族基团包括但不限于聚烷氧基，如聚亚烷基二醇、聚胺和聚亚胺。如本文所使用的脂肪族基团可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“烷氧基”意指在烷基与氧原子之间形成的基团，其中氧原子用来将烷氧基连接至母体分子。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基等。如本文所使用的烷氧基可任选地包括另外的取代基。
如本文所使用，“氨基烷基”意指氨基取代的C1-C12烷基。基团的烷基部分与母体分子形成共价键。氨基可位于任何位置并且氨基烷基可在烷基和/或氨基部分上被另外的取代基取代。
如本文所使用，“芳烷基”和“芳基烷基”意指共价连接至C1-C12烷基的芳香族基团。所得到的芳烷基(或芳基烷基)的烷基部分与母体分子形成共价键。实例包括但不限于苯甲基、苯乙基等。如本文所使用的芳烷基可任选地包括连接至烷基、芳基或形成基团的这两个基团的另外的取代基。
如本文所使用，“芳基”和“芳香族”意指具有一个或多个芳环的单环或多环碳环***基团。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、四氢萘基、茚满基、茚基等。优选的芳环***在一个或多个环中具有约5至约20个碳原子。如本文所使用的芳基可任选地包括另外的取代基。
“改善”是指减轻、减缓、终止或逆转病状或疾病严重性的至少一个指标。指标的严重性可通过本领域的技术人员已知的主观或客观度量来确定。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、狗、猫、猪，以及非人灵长类，包括但不限于猴子和猩猩。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或由这种靶核酸所编码的蛋白质的量或表达的减少。“反义化合物”意指能够与靶核酸经由氢键进行杂交的低聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA及占位型化合物。
“反义化合物”意指能够经历通过氢键合与靶核酸进行杂交的低聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA及占位型化合物。
“反义抑制”意指在与靶核酸互补的反义化合物存在下靶核酸水平相较于或在不存在反义化合物下的靶核酸水平有所减少。“反义机制”为所有涉及化合物与靶核酸的杂交的机制，其中杂交的结果或效果为靶降解或靶占位，伴随阻碍涉及例如转录或剪接的细胞机构。
“反义机制”为所有涉及化合物与靶核酸的杂交的机制，其中杂交的结果或效果为靶降解或靶占位，伴随阻碍涉及例如转录或剪接的细胞机构。
“反义寡核苷酸”意指具有允许与靶核酸的对应区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核酸碱基与靶核酸中的相应核酸碱基进行准确碱基配对(即杂交)的能力，且由相应核酸碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏氢键结合介导。
“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核酸碱基与靶核酸中的相应核酸碱基进行准确碱基配对(即杂交)的能力，且由相应核酸碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、霍氏(Hoogsteen)或反霍氏氢键结合介导。
“双环糖”意指由两个原子桥连修饰的呋喃糖环。双环糖是修饰的糖。
“双环核酸”(也称为BNA)意指具有如下的核苷，所述核苷具有包含连接糖环的两个碳原子，从而形成双环***的桥的糖部分。在某些实施方案中，所述桥连接糖环的4’碳与2’碳。
“帽结构”或“端帽部分”意指已在反义化合物的任一末端并入的化学修饰。
“碳水化合物”意指天然存在的碳水化合物、修饰的碳水化合物或碳水化合物衍生物。
“碳水化合物聚簇”意指具有连接至支架或接头基团的一个或多个碳水化合物残基的化合物。(参见针对碳水化合物聚簇的实例，例如Maier等,“Synthesis of AntisenseOligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster forCellular Targeting，”Bioconjug ate Chemistry,2003,(14):18-29)，所述文献以引用方式全部并入本文，或Rensen等“Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the He paticAsiaglycoprotein Receptor，”J.Med.Chem.2004,(47):5798-5808)。
“碳水化合物衍生物”意指可使用碳水化合物作为起始材料或中间体合成的任何化合物。
“cEt”或“限制性乙基”意指具有包含连接4'-碳与2'-碳的桥的糖部分的双环核苷，其中所述桥具有下式：4’-CH(CH3)-O-2’。
“cEt修饰的核苷”(又称为“限制性乙基核苷”)意指包含含有4’-CH(CH3)-O-2’桥的双环糖部分的核苷。
“化学上不同的区域”是指以某种方式化学上不同于同一反义化合物的另一区域的反义化合物的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷的区化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷的区。
“化学修饰”意指当与天然存在的对应物相比时化合物的化学差异。寡核苷酸的化学修饰包括核苷修饰(包括糖部分修饰和核碱基修饰)和核苷间键联修饰。就寡核苷酸而言，化学修饰不包括仅在核碱基序列上的差异。
“嵌合反义化合物”意指具有至少两个化学相异区的反义化合物，每一位置具有多个亚单位。
“可裂解键”意指能够被***的任何化学键。在某些实施方案中，可裂解键选自以下：酰胺、聚酰胺、酯、醚、磷酸二酯的一个或两个酯、磷酸酯、氨基甲酸酯、二硫化物或肽。
“可裂解部分”意指能够在生理条件下***的键或基团。在某些实施方案中，可裂解部分在细胞或亚细胞区室(诸如溶酶体)内部裂解。在某些实施方案中，可裂解部分通过内源性酶如核酸酶裂解。在某些实施方案中，可裂解部分包含具有一个、两个、三个、四个或多于四个可裂解键的原子基团。
“共同施用”意指向个体施用两种或更多种药剂。两种或更多种药剂可在单个药物组合物中，或可在单独的药物组合物中。所述两种或更多种药剂可各自经由相同或不同的施用途径来施用。共同施用包括平行或相继施用。
“互补性”意指第一核酸与第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“包含(comprise)”、“包含(comprises)”以及“包含(comprising)”应理解为意指包括所述步骤或要素或步骤或要素的群组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的群组。
“缀合物”或“缀合物基团”意指结合至寡核苷酸或低聚化合物的原子或原子基团。通常，缀合物基团改变它们所连接至的化合物的一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
在缀合物基团背景下的“缀合物接头”或“接头”意指包含任何原子或原子基团的缀合物基团的一部分并且其(1)将寡核苷酸共价连接至缀合物基团的另一个部分或(2)共价连接缀合物基团的两个或更多个部分。
缀合物基团在本文中示为基团，提供用于形成至低聚化合物如反义寡核苷酸的共价连接的键。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的3’末端核苷的3'-羟基的3'-氧原子。在某些实施方案中，低聚化合物上的连接点为低聚化合物的5’末端核苷的5'-羟基的5'-氧原子。在某些实施方案中，用于形成至低聚化合物的连接的键为可裂解键。在某些所述实施方案中，所述可裂解键构成可裂解部分的全部或部分。
在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分(例如，可裂解键或可裂解核苷)和碳水化合物聚簇部分，如GalNAc聚簇部分。此碳水化合物聚簇部分包含：靶向部分和任选地缀合物接头。在某些实施方案中，通过配体的数目和身份来鉴定碳水化合物聚簇部分。例如，在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含3个GalNAc基团并且命名为“GalNAc3”。在某些实施方案中，碳水化合物聚簇部分包含4个GalNAc基团并且命名为“GalNAc4”。本文描述了具体的碳水化合物聚簇部分(具有具体系链、支链基团和缀合物接头基团)并且由后面跟着下标“a”的罗马数字命名。因此“GalNac3-1a”是指具有3个GalNac基团和明确鉴定的系链、支链基团和连接基团的缀合物基团的具体碳水化合物聚簇部分。所述碳水化合物聚簇片段通过可裂解部分(如可裂解键或可裂解核苷)连接至低聚化合物。
“缀合物化合物”意指适合用作缀合物基团的任何原子、原子基团或连接的原子基团。在某些实施方案中，缀合物化合物可具有或赋予一种或多种性质，包括但不限于药效学、药物代谢动力学、结合、吸收、细胞分布、细胞摄取、电荷和/或清除性质。
“连续核碱基”意指彼此紧邻的核碱基。
“设计”或“被设计来”是指形成与所选核酸分子特异性杂交的低聚化合物的方法。
“稀释剂”是指组合物中缺乏药理活性但在药学上是必需的或期望的成分。举例来说，在注射的药物中，稀释剂可为液体，例如生理盐水溶液。
“剂量”意指在单个施用中或在指定时间内提供的指定量的药剂。在某些实施方案中，剂量可以在一个、两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂中施用。例如，在某些实施方案中，当需要皮下施用时，所需剂量需要不易由单次注射调节的体积，因此，两个或更多个注射可用于实现所需剂量。在某些实施方案中，药剂通过在延长的时段内或连续地输注来施用。剂量可被规定为每小时、每天、每周或每个月的药剂的量。
“下游”是指朝3’端的相对方向或核酸的C末端。
“有效量”在调节活性或治疗或预防病状的情况下意指向需要所述调节、治疗或防治的受试者以单次剂量或一系列剂量的一部分形式施用有效调节所述效应，或治疗或防治或改善所述病状的药剂的量。有效量可在个体间变化，取决于待治疗个体的健康和身体条件、待治疗个体的分类群、组合物的制剂、个体的医疗条件的评价以及其他相关因素。
“功效”意指产生所需效果的能力。
“表达”包括基因密码信息借以转化成细胞中存在且起作用的结构的所有功能。所述结构包括但不限于转录及转译的产物。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的各核酸碱基在第二核酸中皆具有互补核酸碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物且靶核酸是第二核酸。
“缺口聚物(Gapmer)”意指其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中包含内部区域的核苷化学上不同于包含外部区域的核苷。内部区域可称为“缺口”且外部区域可称为“翼”。
“卤基”和“卤素”意指选自氟、氯、溴以及碘的原子。
“杂芳基”和“杂芳香族”意指包含单环或多环芳环、环***或稠环***的基团，其中至少一个环为芳香族的并且包括一个或多个杂原子。杂芳基还意图包括稠环***，所述稠环***包括其中一个或多个稠环不含有杂原子的***。杂芳基通常包括一个选自硫、氮或氧的环原子。杂芳基的实例包括但不限于吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、噻吩基、呋喃基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、喹喔啉基等。杂芳基可直接或通过连接部分如脂肪族基团或杂原子连接至母体分子。如本文所使用的杂芳基可任选地包括另外的取代基。
“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和靶核酸。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸与核酸靶。
“鉴定具有炎性疾病的动物”意指鉴定已被诊断为炎性疾病或易发展炎性疾病的动物。易发展炎性疾病的个体包括具有发展炎性疾病的包括环境因素、对一种或多种炎性疾病具有个人或家族史或遗传素质的一种或多种风险因素的那些。此鉴定可通过包括评估个体的医疗史和标准临床测试或评估的任何方法(诸如遗传测试)来实现。
“鉴定具有PKK相关疾病的动物”意指鉴定已被诊断为PKK相关疾病或易发展PKK相关疾病的动物。易发展PKK相关疾病的个体包括具有发展PKK相关疾病的包括具有一种或多种PKK相关疾病的个人或家族史或遗传素质的一种或多种风险因素的那些。此鉴定可通过包括评估个体的医疗史和标准临床测试或评估的任何方法(诸如遗传测试)来实现。
“鉴定具有血栓栓塞疾病的动物”意指鉴定已被诊断为血栓栓塞疾病或易发展血栓栓塞疾病的动物。易发展血栓栓塞疾病的个体包括具有发展血栓栓塞疾病的包括具有一种或多种血栓栓塞疾病的个人或家族史或遗传素质、不活动性、外科手术(具体地讲矫形手术)、恶性肿瘤、妊娠、年纪大、口服避孕药的使用、心房颤动、先前的血栓栓塞病状、慢性炎性疾病以及遗传性或获得性预防血栓剂凝血病症的一种或多种风险因素的那些。此鉴定可通过包括评估个体的医疗史和标准临床测试或评估的任何方法(诸如遗传测试)来实现。
“紧邻”意指在紧邻的要素之间没有***要素。“个体”意指选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“个体”意指选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制PKK”意指降低PKK mRNA和/或蛋白质的水平或表达。在某些实施方案中，相较于在不存在PKK反义化合物(诸如反义寡核苷酸)下PKK mRNA和/或蛋白质的表达水平，PKK mRNA和/或蛋白质水平在靶向PKK的反义化合物(包括靶向PKK的反义寡核苷酸)存在下得到抑制。
“抑制表达或活性”是指降低或阻断表达或活性且不一定指示完全消除表达或活性。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。
“核苷间中性连接基团”意指直接连接两个核苷的中性连接基团。
“核苷间磷连接基团”意指直接连接两个核苷的磷连接基团。
“键联基序”意指寡核苷酸或其区中的键联修饰的模式。这样的寡核苷酸的核苷可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述键联的基序意图为键联基序。因此，在所述情况下，核苷不受限制。
“连接的核苷”意指由核苷间键联连接在一起的相邻核苷。
“锁核酸”或“LNA”或“LNA核苷”意指在核苷糖单位的4'位与2'位之间具有连接两个碳原子，从而形成双环糖的桥的核酸单体。此类双环糖的实例包括但不限于A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA；(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA；(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)LNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)LNA；及(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)LNA，如下文所示。
如本文所使用，LNA化合物包括但不限于在糖的4'位与2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中所述桥中的每一个独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(R1)(R2)]n-、-C(R1)＝C(R2)-、-C(R1)＝N-、-C(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(R1)2-、-S(＝O)x-以及-N(R1)-；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；R1和R2各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或磺酸氧基(S(＝O)-J1)；并且J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
LNA的定义内所涵盖的4'-2'桥连基团的实例包括但不限于下式中的一种：-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或–C(R1R2)-O-N(R1)-。此外，LNA定义中所涵盖的其他桥连基团为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R1)-2'以及4'-CH2-N(R1)-O-2'-桥，其中R1和R2各自独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
根据本发明的LNA的定义内还包括如下LNA，其中核糖基糖环的2'-羟基连接至糖环的4'碳原子，从而形成亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)桥而形成双环糖部分。桥还可为连接2'氧原子与4'碳原子的亚甲基(-CH2-)，对于其使用术语亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA。此外，在于这个位置上具有亚乙基桥连基团的双环糖部分的情况下，使用术语亚乙氧基(4’-CH2CH2-O-2’)LNA。在本文所用的LNA的定义内还涵盖α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)，其为亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA的异构体。
“错配”或“非互补核碱基”是指当第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的对应核碱基配对的情况。
“修饰的核苷间键联”是指来自天然存在核苷间键(即，磷酸二酯核苷间键)的取代或任何变化。
“修饰的核碱基”意指任何除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶(也称为5-甲基尿嘧啶)或尿嘧啶以外的核碱基。“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分和/或修饰的核酸碱基的核苷。
“修饰的核苷酸”意指单独地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键联和/或修饰的核碱基的核苷酸。
“修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个修饰的核苷间键联、修饰的糖和/或修饰的核酸碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”意指与天然糖部分相比存在取代和/或任何变化。
“单环***或多环***”意指包括选自单一或多环基团环***的所有环***，其中环稠合或连接并且意图包括单独地选自以下的单环***和混合环***：脂肪族、脂环族、芳基、杂芳基、芳烷基、芳基烷基、杂环、杂芳基、杂芳香族以及杂芳基烷基。所述单环结构和多环结构可含有环，所述环各自具有相同水平的饱和或各自独立地具有不同程度的饱和，包括完全饱和、部分饱和或完全不饱和。每个环可包含选自C、N、O和S的环原子以产生杂环以及仅包含C环原子的环，所述环可存在于混合基序中，例如像苯并咪唑，其中一个环仅具有碳环原子并且稠环具有两个氮原子。单环***或多环***可进一步被取代基取代，例如像具有两个连接至环中的一个的＝O基团的邻苯二甲酰亚胺。单环***或多环***可使用各种策略连接至母体分子，如直接通过环原子、通过多个环原子稠合、通过取代基或通过双官能连接部分。
“单体”意指寡聚物的单个单元。单体包括但不限于天然存在或修饰的核苷和核苷酸。
“基序”意指反义化合物中未修饰的及修饰的核苷的模式。
“天然糖部分”意指见于DNA(2'-H)或RNA(2'-OH)中的糖部分。
“天然存在的核苷间键联”意指3'至5'磷酸二酯键联。
“中性连接基团”意指不带电荷的连接基团。中性连接基团包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(-CH2-N(CH3)-O-)、酰胺-3(-CH2-C(＝O)-N(H)-)、酰胺-4(-CH2-N(H)-C(＝O)-)、甲乙缩醛(-O-CH2-O-)以及硫代甲乙缩醛(-S-CH2-O-)。其他的中性连接基团包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)的非离子键联、羧酸盐酯、羧酰胺、硫醚、磺酸酯以及磺酰胺(参见例如：Carbohydrate Modifications in Antisense Research；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook编，ACS Symposium Series 580；第3和4章，(第40-65页))。其他的中性连接基团包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子键联。
“非互补核碱基”是指一对彼此不形成氢键或以其他方式支持杂交的核碱基。
“非核苷间中性连接基团”意指不直接连接两个核苷的中性连接基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间中性连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
“非核苷间磷连接基团”意指不直接连接两个核苷的磷连接基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团将核苷连接至除核苷之外的基团。在某些实施方案中，非核苷间磷连接基团连接两个基团，所述两个基团中没有一个为核苷。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)及微小RNA(miRNA)。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”是指能够与另一核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基是指反义化合物中能够与其靶核酸的核碱基进行碱基配对的核碱基。例如，如果反义化合物的某个位置上的核碱基能够与靶核酸的某个位置上的核碱基氢键合，那么寡核苷酸与靶核酸之间的氢键合的位置被认为在所述核碱基对上是互补的。
“核碱基修饰基序”意指沿着寡核苷酸的核碱基的修饰的模式。除非另外指出，否则核碱基修饰基序不依赖于核碱基序列。
“核酸碱基序列”意指连续核碱基的次序，而与任何糖、键联和/或核碱基修饰无关。
“核苷”意指连接至糖的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换糖或糖和碱基且不一定要置换键联的那些结构：例如像具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环或三环糖模拟物例如非呋喃糖单元的核苷模拟物。核苷酸模拟物包括用于在低聚化合物的一个或多个位置处置换核苷和键联的那些结构，例如像肽核酸或N-吗啉基(由-N(H)-C(＝O)-O-或其他非磷酸二酯键联连接的N-吗啉基)。糖替代物与稍微更广泛的术语核苷模拟物重叠，但仅旨在指示置换糖单位(呋喃糖环)。本文提供的四氢吡喃基环说明糖替代物的一个实例，其中呋喃糖糖基已被四氢吡喃基环***置换。“模拟物”是指替代糖、核碱基和/或核苷间键联的基团。一般而言，使用模拟物替代糖或糖-核苷间键组合，且维持核酸碱基以便与所选靶杂交。
“核苷基序”意指寡核苷酸或其区中的核苷修饰的模式。这样的寡核苷酸的键联可为修饰或未修饰的。除非另外指出，否则本文中仅描述核苷的基序意图为核苷基序。因此，在所述情况下，键联不受限制。
“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“脱靶效应”是指与调节除预定靶核酸以外的基因的RNA或蛋白质表达有关的不必要或有害的生物效应。
“低聚化合物”或“低聚物”意指具有连接的单体亚单位且能够与核酸分子的至少一个区杂交的聚合物。
“寡核苷酸”意指连接核苷的聚合物，每个核苷可被修饰或未修饰，彼此无关。
“以胃肠外方式施用”意指经由注射(例如快速注射)或输注施用。以胃肠外方式施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“肽”意指通过由酰胺键连接至少两个氨基酸而形成的分子。在无限制的情况下，本文所用的“肽”是指多肽和蛋白质。
“药剂”意指当施用给个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向PKK的反义寡核苷酸为药剂。
“药物组合物”意指适于向受试者施用的物质的混合物。例如，药物组合物可包含反义寡核苷酸和无菌水溶液。
“药学上可接受的衍生物”涵盖本文所述的化合物的药学上可接受的盐、缀合物、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理上和药学上可接受的盐，即，保留母体化合物的所需生物活性且不会赋予不希望的毒理学效应的盐。
“硫代磷酸酯键联”意指核苷之间的键联，其中磷酸二酯键通过用硫原子置换非桥联氧原子之一而被修饰。硫代磷酸酯键联为修饰的核苷间键联。
“磷连接基团”意指包含磷原子的连接基团。磷连接基团包括但不限于具有下式的基团：
其中：
Ra和Rd各自独立地为O、S、CH2、NH或NJ1，其中J1为C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
Rb为O或S；
Rc为OH、SH、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、氨基或取代的氨基；并且
J1为Rb为O或S。
磷连接基团包括但不限于磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、磷酸三酯、硫羰基烷基磷酸三酯以及硼烷磷酸酯。
“PKK”意指哺乳动物血浆前激肽释放酶，包括人血浆前激肽释放酶。血浆前激肽释放酶(PKK)为由KLKB1基因编码的血浆激肽释放酶(PK)的前体。
“PKK相关的疾病”意指任何与任何PKK核酸或其表达式相关的疾病。此类疾病可以包括炎性疾病或血栓栓塞疾病。此类疾病可以包括遗传性血管性水肿(HAE)。
“PKK mRNA”意指编码PKK的DNA序列的任何信使RNA表达产物。
“PKK核酸”意指编码PKK的任何核酸。例如，在某些实施方案中，PKK核酸包括编码PKK的DNA序列、从编码PKK的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列以及编码PKK的mRNA序列。“PKK mRNA”意指编码PKK蛋白质的mRNA。
“PKK蛋白质”意指PKK核酸的多肽表达产物。
“部分”意指核酸中确定数目的连续(即连接的)核酸碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指延迟或防止疾病、病症或病状的发作或发展从几分钟到几天、从几周到几个月或无限的一段时间。
“前药”意指以非活性形式制备且在身体或其细胞内通过内源酶或其他化学物质和/或条件的作用转化成活性形式(即药物)的治疗剂。
“防治有效量”是指向动物提供防治或预防益处的药剂的量。
“保护基”意指本领域技术人员已知的任何化合物或保护基。保护基的非限制性实例可见于"Protective Groups in Organic Chemistry",T.W.Greene、P.G.M.Wuts,ISBN0-471-62301-6,John Wiley&Sons,Inc,New York，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。
“区”被定义为靶核酸中具有至少一个可鉴别的结构、功能或特征的部分。
“核糖核苷酸”意指在核苷酸的糖部分的2'位上具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可被多种取代基中的任一种修饰。
“基于RISC的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于RNA诱导的沉默复合物(RISC)。
“基于RNA酶H的反义化合物”意指反义化合物，其中反义化合物的至少一些反义活性可归因于反义化合物与靶核酸的杂交和随后的RNA酶H对靶核酸的裂解。
“盐”意指反义化合物的生理学上及药学上可接受的盐，即保持母体寡核苷酸的所需生物活性且不赋予其不合需要的毒理效应的盐。
“区段”被定义为靶核酸内的区的较小部分或子部分。
“单独区”意指寡核苷酸的部分，其中任何相邻部分的化学修饰或化学修饰的基序包括至少一个差异以允许单独的区彼此区分。
“序列基序”意指沿着寡核苷酸或其部分布置的核碱基的模式。除非另外指出，否则序列基序不依赖于化学修饰并且因此可具有化学修饰的任何组合，包括没有化学修饰。
“副作用”意指除所需作用以外的可归因于治疗的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括不限于注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝中毒、肾中毒、中枢神经***异常及肌病。
“单链寡核苷酸”意指未与互补链杂交的寡核苷酸。
本文所用的“位点”被定义为靶核酸内的独特核酸碱基位置。
“可特异性杂交的”或“特异性杂交”是指在反义寡核苷酸与靶核酸之间具有足够程度的互补性以诱导所需效应，同时在体内测定和治疗学处理的情况下在需要特异性结合的条件下，即，在生理条件下对非靶核酸表现出极小的作用或无作用的反义化合物。
“严格杂交条件”或“严格条件”是指低聚化合物与其靶序列杂交，但与极少数目的其他序列杂交的条件。
“受试者”意指选用于治疗或疗法的人或非人动物。
“取代基(substituent)”和“取代基(substituent group)”意指置换指定母体化合物的原子或基团的原子或基团。例如，修饰核苷的取代基为不同于在天然存在的核苷中发现的原子或基团的任何原子或基团(例如，修饰的2’-取代基为在核苷的2’-位上的除H或OH之外的任何原子或基团)。取代基可为保护或未保护的。在某些实施方案中，本公开的化合物在母体化合物的一个位置上或多于一个位置上具有取代基。取代基还可进一步被其他取代基取代并且可直接连接或通过连接基团诸如烷基或烃基连接至母体化合物。
同样，如本文所使用，关于化学官能团的“取代基”意指不同于通常存在于指定官能团中的原子或原子基团的原子或原子基团。在某些实施方案中，取代基替代官能团的氢原子(例如，在某些实施方案中，取代的甲基的取代基为替代未取代的甲基的一个氢原子的除氢之外的原子或基团)。除非另外指出，否则适合用作取代基的基团包括但不限于卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C-(O)-Raa)、羧基(-C(O)O-Raa)、脂族基团、脂环基、烷氧基、取代的氧基(-O-Raa)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-N(Rbb)(Rcc))、亚氨基(＝NRbb)、酰胺基(-C(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)Raa)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、脲基(carbamido)(-OC(O)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(O)ORaa)、脲基(-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc))、硫脲基(-N(Rbb)C(S)N(Rbb)-(Rcc))、胍基(-N(Rbb)C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc))、脒基(-C(＝NRbb)N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)C(＝NRbb)(Raa))、巯基(-SRbb)、亚硫酰基(-S(O)Rbb)、磺酰基(-S(O)2Rbb)以及氨磺酰基(-S(O)2N(Rbb)(Rcc)或-N(Rbb)S-(O)2Rbb)。其中每个Raa、Rbb和Rcc独立地为H、任选连接的化学官能团或其他的具有优选列表的取代基，所述列表包括但不限于烷基、烯基、炔基、脂肪族、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族、杂环和杂芳基烷基。本文描述的化合物内的所选取代基以一定递归度存在。
“取代的糖部分”意指并非天然存在的糖部分的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在2’-位、3’-位、5’-位和/或4’-位上包含取代基的呋喃糖基。某些取代的糖部分为双环糖部分。
“糖部分”是指核苷的天然存在的糖部分或修饰的糖部分。
“糖基序”意指寡核苷酸或其区中的糖修饰的模式。
术语“糖替代物”意指如下结构：所述结构不包含呋喃糖基并且能够置换核苷的天然存在的糖部分，使得所得到的核苷亚基能够连接在一起和/或与其他核苷连接以形成能够与互补的低聚化合物杂交的低聚化合物。所述结构包括如下环：所述环包含与呋喃糖基(例如，4元环、6元环或7元环)不同的原子数；用非氧原子(例如，碳、硫或氮)替代呋喃糖基的氧；或原子数和氧替代均有所变化。所述结构还可包含对应于对于取代的糖部分所描述的那些取代的取代(例如，任选包含另外取代基的6元碳环双环糖替代物)。糖替代物还包括更复杂的糖代替物(例如，肽核酸的非环***)。糖替代物包括但不限于吗啉代、环己烯基和环己六醇。
“靶”是指需要调节的蛋白质。
“靶基因”是指编码靶的基因。
“靶向”或“靶向的”意指将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的设计和选择的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”及“核酸靶”都意指能够由反义化合物靶向的核酸。
“靶区”意指靶核酸中由一种或多种反义化合物所靶向的部分。
“靶区段”意指反义化合物所靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“端基”意指连接至寡核苷酸的3’末端或5’末端中的任一或两者的一个或多个原子。在某些实施方案中，端基为缀合物基团。在某些实施方案中，端基包含一个或多个端基核苷。
“末端核苷间键联”意指寡核苷酸或其限定区的最后两个核苷之间的键联。
“治疗有效量”意指向个体提供治疗益处的药剂的量。
“治疗(Treat)”或“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指施用组合物以实现疾病或病状的改善。
关于核苷或一种“类型”的核苷的“修饰类型”意指核苷的化学修饰并且包括修饰和未修饰的核苷。因此，除非另外指出，否则“具有第一类型的修饰的核苷”可为未修饰的核苷。
“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分及核苷间键构成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸为RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷)。
“上游”是指朝5’端的相对方向或核酸的N末端。
“翼区段”意指被修饰来赋予寡核苷酸以如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质的多个核苷。
某些实施方案
某些实施方案提供用于抑制血浆前激肽释放酶(PKK)mRNA和蛋白质表达的化合物、组合物和方法。某些实施方案提供用于降低PKK mRNA和蛋白质水平的化合物、组合物和方法。
某些实施方案提供靶向血浆前激肽释放酶(PKK)核酸的反义化合物。在某些实施方案中，PKK核酸为以下各项中所列的序列：GENBANK登录号NM_000892.3(以SEQ ID NO:1形式并入本文)、GENBANK登录号DC412984.1(以SEQ ID NO:2形式并入本文)、GENBANK登录号CN265612.1(以SEQ ID NO:3形式并入本文)、GENBANK登录号AK297672.1(以SEQ ID NO:4形式并入本文)、GENBANK登录号DC413312.1(以SEQ ID NO:5形式并入本文)、GENBANK登录号AV688858.2(以SEQ ID NO:6形式并入本文)、GENBANK登录号CD652077.1(以SEQ ID NO:7形式并入本文)、GENBANK登录号BC143911.1(以SEQ ID NO:8形式并入本文)、GENBANK登录号CB162532.1(以SEQ ID NO:9形式并入本文)、从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19(以SEQ ID NO:10形式并入本文)、GENBANK登录号NM_008455.2(以SEQ ID NO:11形式并入本文)、GENBANK登录号BB598673.1(以SEQ ID NO:12形式并入本文)、从核碱基6114001至6144000截短的GENBANK登录号NT_039460.7(以SEQ IDNO:13形式并入本文)、GENBANK登录号NM_012725.2(以SEQ ID NO:14形式并入本文)、从核碱基10952001至10982000截短的GENBANK登录号NW_047473.1(以SEQ ID NO:15形式并入本文)、GENBANK登录号XM_002804276.1(以SEQ ID NO:17形式并入本文)、以及从核碱基2358000至2391000截短的GENBANK登录号NW_001118167.1(以SEQ ID NO:18形式并入本文)。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:30-2226的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:570的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:705的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:1666的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO:570的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO:705的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO:1666的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：62、72、103、213、312、334-339、344、345、346、348、349、351、369、373、381、382、383、385、387-391、399、411、412、414、416、444、446-449、452、453、454、459、460、462-472、473、476、477、479、480、481、484、489-495、497、500、504、506、522、526、535、558、559、560、564、566、568-571、573、576、577、578、587、595、597-604、607、608、610、613、615、618、619、622、623、624、633、635、636、638、639、640、642、643、645、652、655-658、660、661、670、674-679、684、685、698、704、705、707、708、713、716、717、728、734、736、767、768、776、797、798、800、802、810、815、876、880、882、883、886、891、901-905、908-911、922、923、924、931、942、950-957、972、974、978、979、980、987-991、1005、1017-1021、1025、1026、1029、1030、1032、1034、1035、1037、1040、1041、1045、1046、1051、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1076、1087、1089、1111、1114、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1181、1182、1187、1196、1200、1214、1222、1267、1276、1277、1285、1286、1289、1290、1291、1303、1367、1389、1393、1398-1401、1406、1407、1408、1411、1419-1422、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1439、1440、1443、1444、1451、1452、1471、1516、1527、1535、1537、1538、1539、1540、1541、1563、1564、1567、1568、1616、1617、1623、1629、1664、1665、1666、1679、1687、1734、1804、1876、1886、1915、2008、2018、2100、2101、2115以及2116。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现PKK的至少80％mRNA抑制。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：62、72、103、213、334-339、344、346、348、349、351、381、382、383、385、389、390、391、446、448、452、453、454、466-473、476、481、484、491、492、494、495、497、504、526、558、559、566、568-571、576、578、587、595、597、598、600-604、607、610、613、618、619、624、635、638、639、645、652、656、657、658、660、674、675、676、684、698、704、705、707、713、716、768、876、880、901-905、908-911、922、923、924、931、942、951、954-957、972、974、978、979、987、988、990、1005、1019、1020、1021、1025、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1111、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1200、1222、1267、1285、1290、1291、1303、1367、1398、1399、1401、1406、1408、1411、1419、1420、1421、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1440、1443、1444、1451、1537-1540、1563、1616、1679、1687、1804、2008、2101、2115以及2116。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现PKK的至少85％mRNA抑制。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：334、346、351、382、390、391、446、448、452、453、468、469、470、471、472、476、481、491、495、504、558、566、568、570、571、578、587、597、598、600、604、613、635、638、645、656、658、660、674、675、684、704、705、880、901-905、909、922、931、951、954、956、990、1005、1020、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1075、1111、1125、1133、1153、1200、1267、1291、1303、1398、1399、1401、1406、1420、1426、1430、1431、1434、1435、1436、1440、1443、1451、1537-1540、2115以及2116。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现PKK的至少90％mRNA抑制。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：334、391、448、468、469、568、570、598、635、658、674、684、705、901、903、904、922、990、1267、1291、1420、1430、1431、1434、1435、1436、1537、1538以及1540。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现PKK的至少95％mRNA抑制。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：334、338、346、349、382、383、390、448、452、453、454、495、526、559、570、587、598、635、660、705、901、903、904、908、923、931、955、974、988、990、1020、1039、1040、1111、1117、1267、1291、1349、1352、1367、1389、1393、1399、1401、1408、1411、1426、1499、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1624、1643、1661、1665、1666、1673、1679、1695、1720、1804、1817、1876、1881、1886、1940、1947、2008、2018、2019、2031、2044、2100、2101、2115以及2116。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现0.4或更小的IC50(μM)。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：334、346、349、382、453、454、495、526、570、587、598、635、660、901、903、904、931、955、990、1020、1111、1267、1349、1352、1367、1389、1399、1408、1411、1426、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1643、1661、1665、1666、1673、1695、1804、1876、1881、2019、2044、2100、2101、2115以及2116。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现0.3或更小的IC50(μM)。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：334、346、382、453、495、526、570、587、598、635、901、904、931、955、1020、1111、1349、1352、1389、1426、1516、1535、1544、1548、1564、1569、1598、1616、1617、1665、1666、1804、1876、1881、2019、2044、2101以及2116。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现0.2或更小的IC50(μM)。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的核碱基序列：334、495、587、598、635、1349、1352、1389、1516、1544、1548、1569、1598、1617、1665、1666、1804、1881以及2019。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸实现小于0.2的IC50(μM)。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基27427-27520的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基33085-33247的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基27362-27524的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供包含修饰寡核苷酸和缀合物基团的化合物，其中修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与PKK核酸的外显子9、外显子12或外显子14的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核碱基序列与SEQ ID NO:10至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在某些实施方案中，化合物由单链修饰的寡核苷酸组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的至少一个核苷间键联为修饰的核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的至少一个修饰核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个磷酸二酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，所述修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。
在某些实施方案中，修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。
在某些实施方案中，修饰的糖为2’修饰的糖、BNA或THP。
在某些实施方案中，修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲基、限制性乙基、LNA或3’-氟代-HNA中的任一个。
在某些实施方案中，化合物包含至少一个2’-O-甲氧基乙基核苷、2’-O-甲基核苷、限制性乙基核苷、LNA核苷或3’-氟代-HNA核苷。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含：
由10个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由5个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。
在某些实施方案中，修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
某些实施方案提供由缀合物基团和根据下列式修饰寡核苷酸组成的化合物：TesGes mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCesAe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
某些实施方案提供由缀合物基团和根据下列式修饰寡核苷酸组成的化合物：mCesmCes mCes mCes mCes Tds Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds Ads Gds mCes mCes AesGes mCe；其中
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶；
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
某些实施方案提供由缀合物基团和根据下列式修饰寡核苷酸组成的化合物：mCesGes Aks Tds Ads Tds mCds Ads Tds Gds Ads Tds Tds mCks mCks mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶；
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
k＝cEt修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的5’端连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团在修饰寡核苷酸的3’端连接至修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，缀合物基团包含至少一个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、至少两个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)或至少三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。
某些实施方案提供根据下式的混合物：
某些实施方案提供根据下式的混合物：
某些实施方案提供根据下式的混合物：
在某些实施方案中，化合物可包含本文所述的任何修饰寡核苷酸和缀合物基团或者由本文所述的任何修饰寡核苷酸和缀合物基团组成。在某些实施方案中，化合物可包含修饰寡核苷酸和缀合物基团或者由修饰寡核苷酸和缀合物基团组成，所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:30-2226的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施方案中，具有以下化学结构的化合物包含具有5’-X的ISIS 721744或者由具有5’-X的ISIS 721744组成，其中X为包含如本文所述的GalNAc的缀合物基团：
在某些实施方案中，具有以下化学结构的化合物包含具有5’-X的ISIS 546254或者由具有5’-X的ISIS 546254组成，其中X为包含如本文所述的GalNAc的缀合物基团：
某些实施方案提供包含下式的化合物或者由下式的化合物组成：
某些实施方案提供包含下式的化合物或者由下式的化合物组成：
某些实施方案提供包含下式的化合物或者由下式的化合物组成：
其中R1为–OCH2CH2OCH3(MOE)并且R2为H；或者R1和R2一起形成桥，其中R1为–O-并且R2为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R1和R2直接连接使得所形成的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-以及–O-CH2CH2-；
并且对于相同环(每个环为独立地)上的R3和R4的每一对：R3选自H和-OCH2CH2OCH3并且R4为H；或者R3和R4一起形成桥，其中R3为–O-并且R4为–CH2-、-CH(CH3)-或-CH2CH2-，并且R3和R4直接连接使得所形成的桥选自：-O-CH2-、-O-CH(CH3)-以及–O-CH2CH2-；
并且R5选自H和–CH3；
并且Z选自S-和O-。
某些实施方案提供包含如任一前述权利要求所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种的组合物。
某些实施方案提供包括向动物施用如任一前述权利要求所述的化合物或组合物的方法。
在某些实施方案中，动物为人。
在某些实施方案中，施用所述化合物预防、治疗或改善PKK相关疾病、病症或病状。
在某些实施方案中，PKK相关疾病、病症或病状为遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑的血管性水肿、眼水肿、黄斑水肿、脑水肿、血栓、栓、血栓栓塞、深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞、中风或梗塞。
某些实施方案提供用于制造用于治疗炎性疾病或血栓栓塞疾病的药物的任一前述权利要求所述的化合物或组合物的用途。
反义化合物
低聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸及siRNA。低聚化合物可为靶核酸的“反义序列”，意味着其能够与靶核酸经由氢键键结进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。在某些这类实施方案中，反义寡核苷酸具有在按5'至3'方向书写时包含其所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为12至30个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为12至25个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为12至22个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为14至20个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为15至25个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为18至22个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为19至21个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物的长度为8至80个、12至50个、13至30个、13至50个、14至30个、14至50个、15至30个、15至50个、16至30个、16至50个、17至30个、17至50个、18至30个、18至50个、19至30个、19至50个或20至30个连接的亚单位。
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为12个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为13个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为14个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为15个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为16个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为17个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为18个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为19个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为20个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为21个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为22个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为23个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为24个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为25个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为26个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为27个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为28个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为29个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为30个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物的长度为31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个或80个连接的亚单位，或处于由上述任何两个值所界定的范围内。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸，并且连接的亚单位为核苷。
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义寡核苷酸可为缩短或截短的反义寡核苷酸。举例来说，单个亚单位可自5'端缺失(5'截短)，或者自3'端缺失(3'截短)。靶向PKK核酸的缩短或截短的反义化合物可有两个亚单位自反义化合物的5'端缺失，或者可有两个亚单位自反义化合物的3'端缺失。或者，缺失的核苷可散布于整个反义化合物中，例如在5'端有一个核苷缺失和3'端有一个核苷缺失的反义化合物中。
当单个额外亚单位存在于延长的反义化合物中时，所述额外亚单位可位于反义化合物的5'端或3'端处。当存在两个或更多个额外亚单位时，所添加的亚单位可彼此邻近，例如在反义化合物的5'端上添加有两个亚单位(5'添加)或3'端上添加有两个亚单位(3'添加)的反义化合物中。或者，所添加的亚单位可散布于整个反义化合物中，例如在5'端上添加有一个亚单位和3'端上添加有一个亚单位的反义化合物中。
有可能增加或减少反义化合物(如反义寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性。例如，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，测试长度为13-25个核碱基的一系列反义寡核苷酸在***注射模型中诱导靶RNA裂解的能力。长度为25个核碱基且在接近反义寡核苷酸的末端处具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够导引靶mRNA进行特异性裂解，但程度低于不含错配的反义寡核苷酸。同样，靶特异性裂解可使用具有13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配者)达成。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471,March 2001)表明与bcl-2mRNA具有100％互补性且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸在体外及体内减少bcl-2及bcl-xL两者的表达的能力。此外，这个寡核苷酸展现有效的体内抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)分别测试一系列具有14个核酸碱基的串联反义寡核苷酸以及包含所述串联反义寡核苷酸中的两个或三个的序列的具有28个及42个核酸碱基的反义寡核苷酸在家兔网状红血球测定中阻止人DHFR转译的能力。3个具有14个核碱基的反义寡核苷酸各自能够单独抑制转译，但程度相较于具有28个或42个核碱基的反义寡核苷酸而言更适中。
反义化合物基元
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物具有排列成一定模式或基序的化学上修饰的亚单位，以赋予反义化合物以如抑制活性增强、对靶核酸的结合亲和力增强或对由体内核酸酶引起的降解具抗性的性质。
嵌合反义化合物通常含有至少一个修饰的以赋予增强的核酸酶降解抗性、增加的细胞吸收、增强的对靶核酸的结合亲和力和/或增强的抑制活性的区。嵌合反义化合物的第二区可任选用作细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，所述酶裂解RNA:DNA双螺旋体的RNA链。
具有缺口聚物基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在缺口聚物中，具有多个支持核糖核酸酶H裂解的核苷酸的内部区位于具有多个在化学上与内部区的核苷不同的核苷酸的外部区之间。在具有缺口聚物基序的反义寡核苷酸的状况下，缺口区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，缺口聚物的每个区由构成每个相异区的糖部分的类型来区分。用于区分缺口聚物的每个区的糖部分的类型在一些实施方案中可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(所述2'-修饰的核苷可尤其包括2'-MOE及2’-O-CH3)，以及双环糖修饰的核苷(所述双环糖修饰的核苷可包括具有4’-(CH2)n-O-2’桥和4’-CH2-O-CH2-2’的那些核苷，其中n＝1或n＝2)。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的糖部分，包括例如2’-MOE。在某些实施方案中，翼可包括若干修饰的及未修饰的糖部分。在某些实施方案中，翼可包括2’-MOE核苷和2’-脱氧核苷的各种组合。
每个相异区可包含均一糖部分、变化或交替的糖部分。翼-缺口-翼基序常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5'翼的长度，“Y”表示缺口的长度，并且“Z”表示3'翼的长度。“X”及“Z”可包含均一、变化或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”及“Y”可包含一个或多个2'-脱氧核苷。“Y”可包含2'-脱氧核苷。本文所用的描述为“X-Y-Z”的缺口聚物具有一定构型以使缺口聚物紧邻5'翼及3'翼中的每一个而定位。因此，在5'翼与缺口之间，或缺口与3'翼之间不存在介入的核苷酸。本文所述的任何反义化合物均可具有缺口聚物基序。在某些实施方案中，“X”与“Z”相同；在其他实施方案中，它们不同。
在某些实施方案中，本文提供的缺口聚物包括例如具有基序5-10-5的二十聚体。
靶核酸、靶区及核苷酸序列
编码人血浆前激肽释放酶(PKK)的核苷酸序列包括但不限于以下：GENBANK登录号NM_000892.3(以SEQ ID NO:1形式并入本文)、GENBANK登录号DC412984.1(以SEQ ID NO:2形式并入本文)、GENBANK登录号CN265612.1(以SEQ ID NO:3形式并入本文)、GENBANK登录号AK297672.1(以SEQ ID NO:4形式并入本文)、GENBANK登录号DC413312.1(以SEQ ID NO:5形式并入本文)、GENBANK登录号AV688858.2(以SEQ ID NO:6形式并入本文)、GENBANK登录号CD652077.1(以SEQ ID NO:7形式并入本文)、GENBANK登录号BC143911.1(以SEQ ID NO:8形式并入本文)、GENBANK登录号CB162532.1(以SEQ ID NO:9形式并入本文)、从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19(以SEQ ID NO:10形式并入本文)、GENBANK登录号NM_008455.2(以SEQ ID NO:11形式并入本文)、GENBANK登录号BB598673.1(以SEQ ID NO:12形式并入本文)、从核碱基6114001至6144000截短的GENBANK登录号NT_039460.7(以SEQ ID NO:13形式并入本文)、GENBANK登录号NM_012725.2(以SEQID NO:14形式并入本文)、从核碱基10952001至10982000截短的GENBANK登录号NW_047473.1(以SEQ ID NO:15形式并入本文)、GENBANK登录号XM_002804276.1(以SEQ ID NO:17形式并入本文)、以及从核碱基2358000至2391000截短的GENBANK登录号NW_001118167.1(以SEQ ID NO:18形式并入本文)。
应了解，本文中所含的实例中的各SEQ ID NO中所列的序列与糖部分、核苷间键或核碱基的任何修饰无关。因而，由SEQ ID NO定义的反义化合物可独立地包含糖部分、核苷间键或核酸碱基的一个或多个修饰。由Isis编号(Isis No)所述的反义化合物指示核酸碱基序列与基元的组合。
在某些实施方案中，靶区为靶核酸的结构明确的区。例如，靶区域可包含3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接合部、编码区、翻译起始区、翻译终止区，或其他所定义的核酸区域。PKK的结构明确的区可由来自序列数据库(诸如NCBI)的登录号获得，且所述信息以引用的方式并入本文。在某些实施方案中，靶区可涵盖从所述靶区内的一个靶区段的5'靶位点至同一靶区内的另一靶区段的3'靶位点的序列。
靶向包括确定至少一个与反义化合物杂交，从而出现所需作用的靶区段。在某些实施方案中，所需作用为mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所需作用为由靶核酸编码的蛋白质水平的降低或与靶核酸有关的表型改变。
靶区可含有一个或多个靶区段。靶区内的多个靶区段可重叠。或者，它们可不相重叠。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔至多约300个核苷酸。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔靶核酸上一定数目的核苷酸，所述数目为、为约、为至多、为至多约250个、200个、150个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个或10个核苷酸，或为由前述任何两个值所界定的范围。在某些实施方案中，靶区内的靶区段相隔靶核酸上的至多或至多约5个核苷酸。在某些实施方案中，靶区段为连续的。涵盖由具有为本文所列的5'靶位点或3'靶位点中的任一个的起始核酸的范围所界定的靶区。
适合的靶区段可见于5'UTR、编码区、3'UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接合点内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也为适合的靶区段。适合的靶区段可尤其排除某一结构明确的区，诸如起始密码子或终止密码子。
确定适合的靶区段可包括将靶核酸的序列与整个基因组中的其他序列相比较。例如，可使用BLAST算法来鉴别不同核酸当中具相似性的区域。这个比较可防止选择可能以非特异性方式与除所选靶核酸以外的序列(即非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
反义化合物在活性靶区内的活性(例如如由靶核酸水平的降低百分比所定义)可能不同。在某些实施方案中，PKK mRNA水平的降低指示对PKK表达的抑制。PKK蛋白质水平的降低也指示对靶mRNA表达的抑制。此外，表型改变指示对PKK表达的抑制。例如，降低或预防炎症可以指示对PKK表达的抑制。在另一个实例中，降低或预防水肿/肿胀可以指示对PKK表达的抑制。在另一个实例中，降低或预防血管渗透性可以指示对PKK表达的抑制。在另一个实例中，降低或预防血管泄漏可以指示对PKK表达的抑制。在某些实施方案中，血管渗透性通过染料诸如Evans蓝的量化进行测量。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物与靶核酸之间进行杂交。杂交的最常见机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如沃森-克里克、霍氏或反霍氏氢键合)。
杂交可在不同条件下进行。严格条件具序列依赖性且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法在本领域中为熟知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与靶核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物中足够数目的核碱基可与靶核酸中的相应核碱基进行氢键合，从而出现所需作用(例如对靶核酸(诸如PKK核酸)的反义抑制)时，反义化合物与靶核酸彼此互补。
可容忍反义化合物与PKK核酸之间的非互补性核碱基，前提是所述反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。此外，反义化合物可在PKK核酸的一个或多个区段上杂交，以使得介入或相邻区段不参与杂交事件(例如环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与PKK核酸、靶区、靶区段或其指定部分具有或具有至少70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补性。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可使用常规方法测定。
例如，反义化合物中反义化合物的20个核碱基中有18个核碱基与靶区互补且因此特异性杂交将表示90％互补性。在这个实例中，其余非互补核酸碱基可与互补核酸碱基丛集或交替并且不需要彼此相邻或与互补核酸碱基相邻。因而，长度为18个核酸碱基并具有4个非互补核酸碱基且所述非互补核酸碱基由与靶核酸完全互补的两个区侧接的反义化合物与靶核酸将具有77.8％的总体互补性且因而处于本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜寻工具(basic local alignment search tool))和PowerBLAST程序来测定(Altschul等人，J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden，Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性的百分比可通过例如使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)的算法的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)使用默认设置来测定。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶核酸或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与血浆前激肽释放酶核酸或其靶区或靶区段或靶序列完全互补。本文所用的“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基皆能够与靶核酸的相应核碱基进行准确碱基配对。例如，具有20个核碱基的反义化合物与长度为400个核碱基的靶序列完全互补，只要靶核酸中有具有20个核碱基的相应部分与反义化合物完全互补即可。完全互补还可对于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。例如，具有30个核碱基的反义化合物中的20个核碱基的部分可与长度为400个核碱基的靶序列“完全互补”。具有30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基的部分在靶序列具有含20个核碱基且每个核碱基与反义化合物中的所述20个核碱基的部分互补的相应部分的情况下与靶序列完全互补。同时，整个具有30个核碱基的反义化合物与靶序列可能完全互补或可能不是完全互补，这取决于反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶序列互补。
非互补核碱基的位置可处于反义化合物的5’端或3’端处。或者，一个或多个非互补核酸碱基可处于反义化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可为连续(即连接的)或不连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于缺口聚物反义寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，长度为或为多达11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基的反义化合物相对于靶核酸或其指定部分包含至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
在某些实施方案中，长度为或为多达11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核碱基的反义化合物相对于靶核酸或其指定部分包含至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个非互补核碱基。
所提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的反义化合物。本文所用的“部分”是指靶核酸的区或区段内确定数目的连续(即连接的)核碱基。“部分”还可指反义化合物中确定数目的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少8个核酸碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中具有至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与靶区段中具有至少9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个(或由这些值中的任何两个所界定的范围)核碱基的部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可与特定核苷酸序列SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分比。如本文所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，那么其与本文公开的序列同一。例如，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸苷的RNA将被视作与DNA序列同一，因为尿嘧啶和胸苷皆与腺嘌呤配对。还涵盖本文所述的反义化合物的缩短及延长型式以及相对于本文提供的反义化合物具有非同一碱基的化合物。非同一碱基可彼此相邻或散布于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据相对于与其比较的序列具有同一碱基配对的碱基的数目来计算的。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO或其部分具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与靶核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核酸碱基的部分与靶核酸的等长部分相比较。
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与靶核酸的等长部分相比较。在某些实施方案中，将具有8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核酸碱基的部分与靶核酸的等长部分相比较。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常为杂环碱基部分。核苷酸为还包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可连接至糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是经由相邻核苷彼此共价键联形成线性聚合寡核苷酸而形成的。在寡核苷酸结构内，磷酸酯基通常被视作形成寡核苷酸的核苷间键联。
反义化合物的修饰涵盖核苷间键联、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物常因具有如以下的所需性质而优于原生形式：细胞吸收增强、对核酸靶的亲和力增强、在核酸酶存在下的稳定性增强或抑制活性增强。
化学上修饰的核苷还可用于增强缩短或截短型反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，常可以具有所述化学上修饰的核苷的较短反义化合物获得类似结果。
修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。相较于具有天然存在的核苷间键联的反义化合物，具有一个或多个修饰的(即非天然存在)的核苷间键联的反义化合物常会因具有所需性质(例如像细胞吸收增强、对靶核酸的亲和力增强及在核酸酶存在下的稳定性增强)而被优先选择。
具有修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联以及不具磷原子的核苷间键联。代表性含磷的核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷键联及不含磷键联的方法为熟知的。
在某些实施方案中，靶向血浆前激肽释放酶核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含以限定的模式或修饰的核苷间键联基序沿着寡核苷酸或其区域布置的修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，核苷间键联以有缺口的基序布置。在所述实施方案中，两个翼区的每一个中的核苷间键联不同于缺口区中的核苷间键联。在某些实施方案中，翼中的核苷间键联为磷酸二酯并且缺口中的核苷间键联为硫代磷酸酯。核苷基序被独立地选择，使得具有有缺口的核苷间键联基序的所述寡核苷酸可以具有或可不具有有缺口的核苷基序并且如果它具有有缺口的核苷基序，那么翼和缺口长度可以相同或可不同。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含具有交替的核苷间键联基序的区域。在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含具有统一修饰的核苷间键联的区域。在某些所述实施方案中，寡核苷酸包含通过硫代磷酸酯核苷间键联统一连接的区域。在某些实施方案中，寡核苷酸通过硫代磷酸酯统一连接。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施方案中，寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯和硫代磷酸酯并且至少一个核苷间键联为硫代磷酸酯。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少6个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少8个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少10个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少6个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少8个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少10个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些实施方案中，寡核苷酸包含至少一个具有至少12个连续的硫代磷酸酯核苷间键联的嵌段。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端。在某些所述实施方案中，至少一个所述嵌段位于寡核苷酸的3’末端的3个核苷内。
在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个甲基膦酸酯键。在某些实施方案中，具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸包含包括除一个或两个甲基膦酸酯键联之外所有的硫代磷酸酯键联的键联基序。在某些实施方案中，一个甲基膦酸酯键联位于具有缺口聚物核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施方案中，布置硫代磷酸酯核苷间键联和磷酸二酯核苷间键联的数量以保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，布置硫代磷酸酯核苷间键联的数量和位置与磷酸二酯核苷间键联的数量和位置以保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，可以减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量并且可以增加磷酸二酯核苷间键联的数量。在某些实施方案中，在可以减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量并且可以增加磷酸二酯核苷间键联的数量的同时还能保持核酸酶抗性。在某些实施方案中，在减小硫代磷酸酯核苷间键联的数量的同时保持核酸酶抗性是所需的。在某些实施方案中，在增加磷酸二酯核苷间键联的数量的同时保持核酸酶抗性是所需的。
修饰的糖部分
反义化合物可任选含有其中糖基已被修饰的一个或多个核苷。所述糖修饰的核苷可赋予反义化合物以增强的核酸酶稳定性、增强的结合亲和力或某种其他有利生物性质。在某些实施方案中，核苷包含化学上修饰的呋喃核糖环部分。化学上修饰的呋喃核糖环的实例包括不限于添加取代基(包括5'及2'取代基)；非偕位环原子桥连形成双环核酸(BNA)；核糖基环氧原子用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基团)置换；及其组合。化学上修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(关于其他所公开的5',2'-双取代的核苷，参见08年8月21日公开的PCT国际申请WO 2008/101157)或核糖基环氧原子被S置换且2'位上被进一步取代(参见2005年6月16日公开的公开美国专利申请US2005-0130923)；或者BNA的5'-取代(参见07年11月22日公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位置处的取代基还可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、巯基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)以及O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)其中Rl、Rm以及Rn各自独立地为H或取代的或未取代的C1-C10烷基。
本文所用的“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷的实例包括不限于在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个双环核苷，其中包含4'至2'桥。此类4'至2'桥连的双环核苷的实例包括但不限于下式的一个：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(也称为限制性乙基或cEt)以及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(以及其类似物，参见2008年7月15日颁发的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(以及其类似物，参见2009年1月8日公布的已公布的国际申请WO 2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(以及其类似物，参见2008年12月11日公布的已公布的国际申请WO/2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公布的已公布的美国专利申请US2004-0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团(参见参见2008年9月23日颁发的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Zhou等,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'(以及其类似物，参见2008年12月8日公布的已公布的国际申请WO 2008/154401)。
涉及双环核苷的其他的报告还可以见于已公布的文献(参见例如：Singh等,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等,Curr.Opinion Invest.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等,Chem.Biol.,2001,8,1-7；以及Orum等,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；7,034,133；7,053,207；7,399,845；7,547,684；以及7,696,345；美国专利公布号US2008-0039618；US2009-0012281；美国专利序列号61/026,995和61/097,787；已公布的PCT国际申请WO 1999/014226；WO 2004/106356；WO 2005/021570；WO 2007/134181；WO 2008/150729；WO 2008/154401；WO 2009/006478；WO 2010/036698；WO2011/017521；WO 2009/067647；WO 2009/100320。上述各双环核苷可被制备而具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日公开为WO 99/14226的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在呋喃戊糖基糖部分的4'位与2'位之间具有至少一个桥的化合物，其中所述桥独立地包含1个或2至4个独立地选自以下的连接基团：-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝O)-、-C(＝NRa)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
R1和R2各自独立地为H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚硫酸基(S(＝O)-J1)；并且
J1和J2各自独立地为H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，桥为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'以及4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步由异构构型定义。例如，包含4’-2’亚甲基-氧基桥联的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA先前已并入展示反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于(A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；和(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA；(G)亚甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA；以及(K)乙烯基BNA；如下文所描绘：
其中Bx为碱基部分且R独立地为H、保护基、C1-C12烷基或C1-C12烷氧基。
在某些实施方案中，双环核苷具有式I：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta及Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接。
在某些实施方案中，双环核苷具有式II：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Za为C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、巯基或取代的巯基。
在一个实施方案中，每个取代的基团独立地被独立地选自以下的取代基单取代或多取代：卤素、氧基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc及NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd以及Je独立地为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基且X为O或NJc。
在某些实施方案中，双环核苷具有式III：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，双环核苷具有式IV：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
Rd为C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
qa、qb、qc以及qd各自独立地为H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，双环核苷具有式V：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qa、qb、qe以及qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe连同qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶的合成和制备以及它们的寡聚和核酸识别性质已有所描述(Koshkin等人，Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。BNA及其制备还描述于WO 98/39352及WO 99/14226中。
亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA及2'-硫基-BNA的类似物也已被制备(Kumar等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。构成作为核酸聚合酶的底物的寡脱氧核糖核苷酸双螺旋体的锁核苷类似物的制备也已有所描述(Wengel等人,WO 99/14226)。此外，2'-氨基-BNA(一种新颖的构形受限的高亲和力寡核苷酸类似物)的合成在本领域中已有所描述(Singh等人，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，2'-氨基-BNA及2'-甲基氨基-BNA已被制备且它们与互补的RNA及DNA链的双螺旋体的热稳定性先前已有所报导。
在某些实施方案中，双环核苷具有式VI：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价连接；
qi、qj、qk以及ql各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
一种具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的碳环双环核苷已有所描述(Freier等人，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443和Albaek等人，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳环双环核苷的合成和制备以及它们的寡聚及生物化学研究也已有所描述(Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26),8362-8379)。
本文所用的“4’-2’双环核苷”或“4’至2’双环核苷”是指包含含连接2’碳原子与4’碳原子的桥的呋喃糖环的双环核苷。
本文所用的“单环核苷”是指包含不为双环糖部分的修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置上被修饰或取代。
本文所用的“2’-修饰的糖”意指在2’位上修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，所述修饰包括选自以下的取代基：包括但不限于卤基、取代及未取代的烷氧基、取代及未取代的硫烷基、取代及未取代的氨基烷基、取代及未取代的烷基、取代及未取代的烯丙基以及取代及未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3以及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其他2'取代基还可选自：C1-C12烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷氨基、聚烷氨基、取代的硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、改进药物动力学性质的基团、或改进反义化合物的药效学性质的基团，以及其他具有类似性质的取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2'-MOE侧链(Baker等人,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。所述2’-MOE取代已被描述为相较于未修饰的核苷及其他修饰的核苷(如2’-O-甲基、O-丙基及O-氨基丙基)具有改善的结合亲和力。具有2'-MOE取代基的寡核苷酸还被示为在体内使用中具有良好特征的基因表达的反义抑制剂(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637以及Altmann等,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
本文所用的“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指具有取代普通核苷中的呋喃戊糖基残基的6元四氢吡喃“糖”(糖替代物)的核苷。修饰的THP核苷包括但不限于在本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露醇核酸(MNA)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-1954)或具有如下所示的四氢呋喃环***的氟HNA(F-HNA)：
在某些实施方案中，选择具有式VII的糖替代物：
其中独立地对于所述至少一种式VII的四氢吡喃核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者Ta和Tb中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且Ta和Tb中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'或3'-端基；
q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2各自选自氢、羟基、卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2以及CN，其中X为O、S或NJ1并且J1、J2以及J3各自独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供了式VII的修饰THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7各自为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7中的至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6以及q7中的至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供了式VII的THP核苷,其中R1和R2中的一个是氟。在某些实施方案中，R1为氟并且R2为H；R1为甲氧基并且R2为H，并且R1为甲氧基乙氧基并且R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有多于5个原子和多于一个杂原子的环。例如包含吗啉代糖部分的核苷以及它们在低聚化合物中的用途已有所报告(参见例如：Braasch等,Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685；5,166,315；5,185,444以及5,034,506)。如在此所使用，术语“吗啉代”意指具有以下式的糖替代物：
在某些实施方案中，可例如通过添加或改变来自以上吗啉代结构的各种取代基来修饰吗啉代。所述糖替代物在本文中称为“修饰的吗啉代”。
还提供了修饰的组合，不限于如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其他公开的5',2'-双取代核苷，参见8/21/08公布的PCT国际申请WO 2008/101157)和用S替代核糖基环氧原子以及在2'-位上的进一步取代(参见2005年6月16日公布的已公布的美国专利申请US2005-0130923)或替代地双环核酸的5'-取代(参见11/22/07公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位上被5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。碳环双环核苷的合成和制备连同其低聚和生物化学研究也已有所描述(参见，例如，Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个修饰的环己烯基核苷，其为用六元环己烯基替代天然存在的核苷中的呋喃戊糖基残基的核苷。修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的那些(参见例如共同拥有的已公布的2010年4月10日公布的PCT申请WO 2010/036696，Robeyns等,J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等,Tetrahedron Letters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等,,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等,Nucleic Acids Research,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等,ActaCrystallographica,Section F:Structural Biology and CrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等,Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等,Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等,J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等,Nucleic Acids Research,2001,29(24),4941-4947；Wang等,J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等,Nucleosides,Nucleotides&Nucleic Acids,2001,20(4-7),785-788；Wang等,J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；已公布的PCT申请WO 06/047842以及已公布的PCT申请WO 01/049687；每项申请的内容以引用的方式整体并入本文)。某些
修饰的环己烯基核苷具有式X。
其中独立地对于所述至少一种式X的环己烯基核苷类似物中的每一个：
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团，或者T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接至反义化合物的核苷间连接基团且T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'或3'-端基；并且
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8以及q9各自独立地为H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C2-C6炔基或其他糖取代基。
本文所用的“2’-修饰的核苷”或“2’-取代的核苷”是指包含在2’位上包含除H或OH以外的取代基的糖的核苷。2’-修饰的核苷包括但不限于其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2’碳与另一个碳的双环核苷以及具有如以下的非桥连2’取代基的核苷：烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中Rm和Rn各自独立地为H或取代或未取代的C1-C10烷基。2’-修饰的核苷可进一步例如在糖的其他位置上和/或在核碱基上包含其他修饰。
本文所用的“2’-F”是指包括在糖环的2’位上包含氟基的糖的核苷。
本文所用的“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”各自是指包含在糖环的2’位上包含-OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指包含在糖环的2’位上包含-OCH2CH2OCH3基团的糖的核苷。
本文所用的“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，多个核苷中的一或多个是修饰的。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
许多其他双环和三环糖替代物环***在本领域中也是已知的，其可用于修饰用于并入反义化合物中的核苷(参见例如综述文章：Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-1954)。可对所述环***进行各种其他取代以增强活性。
用于制备修饰的糖的方法为本领域技术人员所熟知。教导此类修饰的糖的制备的一些代表性美国专利包括但不限于U.S.：4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,670,633、5,700,920、5,792,847以及6,600,032以及2005年6月2日提交的国际申请PCT/US-2005/019219和2005年12月22日公布的WO 2005/121371，并且每篇所述专利以引用的方式整体并入本文。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然、修饰的或其组合)被维持以便与适当核酸靶杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的糖部分为2’-MOE。在某些实施方案中，2’-MOE修饰的核苷酸排列于间隔体基元中。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷布置在整个缺口聚物基序的翼中。
缀合的反义化合物
在某些实施方案中，本公开提供缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含与核酸转录物互补的反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触的方法。在某些实施方案中，本公开提供包括使细胞与包含反义寡核苷酸的缀合反义化合物接触并且降低细胞中核酸转录物的量或活性的方法。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)先前已有描述。参见例如，Park等，PNAS第102卷，第47期，第17125-17129页(2005)。所述受体在肝脏细胞尤其是肝细胞上表达。此外，已显示，包含三个N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)配体的聚簇的化合物能够结合ASGP-R，从而导致化合物被摄取到细胞中。参见例如，Khorev等，Bioorganic and Medicinal Chemistry16,9，第5216-5231页(May 2008)。因此，包含所述GalNAc聚簇的缀合物已用来促进将某些化合物摄取到肝脏细胞(确切地是肝细胞)中。例如，已显示，某些含有GalNAc的缀合物在体内增加双链siRNA化合物在肝脏细胞中的活性。在所述情况下，含有GalNAc的缀合物通常连接至siRNA双链体的有义链。因为在反义链最终与靶核酸杂交之前丢弃有义链，所以存在很少关于缀合物将干扰活性的问题。通常，缀合物连接至siRNA的有义链的3’末端。参见例如，美国专利8,106,022。本文描述的某些缀合物基团比先前描述的缀合物基团更有活性和/或更易于合成。
在本发明的某些实施方案中，缀合物连接至单链反义化合物，包括但不限于基于RNA酶H的反义化合物和改变前体mRNA靶核酸的剪接的反义化合物。在所述实施方案中，缀合物应该保持连接至反义化合物足以提供益处(摄取到细胞中的改进)的时间，但是随后应裂解或以其他方式不干扰对于活性所必需的后续步骤，如与靶核酸杂交以及与RNA酶H或与和剪接或剪接调节相关的酶相互作用。这种性质平衡在单链反义化合物的环境中比在其中缀合物可简单连接至有义链的siRNA化合物中更为重要。本文公开了与缺乏缀合物的相同反义化合物相比在体内在肝脏细胞中具有改进效力的缀合的单链反义化合物。已知这些化合物所需的性质平衡如改进的效力是令人惊奇的。
在某些实施方案中，本文的缀合物基团包含可裂解部分。如所指出的，不希望受机制的束缚，合乎逻辑的是，缀合物应在化合物上保持足以提供摄取增强的时间，但其后，希望缀合物的一些部分或理想的是缀合物的全部均裂解，从而释放呈其最具活性形式的母体化合物(例如，反义化合物)。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷。所述实施方案通过经由一个或多个可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)通过核苷使缀合物的其余部分(聚簇)连接至反义寡核苷酸来利用细胞中的内源性核酸酶。在某些实施方案中，聚簇通过磷酸二酯键联与可裂解核苷结合。在某些实施方案中，可裂解核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸(反义化合物)。在某些实施方案中，缀合物基团可包含两个或三个可裂解核苷。在所述实施方案中，所述可裂解核苷通过可裂解键(如具有磷酸二酯键联的那些)彼此连接，连接至反义化合物和/或连接至聚簇。本文的某些缀合物不包含可裂解核苷而是包含可裂解键。显示了通过至少一个在细胞中易受裂解的键(可裂解键)来提供缀合物自寡核苷酸的充***解。
在某些实施方案中，缀合反义化合物为前药。向动物施用所述前药并且其最终代谢为更具活性的形式。例如，使缀合反义化合物裂解以去除缀合物的全部或部分，从而产生缺乏缀合物的全部或一些的反义化合物的活性(或更具活性)形式。
在某些实施方案中，缀合物连接在寡核苷酸的5’末端。某些所述5’-缀合物比具有连接在3’末端的类似缀合物基团的对应物更有效地裂解。在某些实施方案中，改进的活性可与改进的裂解相关。在某些实施方案中，在5’末端包含缀合物的寡核苷酸比在3’末端包含缀合物的寡核苷酸具有更大的效能(参见，例如，实施例56、81、83和84)。此外，5’-连接允许更简单的寡核苷酸合成。通常，在固体载体上在3’至5’方向上合成寡核苷酸。为了制得3’-缀合寡核苷酸，通常将预先缀合的3’核苷连接至固体载体，然后按常规构造寡核苷酸。然而，将所述缀合核苷连接至固体载体增加了合成的复杂性。此外，使用所述方法，缀合物则存在于寡核苷酸的整个合成中并且在后续步骤期间可能发生降解或可能限制可使用的反应和试剂的种类。使用本文针对5’-缀合寡核苷酸所述的结构和技术，可使用标准自动化技术合成寡核苷酸并且与最后(最5’)的核苷一起或在寡核苷酸从固体载体上裂解之后引入缀合物。
鉴于现有技术和本公开，普通技术人员可简单制得本文的任何缀合物和缀合寡核苷酸。此外，本文公开的某些所述缀合物和缀合寡核苷酸的合成更简单和/或需要更少步骤，并且因此比先前公开的缀合物的合成更低廉，从而在制造上提供优点。例如，某些缀合物基团的合成由较少合成步骤组成，从而导致相对先前所述的缀合物基团产率增加。缀合物基团如实施例46中的GalNAc3-10和实施例48中的GalNAc3-7比先前描述的缀合物简单得更多，所述先前描述的缀合物如需要装配更多化学中间体的U.S.8,106,022或U.S.7,262,177中所述的那些。因此，本文描述的这些和其他缀合物在与任何寡核苷酸一起使用方面优于先前描述的化合物，所述寡核苷酸包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
类似地，本文公开了仅具有一个或两个GalNAc配体的缀合物基团。如所示出的，所述缀合物基团改进了反义化合物的活性。所述化合物比包含三个GalNAc配体的缀合物更易于制备。包含一个或两个GalNAc配体的缀合物基团可连接至任何反义化合物，包括单链寡核苷酸和双链寡核苷酸(例如，siRNA)的任一链。
在某些实施方案中，本文的缀合物大致上不改变耐受性的某些量度。例如，本文显示缀合反义化合物不比未缀合的母体化合物更具有免疫原性。因为效力得到改进，所以其中耐受性保持相同(或甚至与效力增益相比耐受性实际上仅略微变差)的实施方案对于治疗具有改进的性质。
在某些实施方案中，缀合允许人们以在不存在缀合的情况下具有较不吸引人的结果的方式改变反义化合物。例如，在某些实施方案中，用磷酸二酯键联替代完全的硫代磷酸酯反义化合物的一个或多个硫代磷酸酯键联造成耐受性的一些量度的改进。例如，在某些情况下，具有一个或多个磷酸二酯的所述反义化合物比其中每个键联为硫代磷酸酯的相同化合物具有更小的免疫原性。然而，在某些情况下，如实施例26中所示，用磷酸二酯键联同样替代一个或多个硫代磷酸酯键联还造成细胞摄取减少和/或效力损失。在某些实施方案中，本文描述的缀合反义化合物耐受所述键联变化，其中当与缀合的完全硫代磷酸酯对应物相比时摄取和效力损失很少或没有损失。事实上，在某些实施方案中，例如在实施例44、57、59和86中，包含缀合物和至少一个磷酸二酯核苷间键联的寡核苷酸实际上表现出增加的体内效力，即使是相对于也包含相同缀合物的完全硫代磷酸酯对应物来说。此外，因为缀合导致摄取/效力的实质增加，所以为实现改进的耐受性，所述实质增益的些微损失是可接受的。因此，在某些实施方案中，缀合反义化合物包含至少一个磷酸二酯键联。
在某些实施方案中，本文的反义化合物的缀合造成肝细胞中递送、摄取和活性的增加。因此，向肝脏组织递送更多的化合物。然而，在某些实施方案中，仅递送增加不能解释活性的整体增加。在某些所述实施方案中，更多化合物进入肝细胞。在某些实施方案中，即使是肝细胞摄取增加也不能解释活性的整体增加。在所述实施方案中，缀合化合物的生产性(productive)摄取增加。例如，如实施例102中所示，相对于非实质细胞，含有GalNAc的缀合物的某些实施方案增加了反义寡核苷酸在肝细胞中的富集。此富集对靶向在肝细胞中表达的基因的寡核苷酸是有益的。
在某些实施方案中，本文的缀合反义化合物造成肾暴露减少。例如，如实施例20中所示，包含含有GalNAc的缀合物的某些实施方案的反义寡核苷酸在肾中的浓度低于缺乏含有GalNAc的缀合物的反义寡核苷酸的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此对于非肾靶标，肾积累是不希望的。
在某些实施方案中，本公开提供由下式表示的缀合反义化合物：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在上图和在本文的类似图中，支链基团“D”支化多次，所述次数是适应由“q”指示的(E-F)基团数目所必需的。因此，在q＝1时，式为：
A-B-C-D-E-F
在q＝2时，式为：
在q＝3时，式为：
在q＝4时，式为：
在q＝5时，式为：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在某些实施方案中，提供具有以下结构的缀合反义化合物：
在具有多于一个具体变量(例如，多于一个“m”或“n”)的实施方案中，除非另外指出，否则独立选择每个所述具体变量。因此，对于具有多于一个n的结构，独立地选择每个n，所以它们可为或可不为彼此相同的。
i.某些可裂解部分
在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解键。在某些实施方案中，可裂解部分包含可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团包含可裂解部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸。在某些所述实施方案中，可裂解部分直接连接至细胞靶向部分。在某些所述实施方案中，可裂解部分连接至缀合物接头。在某些实施方案中，可裂解部分包含磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，可裂解部分为可裂解核苷或核苷类似物。在某些实施方案中，核苷或核苷类似物包含选自以下的任选保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施方案中，可裂解部分为包含选自以下的任何保护的杂环碱基的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧核苷，所述2'-脱氧核苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分为2'-脱氧腺苷，所述2'-脱氧腺苷通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸的3'位并且通过磷酸二酯键联连接至接头。
在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的3'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的5'位。在某些实施方案中，可裂解部分连接至反义寡核苷酸的2'位。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键联连接至接头。在某些实施方案中，可裂解部分通过磷酸二酯键联连接至接头。在某些实施方案中，缀合物基团不包括可裂解部分。
在某些实施方案中，在将复合物施用至动物之后，仅在被靶细胞内化之后，可裂解部分才被裂解。在细胞内部，可裂解部***解，从而释放活性反义寡核苷酸。虽然不希望受理论的束缚，但是据信可裂解部分在细胞内被一种或多种核酸酶裂解。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶裂解可裂解部分与接头之间的磷酸二酯键联。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
其中Bx、Bx1、Bx2以及Bx3各自独立地为杂环碱基部分。在某些实施方案中，可裂解部分具有选自以下的结构：
ii.某些接头
在某些实施方案中，缀合物基团包含接头。在某些所述实施方案中，接头共价结合至可裂解部分。在某些所述实施方案中，接头共价结合至反义寡核苷酸。在某些实施方案中，接头共价结合至细胞靶向部分。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头还包含对固体载体的共价连接并且还包含对蛋白质结合部分的共价连接。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体(tethered ligand)的位置。在某些实施方案中，接头包括多个用于连接束缚配体的位置并且不连接至支链基团。在某些实施方案中，接头还包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括接头。
在某些实施方案中，接头包括至少线性基团，所述线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚(-S-)和羟氨基(-O-N(H)-)。在某些实施方案中，线性基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，线性基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷连接基团。在某些实施方案中，线性基团包含至少一个磷酸二酯基团。在某些实施方案中，线性基团包括至少一个中性连接基团。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和可裂解部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分和反义寡核苷酸。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至细胞靶向部分、可裂解部分、固体载体和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团包括一个或多个可裂解键。
在某些实施方案中，接头包括共价连接至支架基团的线性基团。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支架包括支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支架包括至少一个单环***或多环***。在某些实施方案中，支架包括至少两个单环***或多环***。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分和接头。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和固体载体。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头和蛋白质结合部分。在某些实施方案中，线性基团共价连接至支架基团并且支架基团共价连接至可裂解部分、接头、蛋白质结合部分和固体载体。在某些实施方案中，支架基团包括一个或多个可裂解键。
在某些实施方案中，接头包括蛋白质结合部分。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为脂质，例如像包括但不限于：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。在某些实施方案中，蛋白质结合部分为C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
在某些实施方案中，缀合物接头具有以下结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
iii.某些细胞靶向部分
在某些实施方案中，缀合物基团包含细胞靶向部分。某些所述细胞-靶向部分使反义化合物的细胞摄取增加。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链和一个或多个配体。在某些实施方案中，细胞靶向部分包含支链基团、一个或多个系链、一个或多个配体以及一个或多个可裂解键。
1.某些支链基团
在某些实施方案中，缀合物基团包含靶向部分，所述靶向部分包含支链基团和至少两个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团连接缀合物接头。在某些实施方案中，支链基团连接可裂解部分。在某些实施方案中，支链基团连接反义寡核苷酸。在某些实施方案中，支链基团共价连接至接头和每个束缚配体。在某些实施方案中，支链基团包含支链脂肪族基团，所述支链脂肪族基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟氨基。在某些实施方案中，支链基团包含选自以下的基团：烷基、酰胺和醚基团。在某些实施方案中，支链基团包含选自烷基和醚基团的基团。在某些实施方案中，支链基团包含单环***或多环***。在某些实施方案中，支链基团包含一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，缀合物基团不包括支链基团。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；
j为1至3；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
其中A1为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，支链基团具有选自以下的结构：
2.某些系链
在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至支链基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，缀合物基团包含共价连接至连接基团的一个或多个系链。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、醚、硫醚、二硫化物、酰胺、磷酸二酯和聚乙二醇基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基、取代的烷基、磷酸二酯、醚和酰胺基团。在某些实施方案中，每个系链为包含选自以下的一个或多个基团的线性脂肪族基团：处于任何组合的烷基和磷酸二酯。在某些实施方案中，每个系链包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
在某些实施方案中，系链包括一个或多个可裂解键。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷酸二酯基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过磷连接基团或中性连接基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至支链基团。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过酰胺或醚基团连接至配体。在某些实施方案中，系链通过醚基团连接至配体。
在某些实施方案中，每个系链在配体与支链基团之间包含约8至约20个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团在配体与支链基团之间包含约10至约18个原子的链长。在某些实施方案中，每个系链基团包含约13个原子的链长。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
在某些实施方案中，系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
在某些实施方案中，系链包含磷连接基团。在某些实施方案中，系链不包含任何酰胺键。在某些实施方案中，系链包含磷连接基团并且不包含任何酰胺键。
3.某些配体
在某些实施方案中，本公开提供了配体，其中每个配体共价连接至系链。在某些实施方案中，每个配体经过选择以对靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲合力。在某些实施方案中，选择对哺乳动物肝脏细胞表面上的至少一种类型的受体具有亲合力的配体。在某些实施方案中，选择对肝去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)具有亲合力的配体。在某些实施方案中，每个配体为碳水化合物。在某些实施方案中，每个配体独立地选自半乳糖、N-乙酰基半乳糖胺、甘露糖、葡萄糖、葡糖胺以及岩藻糖。在某些实施方案中，每个配体为N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。在某些实施方案中，靶向部分包含2至6个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个配体。在某些实施方案中，靶向部分包含3个N-乙酰基半乳糖胺配体。
在某些实施方案中，配体为碳水化合物、碳水化合物衍生物、改性的碳水化合物、多价碳水化合物聚簇、多糖、修饰的多糖或多糖衍生物。在某些实施方案中，配体为氨基糖或硫代糖。例如，氨基糖可选自任何数目的本领域中已知的化合物，例如葡糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃半乳糖(GalNAc)、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖(β-胞壁酸)、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖和N-磺基-D-葡糖胺以及N-乙醇酰基-α-神经氨酸。例如，硫代糖可选自由以下组成的组：5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖以及3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯。
在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰基半乳糖胺。在某些实施方案中，“N-乙酰基半乳糖胺”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，“GalNac”或“Gal-NAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，其包括两种β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，两种β形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖可以互换使用。因此，在其中描绘一种形式的结构中，这些结构也意图包括另一种形式。例如，在针对α形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖示出结构时，该结构也意图包括另一种形式。在某些实施方案中，在某些优选的实施方案中，β形式2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖为优选的实施方案。
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，一个或多个配体具有选自以下的结构：
i.某些缀合物
在某些实施方案中，缀合物基团包含以上结构特征。在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Z为H或连接的固体载体；
Q为反义化合物；
X为O或S；并且
Bx为杂环碱基部分。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些实施方案中，缀合物不包含吡咯烷。
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些所述实施方案中，缀合物基团具有以下结构：
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有六至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有十个连续键合的原子的取代或未取代的系链。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十一个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链包含恰好一个酰胺键。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基、烯基或炔基，或包含醚、酮、酰胺、酯、氨基甲酸酯、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、***、吡咯烷、二硫化物或硫醚的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基，或包含恰好一个醚或恰好两个醚、酰胺、胺、哌啶、磷酸酯、硫酸二酯或硫代磷酸酯的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y和Z独立地选自C1-C12取代或未取代的烷基。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中m和n独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中m为4、5、6、7或8，并且n为1、2、3或4。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有八个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中X不包含醚基团。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链，并且其中系链包含恰好一个酰胺键，并且其中X不包含醚基团。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中X为具有四至十三个连续键合的原子的取代或未取代的系链并且其中系链由酰胺键和取代或未取代的C2-C11烷基组成。
在某些实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基、烯基或炔基，或包含醚、酮、酰胺、酯、氨基甲酸酯、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯、硫代磷酸酯、***、吡咯烷、二硫化物或硫醚的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基，或包含醚、胺、哌啶、磷酸酯、磷酸二酯或硫代磷酸酯的基团。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中Y选自C1-C12取代或未取代的烷基。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。
在某些所述实施方案中，缀合物基团的细胞靶向部分具有以下结构：
其中n为4、5、6、7或8。
某些缀合反义化合物
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
在某些所述实施方案中，支链基团包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合物在核苷的2’、3’或5’位上结合至反义寡核苷酸的核苷。在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
C为缀合物接头
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
B为可裂解部分
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有以下结构：
其中
A为反义寡核苷酸；
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
在某些所述实施方案中，缀合物接头包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，每个系链包含至少一个可裂解键。
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
在某些实施方案中，缀合反义化合物具有选自以下的结构：
教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性美国专利、美国专利申请公布和国际专利申请公布包括但不限于US 5,994,517、US 6,300,319、US 6,660,720、US 6,906,182、US 7,262,177、US 7,491,805、US 8,106,022、US 7,723,509、US 2006/0148740、US 2011/0123520、WO 2013/033230和WO 2012/037254，所述专利中的每一个均以引用的方式整体并入本文。
教导某些上述缀合物、缀合反义化合物、系链、接头、支链基团、配体、可裂解部分以及其他修饰的制备的代表性公布包括但不限于BIESSEN等,"The CholesterolDerivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the HepaticAsialoglycoprotein Receptor:a Potent Cholesterol Lowering Agent"J.Med.Chem.(1995)38:1846-1852、BIESSEN等,"Synthesis of Cluster Galactosides with HighAffinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1995)38:1538-1546、LEE等,"New and more efficient multivalent glyco-ligands forasialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes"Bioorganic&MedicinalChemistry(2011)19:2494-2500、RENSEN等,"Determination of the Upper Size Limitfor Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor onHepatocytes in Vitro and in Vivo"J.Biol.Chem.(2001)276(40):37577-37584、RENSEN等,"Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-TerminatedGlycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic AsialoglycoproteinReceptor"J.Med.Chem.(2004)47:5798-5808、SLIEDREGT等,"Design and Synthesis ofNovel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomesto the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor"J.Med.Chem.(1999)42:609-618以及Valentijn等,“Solid-phase synthesis of lysine-based cluster galactosides withhigh affinity for the Asialoglycoprotein Receptor”Tetrahedron,1997,53(2),759-770，所述专利中的每一项均以引用的方式整体并入本文。
在某些实施方案中，缀合反义化合物包含基于RNA酶H的寡核苷酸(如缺口聚物)或剪接调节寡核苷酸(如完全修饰的寡核苷酸)和包含至少一个、两个或三个GalNAc基团的任何缀合物基团。在某些实施方案中，缀合反义化合物包含见于任何以下参考文献中的任何缀合物基团：Lee,Carbohydr Res,1978,67,509-514；Connolly等，J B iol Chem,1982,257,939-945；Pavia等，Int J Pep Protein Res,1983,22,539-548；Lee等，Biochem,1984,23,4255-4261；Lee等，G lycoconjugate J,1987,4,317-328；Toyokuni等，TetrahedronLett,1990,31,2673-2676；Biessen等，J Med Chem,1995,38,1538-1546；Valentijn等，Tetrahedron,1997,53,759-770；Kim等，Tetrahedron Lett,1997,38,3487-3490；Lee等，Bioconjug Chem,1997,8,762-765；Kato等，Glycobiol,2001,11,821-829；Rensen等，JBiol Ch em,2001,276,37577-37584；Lee等，Methods Enzymol,2003,362,38-43；Westerlind等，Glycoconj J,2004,21,227-241；Lee等，Bio org Med Chem Lett,2006,16(19),5132-5135；Maierhofer等，Bioor g Med Chem,2007,15,7661-7676；Khorev等，Bioorg Med Chem,2008,16,5216-5231；Lee等，Bioorg Med Chem,2011,19,2494-2500；Kornilova等，Analyt Biochem,2012,425,43-46；Pujol等，A ngew Chemie Int Ed Engl,2012,51,7445-7448；Biessen等，J Me d Chem,1995,38,1846-1852；Sliedregt等，J MedChem,1999,42,609-618；Rensen等，J Med Chem,2004,47,5798-5808；Rensen等，Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26,169-175；van Rossenb erg等，Gene Ther,2004,11,457-464；Sato等，J Am Chem Soc,2004,126,14013-14022；Lee等，J Org Chem,2012,77,7564-7571；Biessen等，FASEB J,2000,14,1784-1792；Rajur等，Bioconjug Chem,1997,8,935-940；Duff等，Methods Enzymol,2000,313,297-321；Maier等，BioconjugChem,2003,14,18-29；Jayaprakash等，Org Lett,2010,12,5410-5413；Manoharan,Antisense Nucleic Acid Drug Dev,2002,12,103-128；Merwin等，Bioconjug Chem,1994,5,612-620；Tomiya等，Bioorg Med Chem,2013,21,5275-5281；国际申请WO1998/013381；WO2011/038356；WO1997/046098；WO2008/098788；WO2004/101619；WO2012/037254；WO2011/120053；WO2011/100131；WO2011/163121；WO2012/177947；WO2013/033230；WO2013/075035；WO2012/083185；WO2012/083046；WO2009/082607；WO2009/134487；WO2010/144740；WO2010/148013；WO1997/020563；WO2010/088537；WO2002/043771；WO2010/129709；WO2012/068187；WO2009/126933；WO2004/024757；WO2010/054406；WO2012/089352；WO2012/089602；WO2013/166121；WO2013/165816；美国专利4,751,219；8,552,163；6,908,903；7,262,177；5,994,517；6,300,319；8,106,022；7,491,805；7,491,805；7,582,744；8,137,695；6,383,812；6,525,031；6,660,720；7,723,509；8,541,548；8,344,125；8,313,772；8,349,308；8,450,467；8,501,930；8,158,601；7,262,177；6,906,182；6,620,916；8,435,491；8,404,862；7,851,615；已公布的美国专利申请公布US2011/0097264；US2011/0097265；US2013/0004427；US2005/0164235；US2006/0148740；US2008/0281044；US2010/0240730；US2003/0119724；US2006/0183886；US2008/0206869；US2011/0269814；US2009/0286973；US2011/0207799；US2012/0136042；US2012/0165393；US2008/0281041；US2009/0203135；US2012/0035115；US2012/0095075；US2012/0101148；US2012/0128760；US2012/0157509；US2012/0230938；US2013/0109817；US2013/0121954；US2013/0178512；US2013/0236968；US2011/0123520；US2003/0077829；US2008/0108801以及US2009/0203132；所述参考文献中的每一个均以引用的方式整体并入。
细胞培养及反义化合物处理
可在多种细胞类型中体外测试反义化合物对PKK核酸的水平、活性或表达的作用。用于所述分析的细胞类型可获自商业供货商(例如American Type Culture Collection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；Clonetics Corporation,Walkersville,MD)且根据供货商的说明书使用商购的试剂(例如Life Technologies,Carlsbad,CA)进行培养。例示性细胞类型包括但不限于HepaRGTMT细胞和小鼠原代肝细胞。
体外测试反义寡核苷酸
本文描述用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可被适当修改以用于用其他反义化合物进行的处理。
可当细胞在培养中达到约60％至80％汇合度时，用反义寡核苷酸处理细胞。
一种常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括阳离子型脂质转染试剂LIPOFECTIN(Life Technologies,Carlsbad,CA)。可将反义寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Life Technologies,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需最终浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTIN浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的试剂包括LIPOFECTAMINE(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1血清减少型培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA)中混合以达成反义寡核苷酸的所需浓度及可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL范围内的LIPOFECTAMINE浓度。
另一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括电穿孔。
又一种用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的技术包括细胞对寡核苷酸的自由摄取。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可在反义寡核苷酸处理后16至24小时收获细胞，此时通过本领域中已知及本文所述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。一般来说，当在多次重复实验中进行处理时，数据呈现为重复处理的平均值。
所用的反义寡核苷酸浓度在细胞系之间有所不同。确定用于特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法在本领域中为熟知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，通常使用浓度在1nM至300nM范围内的反义寡核苷酸。当使用电穿孔进行转染时，使用625nM至20,000nM范围内的较高浓度的反义寡核苷酸。
RNA分离
可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA是使用本领域中熟知的方法，例如使用TRIZOL试剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)，根据制造商推荐的方案来制备。
分析对靶水平或表达的抑制
对PKK核酸的水平或表达的抑制可以本领域中已知的多种方式来测定。举例来说，靶核酸水平可通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来定量。可对总细胞RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法在本领域中是熟知的。RNA印迹分析在本领域中也是常规的。定量实时PCR宜使用商购的ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测***(可获自PE-Applied Biosystems,Foster City,CA且根据制造商说明书来使用)完成。
对靶RNA水平的定量实时PCR分析
可通过定量实时PCR，使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测***(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)根据制造商说明书来对靶RNA水平进行定量。定量实时PCR的方法在本领域中为熟知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA经历逆转录酶(RT)反应，产生互补的DNA(cDNA)，其接着用作实时PCR扩增的底物。在同一样品孔中依序进行RT及实时PCR反应。RT和实时PCR试剂可获自Life Technologies(Carlsbad,CA)。RT实时PCR反应通过本领域技术人员熟知的方法进行。
通过实时PCR获得的基因(或RNA)目标量是使用表达恒定的基因(诸如亲环素A(cyclophilin A))的表达水平或通过使用RIBOGREEN(Life Technologies,Inc.Carlsbad,CA)定量总RNA来标准化。亲环素A表达是通过实时PCR，通过与靶同时操作、复合操作或分开操作来定量。总RNA是使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)来定量。通过RIBOGREEN定量RNA的方法是教导于Jones,L.J.等(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中。使用CYTOFLUOR 4000仪器(PE Applied Biosystems)来测量RIBOGREEN荧光。
探针及引物被设计来与PKK核酸杂交。用于设计实时PCR探针及引物的方法在本领域中为熟知的，且可包括使用软件，如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems,FosterCity,CA)。
分析蛋白质水平
对PKK核酸的反义抑制可通过测量PKK蛋白质水平来评估。PKK的蛋白质水平可以本领域中熟知的多种方式来评价或定量，诸如免疫沉淀法、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如卡斯蛋白酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选法(FACS)。针对靶的抗体可被识别且获自多种来源，诸如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)，或可经由本领域中熟知的常规单克隆或多克隆抗体生成方法来制备。
体内测试反义化合物
在动物体内测试反义化合物(例如反义寡核苷酸)以评估它们抑制PKK表达及引起表型改变的能力。
在某些实施方案中，此类表型变化包括与炎性疾病相关的那些，诸如降低的炎症、水肿/肿胀、血管渗透性以及血管泄漏。在某些实施方案中，通过测量水肿、温度、疼痛、组织颜色以及动物腹部功能的增加或降低来测量炎症。
在某些实施方案中，此类表型变化包括与血栓栓塞疾病相关的那些，诸如aPTT延长、与正常PT结合的aPTT时间延长、血小板因子4(PF-4)的数量降低以及血栓形成降低或血栓形成的时间增加。
可在正常动物或实验疾病模型中进行测试。为了向动物施用，在药学上可接受的稀释剂(如磷酸盐缓冲的生理盐水)中配制反义寡核苷酸。施用包括胃肠外的施用途径，诸如腹膜内、静脉内以及皮下。计算反义寡核苷酸剂量及给药频率在本领域技术人员的能力范围内，且取决于如施用途径及动物体重的因素。在用反义寡核苷酸处理一段时间后，自肝脏组织分离RNA且测量PKK核酸表达的改变。
某些适应症
在某些实施方案中，本发明提供治疗个体的方法，所述方法包括施用本文所述的一种或多种药物组合物。
在某些实施方案中，个体具有炎性疾病。在某些实施方案中，所述个体处于发展炎性病状的风险中，包括但不限于遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑的血管性水肿、眼水肿、黄斑水肿以及脑水肿。所述个体包括具有导致炎症风险的获得性问题、疾病或病症的个体，例如，对炎性病状的遗传素质、环境因素以及暴露至某些药物，包括例如ACE抑制剂和ARB。在某些实施方案中，个体已被鉴别为需要抗炎治疗。此类个体的实例包括但不限于在针对补体1酯酶抑制剂(即C1-INH)或因子12的基因编码中具有突变的那些。在某些实施方案中，反常编码可以导致C1-INH(即I HAE型)的缺失、现有C1-INH(II HAE型)失去准确行使功能的能力或超官能团因子12(即III HAE型)。
在某些实施方案中，个体具有血栓栓塞疾病。在某些实施方案中，个体处于凝血病症的风险中，包括但不限于梗塞、血栓、栓、诸如深静脉血栓的血栓栓塞、肺栓塞、心肌梗塞以及中风。所述个体包括具有导致血栓风险的获得性问题、疾病或病症的个体，例如，外科手术、癌症、不动性、败血病、动脉粥样硬化心房颤动以及遗传倾向性，例如抗磷脂综合征和常染色体显性病状V Leiden因子。在某些实施方案中，个体已被鉴别为需要抗凝作用治疗。此类个体的实例包括但不限于进行大矫形手术(例如，髋部/膝盖更换或髋部)的那些和需要慢性治疗的患者诸如遭受心房颤动以防止中风的那些。
在某些实施方案中，本发明提供用于防治性减少个体的PKK表达的方法。某些实施方案包括通过向个体施用治疗有效量的靶向PKK核酸的反义化合物来治疗有需要的个体。
在一个实施方案中，施用治疗有效量的靶向PKK核酸的反义化合物同时伴随监测个体血清中的PKK水平以测定个体对施用反义化合物的反应。个体对施用反义化合物的反应可由医师用于确定治疗性干预的量及持续时间。
在某些实施方案中，施用靶向PKK核酸的反义化合物导致PKK表达减少至少15、20、25、30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％或处于由这些值中的任何两个值所界定的范围内。在某些实施方案中，包含靶向PKK的反义化合物的药物组合物是用于制备治疗患有或易患炎性疾病或血栓栓塞疾病的患者的药物。
某些组合物
1.ISIS 546254
在某些实施方案中，ISIS 546254的特征在于具有(从5’至3’)TGCAAGTCTCTTGGCAAACA的序列(以SEQ ID NO:570形式并入本文)的5-10-5MOE缺口聚物，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶，核苷1-5和16-20的每个为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，并且核苷6-15的每个为2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，通过以下化学记号描述ISIS 546254：Tes Ges mCes Aes AesGds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 546254：
结构1.ISIS 546254
在某些实施方案中，如实施例2(下文)所提供的ISIS 546254，当在24小时的处理时间段之后，使用具有5,000nM反义寡核苷酸的电穿孔进行转染并且通过定量实时PCR使用人引物探针集RTS3454进行测量并且根据总RNA含量进行调整，如通过进行测量，取得对培养的HepaRGTM细胞(每孔20,000个细胞的密度)中的人PKK mRNA的95％抑制。
在某些实施方案中，如实施例5(参见下文表34和41)所提供的ISIS 546254，当在16小时的处理时间段之后，使用电穿孔进行转染并且通过定量实时PCR使用人引物探针集RTS3454进行测量并且根据总RNA含量进行调整，如通过进行测量，取得对培养的HepaRGTM细胞(每孔20,000个细胞的密度)中的4个点剂量响应曲线(0.19μM、0.56μM、1.67μM以及5.0μM)中的0.2μM和0.3μM的IC50。
在某些实施方案中，如实施例7(下文)所提供的ISIS 546254，每周两次皮下注射2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周的ISIS 546254，保持3周时，取得携带人PKK基因序列的转基因小鼠中的31％、55％、84％以及83％的人PKK mRNA抑制和0％、36％、51％以及76％的人PKK蛋白质抑制。
在某些实施方案中，如实施例8(下文)所提供的ISIS 546254有效用于抑制PKKmRNA和蛋白质表达并且在灵长类中是耐受性的。
2.ISIS 546343
在某些实施方案中，ISIS 546343的特征在于具有(从5’至3’)CCCCCTTCTTTATAGCCAGC的序列(以SEQ ID NO:705形式并入本文)的5-10-5MOE缺口聚物，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶，核苷1-5和16-20的每个为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，并且核苷6-15的每个为2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，通过以下化学记号描述ISIS 546343：mCes mCes mCes mCesmCes Tds Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds Ads Gds mCes mCes Aes Ges mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶；
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 546343：
结构2.ISIS 546343
在某些实施方案中，如实施例2(参见下文表9和表10)所提供的ISIS 546343，当在24小时的处理时间段之后，使用具有5,000nM反义寡核苷酸的电穿孔进行转染并且通过定量实时PCR使用人引物探针集RTS3454进行测量并且根据总RNA含量进行调整，如通过进行测量，取得培养的HepaRGTM细胞(每孔20,000个细胞的密度)中的97％和91％的人PKK mRNA抑制。
在某些实施方案中，如实施例5(参见下文表34和41)两次所提供的ISIS 546343，当在16小时的处理时间段之后，使用电穿孔进行转染并且通过定量实时PCR使用人引物探针集RTS3454进行测量并且根据总RNA含量进行调整，如通过进行测量，取得对培养的HepaRGTM细胞(每孔20,000个细胞的密度)中的4个点剂量响应曲线(0.19μM、0.56μM、1.67μM以及5.0μM)中的0.4μM的IC50。
在某些实施方案中，如实施例7(下文)所提供的ISIS 546343，每周两次皮下注射2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周的ISIS 546343，保持3周时，取得携带人PKK基因序列的转基因小鼠中的46％、66％以及86％的人PKK mRNA抑制和0％、38％以及79％的人PKK蛋白质抑制。
在某些实施方案中，如实施例8(下文)所提供的ISISI 546343有效用于抑制PKKmRNA和蛋白质表达并且在灵长类中是耐受性的。
3.ISIS 548048
在某些实施方案中，ISIS 548048的特征在于具有核碱基序列(从5’至3’)CGATATCATGATTCCC(以SEQ ID NO:1666形式并入本文)的修饰反义寡核苷酸，其由16个2’-脱氧核苷、2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷以及cEt修饰的核苷组成，其中核苷1、2以及16中的每个为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，其中核苷3、14以及15中的每个为cEt修饰的核苷，其中核苷4-13中的每个为2’-脱氧核苷，其中每个核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联，并且其中每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，通过以下化学记号描述ISIS 548048：mCes Ges Aks Tds AdsTds mCds Ads Tds Gds Ads Tds Tds mCks mCks mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶；
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
k＝cEt修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 548048：
结构3.ISIS 548048
在某些实施方案中，如实施例3(下文)所提供的ISIS 548048，当在24小时的处理时间段之后，使用具有1,000nM反义寡核苷酸的电穿孔进行转染并且通过定量实时PCR使用人引物探针集RTS3454进行测量并且根据总RNA含量进行调整，如通过进行测量，取得对培养的HepaRGTM细胞(每孔20,000个细胞的密度)中的84％的mRNA抑制。
在某些实施方案中，如实施例6(下文)所提供的ISIS 548048，当在16小时的处理时间段之后，使用电穿孔进行转染并且通过定量实时PCR使用人引物探针集RTS3454进行测量并且根据总RNA含量进行调整，如通过进行测量，取得对培养的HepaRGTM细胞(每孔20,000个细胞的密度)中的4个点剂量响应曲线(0.11μM、0.33μM、1.00μM以及3.00μM)中的0.1μM的IC50。
在某些实施方案中，如实施例7(下文)所提供的ISIS 548048，每周两次皮下注射2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周的ISIS 548048，保持3周时，取得携带人PKK基因序列的转基因小鼠中的7％、77％、72％以及80％的人PKK mRNA抑制和23％、70％、89％以及98％的人PKK蛋白质抑制。
在某些实施方案中，如实施例8(下文)所提供的ISISI 548048有效用于抑制PKKmRNA和蛋白质表达并且在灵长类中是耐受性的。
4.ISIS 721744
在某些实施方案中，ISIS 721744的特征在于具有(从5’至3’)TGCAAGTCTCTTGGCAAACA(以SEQ ID NO:570形式并入本文)的序列的5-10-5MOE缺口聚物，其中核苷3至4、4至5、16至17以及17至18之间的核苷间键联为磷酸二酯键联并且核苷1至2、2至3、5至6、6至7、7至8、8至9、9至10、10至11、11至12、12至13、13至14、14至15、15至16、18至19以及19至20之间的核苷间键联为硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶为5’-甲基胞嘧啶，核苷1-5和16-20中的每个为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，并且核苷6-15中的每个为2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，通过以下化学记号描述ISIS 721744：GalNAc3-7a-o’Tes GesmCeo Aeo Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aeo Aeo Aes mCes Ae；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，
o＝磷酸二酯核苷间键联，
s＝硫代磷酸酯核苷间键联，并且
GalNAc3-7a-o’＝
在某些实施方案中，通过以下化学结构描述ISIS 721744：
某些聚光角区
1.SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基27427-27466。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466为聚光角区。在某些实施方案中，SEQID NO:10的核碱基27427-27466通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466通过以下ISIS号进行靶向：530993、530994、530995、546251、546252、546253、546254、546255、546256、547410、547411、547978、547979、547980以及547981。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466通过以下SEQ ID NO进行靶向：94、95、96、566、567、568、569、570、571、572、573、1597、1598、1599以及1600。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
2.SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基33183-33242。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242为聚光角区。在某些实施方案中，SEQID NO:10的核碱基33183-33242通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242通过以下ISIS号进行靶向：531052、531053、531054、531055、531056、531057、531158、546343、546345、547480、547481、547482以及547483。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242通过以下SEQ ID NO进行靶向：155、156、157、158、159、160、261、702、703、704、705、706以及707。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK mRNA和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
3.SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基30570-30610。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610为聚光角区。在某些实施方案中，SEQID NO:10的核碱基30570-30610通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610通过以下ISIS号进行靶向：531026、546309、546310、546311、546313、547453、547454、547455、547456、547457、547458、548046、548047、548048、548049以及548050。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610通过以下SEQ ID NO进行靶向：129、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、1664、1665、1666、1667以及1668。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK mRNA和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
4.SEQ ID NO:10的核碱基27427-27520
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基27427-27520。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27427-27520为聚光角区。在某些实施方案中，SEQID NO:10的核碱基27427-27520通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27427-27520通过以下ISIS号进行靶向：530993-530999、546251-546256、546258-546260、546263、546265-546268、547410-547417以及547978-547992。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27427-27520通过以下SEQ ID NO进行靶向：94-100、566-587以及1597-1611。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基27427-27520的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
5.SEQ ID NO:10的核碱基33085-33247
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基33085-33247。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33085-33247为聚光角区。在某些实施方案中，SEQID NO:10的核碱基33085-33247通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33085-33247通过以下ISIS号进行靶向：531041-531158、546336、546339、546340、546343、546345、547474-547483、547778、548077-548082以及548677-548678。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33085-33247通过以下SEQ ID NO进行靶向：144-160、261、693-707、1256、1320-1325、2214以及2215。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基33085-33247的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
6.SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基30475-30639。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639为聚光角区。在某些实施方案中，SEQID NO:10的核碱基30475-30639通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639通过以下ISIS号进行靶向：531021-531029、531146、546297、546299-546304、546306-546311、546313、546316-546319、547444-547462、548031、548032以及548034-548056。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639通过以下SEQ ID NO进行靶向：124-132、249、633-669以及1650-1674。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
7.SEQ ID NO:10的核碱基27362-27524
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基27362-27524。在某些实施方案中，核碱基27362-27524对应于PKK(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的外显子9。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27362-27524为聚光角区。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27362-27524通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27361-27524通过以下ISIS号进行靶向：530985-530999、546244、546247-546256、546258-546260、546263、546265-546268、547403-547417、547723-547970以及547972-547992。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基27361-27524通过以下SEQ ID NO进行靶向：86-100、554-587、1217以及1588-1611。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基27362-27524的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
8.SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基33101-33240。在某些实施方案中，核碱基33101-33240对应于PKK(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的外显子14。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240为聚光角区。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240通过以下ISIS号进行靶向：531041-531158、546336、546339、546340、546343、546345、547474-547483、548077-548082以及548678-548678。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240通过以下SEQ ID NO进行靶向：144-160、261、693-707、1320-1325以及2215。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基33101-33240的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
9.SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638
在某些实施方案中，反义寡核苷酸被设计来靶向SEQ ID NO:10(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的核碱基30463-30638。在某些实施方案中，核碱基30463-30638对应于PKK(从核碱基111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的外显子12。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638为聚光角区。在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638通过反义寡核苷酸进行靶向。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的长度为15个、16个、17个、18个、19个或20个核碱基。在某些实施方案中，反义寡核苷酸为缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。在某些实施方案中，缺口聚物为5-10-5MOE和cEt缺口聚物、4-9-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-4MOE和cEt缺口聚物、4-10-3MOE和cEt缺口聚物、3-10-4MOE和cEt缺口聚物或3-10-3MOE和cEt缺口聚物。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联进行连接。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638通过以下ISIS号进行靶向：531021-531029、531146、546297、546299-546304、546306-546311、546313、546316-546319、547444-547462、548031、548032以及548034-548056。
在某些实施方案中，SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638通过以下SEQ ID NO进行靶向：124-132、249、633-669以及1650-1674。
在某些实施方案中，靶向SEQ ID NO:10的核碱基30463-30638的反义寡核苷酸在体外和/或体内实现PKK和/或蛋白质水平至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的减少。
实施例
非限制性公开且以引用方式并入
虽然已根据某些实施方案具体描述了本文所述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文所述的化合物并且不意图限制所述化合物。本申请中所述的各参考文献以引用的方式整体并入本文。
以下实施例说明了本公开的某些实施方案并且不是限制性的。此外，在提供具体实施方案时，发明人已预期了那些具体实施方案的一般应用。例如，具有具体基序的寡核苷酸的公开为具有相同或类似基序的另外的寡核苷酸提供了合理支持。并且，例如，在特别高亲合力的修饰出现在具***置上时，相同位置上的其他高亲合力修饰也认为是合适的，除非另外指出。
实施例1：用于制备亚磷酰胺化合物1、1a和2的一般方法
根据如本文说明书所述的本领域已知的程序制备化合物1、1a和2(参见Seth等,Bioorg.Med.Chem.,2011,21(4),1122-1125,J.Org.Chem.,2010,75(5),1569-1581,Nucleic Acids Symposium Series,2008,52(1),553-554)；并且还参见已公布的PCT国际申请(WO 2011/115818、WO 2010/077578、WO2010/036698、WO2009/143369、WO 2009/006478以及WO 2007/090071)和美国专利7,569,686)。
实施例2：制备化合物7
化合物3(2-乙酰氨基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D吡喃半乳糖或半乳糖胺五乙酸酯)为商业上可获得的。根据公布的工序制备化合物5(Weber等，J.Med.Chem.,1991,34,2692)。
实施例3：制备化合物11
化合物8和9为商业上可获得的。
实施例4：制备化合物18
根据实施例3中说明的工序制备化合物11。化合物14为商业上可获得的。使用由Rensen等，J.Med.Chem.,2004,47,5798-5808所报道的类似工序制备化合物17。
实施例5：制备化合物23
化合物19和21为商业上可获得的。
实施例6：制备化合物24
根据实施例4和5中说明的工序制备化合物18和23。
实施例7：制备化合物25
根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
实施例8：制备化合物26
根据实施例6中说明的工序制备化合物24。
实施例9：在3’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物29的一般制备
其中受保护的GalNAc3-1具有以下结构：
缀合物基团GalNAc3-1的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-1a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-1a具有下式：
根据实施例7中说明的程序制备固体载体结合的受保护的GalNAc3-1，即化合物25。使用自动化DNA/RNA合成中的标准程序制备在3’末端包含GalNAc3-1的低聚化合物29(参见Dupouy等,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
实施例10：在5’末端包含GalNAc3-1的缀合ASO化合物34的一般制备
UnylinkerTM 30为商业上可获得的。使用自动化DNA/RNA合成中的标准程序制备在5’末端包含GalNAc3-1聚簇的低聚化合物34(参见Dupouy等,Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例1中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物1和1a。所述的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量以制备如本文所述的有缺口的低聚化合物。所述有缺口的低聚化合物可具有如任何给定靶标所指示的预先确定的组成和碱基序列。
实施例11：制备化合物39
根据实施例2、4和5中说明的工序制备化合物4、13和23。使用公布于以下的类似工序制备化合物35：Rouchaud等，Eur.J.Org.Chem.,2011,12,2346-2353。
实施例12：制备化合物40
根据实施例11中说明的工序制备化合物38。
实施例13：制备化合物44
根据实施例5和11中说明的工序制备化合物23和36。使用公布于WO 2009082607中的类似工序制备化合物41。
实施例14：制备化合物45
根据实施例13中说明的工序制备化合物43。
实施例15：制备化合物47
化合物46为商业上可获得的。
实施例16：制备化合物53
化合物48和49为商业上可获得的。根据实施例4和15中说明的工序制备化合物17和47。
实施例17：制备化合物54
根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
实施例18：制备化合物55
根据实施例16中说明的工序制备化合物53。
实施例19：用于通过固相技术制备在3’位包含GalNAc3-1的缀合ASO的一般方法(ISIS 647535、647536以及651900的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G以及mC残基。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscienceoligopilot合成器(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的负载GalNAc3-1的VIMAD固体载体(110μmol/g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体上的负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺缩合。所有其他步骤遵循由生厂商供应的标准协议。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫化3分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
在装配希望的序列之后，使用三乙胺和乙腈的1:1(v/v)混合物将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热6h。
然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。将残余物通过高压液相色谱在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source 30Q，30μm，2.54x8cm，A＝100mM于30％CH3CN水溶液中的醋酸铵，B＝1.5M于A中的NaBr，0-40％的B持续60min，流速14mL min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用Agilent 1100MSD***通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
使用本领域中熟知的标准寡核苷酸合成工序合成不包含缀合物的反义寡核苷酸。
使用这些方法，制备了靶向ApoC III的三种单独的反义化合物。如以下表17中所概述，靶向ApoC III的三种反义化合物中的每一种均具有相同的核碱基序列；ISIS 304801为具有所有硫代磷酸酯键联的5-10-5MOE缺口聚物；ISIS 647535与ISIS 304801相同，除了ISIS 647535具有缀合在其3’末端的GalNAc3-1；并且ISIS 647536与ISIS 647535相同，除了所述化合物的某些核苷间键联为磷酸二酯键联。如表17中进一步概述，合成了靶向SRB-1的两种单独的反义化合物。ISIS 440762为具有所有硫代磷酸酯核苷间键联的2-10-2cEt缺口聚物；ISIS 651900与ISIS 440762相同，除了ISIS 651900在其3’-末端包括GalNAc3-1。
表17
靶向ApoC III和SRB-1的修饰ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”指示具有先前在实施例9中示出的结构的缀合物基团。应注意，GalNAc3-1包含将ASO连接至缀合物的剩余部分的可裂解腺苷，所述可裂解腺苷命名为“GalNAc3-1a”。这种命名法用于上表以显示整个核碱基序列，包括作为缀合物的一部分的腺苷。因此，在上表中，序列还可列为以“GalNAc3-1”结尾，其中省略“Ado”。在全部这些实施例中使用了这种惯例：使用下标“a”来指示缺乏可裂解核苷或可裂解部分的缀合物基团的部分。缺乏可裂解部分的缀合物基团的此部分在本文中是指“聚簇”或“缀合物聚簇”或“GalNAc3聚簇”。在某些情况下，通过单独提供其聚簇和其可裂解部分来方便地描述缀合物基团。
实施例20：huApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的剂量依赖性反义抑制
在剂量依赖性研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且以上描述的ISIS 304801和ISIS 647535进行单独测试和评价。
处理
将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
每周一次在0.08、0.25、0.75、2.25或6.75μmol/kg下用ISIS 304801或647535或使用PBS作为对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。每个处理组由4只动物组成。在施用最后剂量之后的四十八小时，从每只小鼠中抽血并且将小鼠处死并收集组织。
ApoC III mRNA分析
使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案来测定小鼠肝脏中的ApoC III mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的ApoC III mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的ApoC III mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。每个ASO的半数最大有效剂量(ED50)也呈现于以下表18中。
如所说明的，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III RNA减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表18
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
ApoC III蛋白分析(浊度测定)
使用在2013年3月29日印刷之前在线公布的Graham等，Circulation Research所报道的工序确定血浆ApoC III蛋白分析。
在不稀释的情况下，使用Olympus临床分析仪和可商购获得的浊度ApoC III测定法(Kamiya,Cat#KAI-006,Kamiya Biomedical,Seattle,WA)对从小鼠分离的约100μl血浆进行分析。如供应商所述执行测定方案。
如以下表19中所示，相对于PBS对照，这两种反义化合物使ApoC III蛋白减少。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表19
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
通过Bligh和Dyer(Bligh,E.G.和Dyer,W.J.Can.J.Biochem.Physiol.37:911-917,1959)(Bligh,E和Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)(Bligh,E和Dyer,W,Can J Biochem Physiol,37,911-917,1959)的方法提取血浆甘油三酯和胆固醇并且通过使用Beckmann Coulter临床分析仪和商业上可获得的试剂来测量。
相对于PBS注射的小鼠测量甘油三酯水平并且表示为“％PBS”。结果呈现于表20中。如所说明的，这两种反义化合物使甘油三酯水平降低。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。
表20
ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
通过HPLC分析血浆样品来测定总胆固醇和不同级分的胆固醇(HDL和LDL)的量。结果呈现于表21和22中。如所说明的，这两种反义化合物使总胆固醇水平降低；均使LDL降低；并且均使HDL升高。此外，缀合至GalNAc3-1的反义化合物(ISIS 647535)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)更有效。HDL水平增加和LDL水平降低为反义抑制ApoC III的心血管有益作用。
表21
ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
表22
ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
药物代谢动力学分析(PK)
还评价了ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏和肾样品。在MSD1上利用IP-HPLC-MS分析样品。测量全长ISIS 304801和647535的组织水平(μg/g)并且结果提供于表23中。如所说明的，对于两种反义化合物，总全长反义化合物的肝脏浓度类似。因此，即使GalNAc3-1-缀合的反义化合物在肝脏中更具活性(如通过以上RNA和蛋白质数据所展示)，但它在肝脏中不以大致上更高的浓度存在。事实上，所计算的EC50(提供于表23中)证实了所观察到的缀合化合物的效力增加不能完全归因于积累增加。此结果表明缀合物不仅仅通过肝脏积累的机制，还可能通过改进细胞对反义化合物的产生性摄取来改进效力。
结果还显示GalNAc3-1缀合反义化合物在肾中的浓度低于缺乏GalNAc缀合物的反义化合物的浓度。这具有若干有益的治疗意义。对于不想要在肾中的活性的治疗适应症(indication)，对肾的暴露具有肾毒性的风险而没有相应的益处。此外，肾中的高浓度通常导致化合物流失至尿液，从而导致更快的清除。因此，对于非肾靶标，肾积累为不希望的。这些数据表明GalNAc3-1缀合使肾积累减少。
表23
转基因小鼠中ASO处理的PK分析
还鉴定了ISIS 647535的代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。以下示出所观察到的代谢物的裂解位点和结构。使用标准工序计算全长ASO的相对％并且结果呈现于表23a中。ISIS 647535的主要代谢物为缺乏整个缀合物的全长ASO(即ISIS304801)，其由在以下示出的裂解位点A处裂解产生。此外，还观察到由其他裂解位点产生的另外代谢物。这些结果表明在GalNAc3-1糖与ASO之间引入其他可裂解键如酯、肽、二硫化物、氨基磷酸酯或酰基腙也可以是有用的，所述可裂解键可被细胞内部的酶裂解或所述可裂解键可在细胞液的还原性环境中裂解或所述可裂解键对内体和溶酶体内部的酸性pH不稳定。
表23a
所观察到的ISIS 647535的全长代谢物
实施例21：单一施用研究中人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的反义抑制
在单一施用研究中，针对其抑制人ApoC III转基因小鼠中的人ApoC III的能力，对各自靶向人ApoC III并且描述于表17中的ISIS 304801、647535和647536进行进一步评价。
处理
将人ApoCIII转基因小鼠维持在12小时亮/暗循环中并且随意喂食Teklad实验室食物。在开始实验之前，使动物在研究设备中适应至少7天。在PBS中制备ASO并且通过过滤通过0.2微米过滤器进行灭菌。将ASO溶解于0.9％PBS中用于注射。
在以下示出的剂量下，用ISIS 304801、647535或647536(以上所述)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠一次。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III mRNA和蛋白质水平；血浆甘油三酯；以及胆固醇，包括如上所述(实施例20)评估的HDL和LDL级分。来自那些分析的数据呈现于以下表24-28中。使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。ALT和AST水平显示反义化合物在所有施用的剂量下为耐受良好的。
这些结果显示了与缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 304801)相比，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 647535和647536)的效力的改进。此外，包含GalNAc3-1缀合物和一些磷酸二酯键联的ISIS 647536与ISIS 647535一样有效，所述ISIS 647535包含相同的缀合物并且ASO内的所有核苷间键联为硫代磷酸酯。
表24
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III mRNA水平的影响
表25
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III血浆蛋白水平的影响
表26
ASO处理对转基因小鼠中甘油三酯水平的影响
表27
ASO处理对转基因小鼠中总胆固醇水平的影响
表28
ASO处理对转基因小鼠中HDL和LDL胆固醇水平的影响
这些结果证实GalNAc3-1缀合物改进了反义化合物的效力。结果还显示了其中反义寡核苷酸具有混合的键联的GalNAc3-1缀合反义化合物(具有六个磷酸二酯键联的ISIS647536)和相同反义化合物的全部硫代磷酸酯型式(ISIS 647535)的相等效力。
硫代磷酸酯键联为反义化合物提供若干性质。例如，它们抗核酸酶消化并且它们结合导致化合物在肝脏中积累而不是在肾/尿液中积累的蛋白质。这些为希望的性质，特别是当治疗肝脏中的适应症时。然而，硫代磷酸酯键联还与炎症性应答相关。因此，减少化合物中硫代磷酸酯键联的数目预期会减小炎症的风险，但是也降低化合物在肝脏中的浓度，增加在肾和尿液中的浓度，减小在核酸酶存在下的稳定性并且降低总体效力。本结果显示其中某些硫代磷酸酯键联已被磷酸二酯键联替代的GalNAc3-1缀合反义化合物与具有全部硫代磷酸酯键联的对应物在对抗肝脏中的靶标方面一样有效。所述化合物预期为促炎性较少的(参见实施例24，其描述了显示PS的减少导致炎症性作用减小的实验)。
实施例22：靶向SRB-1的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体内的作用
在剂量依赖性研究中，针对其抑制Balb/c小鼠中的SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1并且描述于表17中的ISIS 440762和651900进行评价。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。
如表29中所说明的，这两种反义化合物使SRB-1 mRNA水平降低。此外，包含GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 651900)大致上比缺乏GalNAc3-1缀合物的反义化合物(ISIS 440762)更有效。这些结果展示使用与不同靶标互补并且具有不同化学修饰核苷的反义寡核苷酸观察到GalNAc3-1缀合物的效力益处，在这种情况下，修饰核苷包含约束乙基糖部分(双环糖部分)。
表29
ASO处理对Balb/c小鼠中SRB-1 mRNA水平的影响
实施例23：人外周血单核细胞(hPBMC)测定方案
使用BD Vautainer CPT管法进行hPBMC测定。从在美国健康工作诊所(Faraday&ElCamino Real,Carlsbad)具有知情同意书的志愿供体中获得全血样品并且收集在4-15个BDVacutainer CPT 8ml管中(VWR Cat.#BD362753)。使用PBMC测定数据表记录每个供体的CPT管中的大约起始总全血体积。
通过将管轻轻倒置8-10次在离心之前立即重新混合血液样品。将CPT管在具有制动的1500-1800RCF(2700RPM Beckman Allegra 6R)下、在水平(摆动)转子中在室温(18-25℃)下离心30min。从血沉棕黄层界面(在Ficoll与聚合物凝胶层之间)取回细胞；转移至无菌50ml圆锥管并且汇集至5个CPT管/50ml圆锥管/供体。然后用PBS(无Ca++、Mg++；GIBCO)洗涤细胞两次。将管加满至50ml并且通过倒置若干次来混合。然后将样品在室温下在330x g下(在Beckman Allegra 6R中的1215RPM)离心15分钟并且在不干扰沉淀物的情况下尽可能多的抽吸上清液。通过轻轻旋转管使细胞沉淀物脱落并且将细胞重新悬浮在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素(大约1ml/10ml起始全血体积)中。将60μl样品用移液管移入到具有600μlVersaLyse试剂(Beckman Coulter Cat#A09777)的样品小瓶(Beckman Coulter)中并且轻轻涡旋10-15秒。将样品在室温下孵育10min并且在计数之前再次混合。使用PBMC细胞类型(1:11的稀释因子与其他参数一起存储)在Vicell XR细胞活力分析仪(Beckman Coulter)上计数细胞悬浮液。记录活细胞/ml和活力。在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中将细胞悬浮液稀释至1x107活PBMC/ml。
将细胞以5x105涂布在50μl/孔的96孔组织培养平板(Falcon Microtest)中。根据实验模板(总共100μl/孔)添加50μl/孔的稀释在RPMI+10％FBS+青霉素/链霉素中的2x浓度寡核苷酸/对照。将平板放置在振荡器上并且允许混合约1min。在37℃、5％CO2下孵育24小时之后，将平板在400x g下离心10分钟，之后去除上清液用于MSD细胞因子测定(即人IL-6、IL-10、IL-8以及MCP-1)。
实施例24：在hPBMC测定中评价GalNAc3-1缀合ASO的促炎性作用
使用实施例23中描述的方案，在hPBMC测定中评价列于表30中的反义寡核苷酸(ASO)的促炎性作用。ISIS 353512为已知为测定中的IL-6释放的高响应者的内标物。从新鲜志愿供体中分离hPBMC并且用0μM、0.0128μM、0.064μM、0.32μM、1.6μM、8μM、40μM和200μM浓度下的ASO处理。在24小时处理之后，测量细胞因子水平。
IL-6的水平用作原始读出。使用标准工序计算EC50和Emax。结果表达为来自两个供体的Emax/EC50的平均比率并且表示为“Emax/EC50”。较低的比率表明促炎性反应相对减小并且较高的比率表明促炎性反应相对增加。
对于测试化合物，促炎性最小的化合物为PS/PO连接的ASO(ISIS 616468)。GalNAc3-1缀合ASO(ISIS 647535)比其未缀合的对应物ISIS 304801的促炎性稍小。这些结果表明掺入一些PO键联使促炎性反应减小并且添加GalNAc3-1缀合物并不使化合物更具有促炎性并且可能减小促炎性反应。因此，人们将预期包含混合的PS/PO键联和GalNAc3-1缀合物的反义化合物将相对于具有或不具有GalNAc3-1缀合物的全部PS连接的反义化合物产生较低的促炎性反应。这些结果表明GalNAc3-1缀合反义化合物(尤其是具有减小的PS含量的那些)为促炎性较小的。
总之，这些结果表明GalNAc3-1缀合化合物(尤其是具有减小的PS含量的缀合化合物)可在比缺乏GalNAc3-1缀合物的对应全部PS反义化合物更高的剂量下施用。因为不预期这些化合物的半衰期是大致上不同的，所以所述较高施用将导致较不频繁的给药。事实上，所述施用可为甚至更不频繁的，因为GalNAc3-1缀合化合物为更有效的(参见实施例20-22)并且一旦化合物的浓度下降到低于所需要的水平，重新给药是必要的，其中所述需要的水平基于效力。
表30
修饰ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“Ado’-GalNAc3-1a”指示所指的具有连接至反义寡核苷酸的3’-末端的在实施例9中示出的结构GalNAc3-1的缀合物。
表31
靶向ApoC III的ASO在hPBMC测定中的促炎性作用
实施例25：靶向人ApoC III的GalNAc3-1缀合的修饰ASO在体外的作用
在体外测试以上所述的ISIS 304801和647535。用0.03μM、0.08μM、0.24μM、0.74μM、2.22μM、6.67μM和20μM浓度的修饰寡核苷酸处理密度为25,000个细胞/孔的来自转基因小鼠的原代肝细胞。在大约16小时的处理期后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过RIBOGREEN所测量，根据总RNA含量调节hApoC III mRNA水平。
使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表32中。如所说明的，与对照ISIS 304801相比，在用ISIS 647535处理的细胞中观察到可比的效力。
表32
靶向原代肝细胞中的人ApoC III的修饰ASO
在本实验中，在体外没有观察到在体内所观察到的GalNAc3-1缀合的极大效力益处。随后体外的在原代肝细胞中的自由摄取实验确实显示了包含各种GalNAc缀合物的寡核苷酸相对于缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸的效力增加。(参见实施例60、82以及92)
实施例26：PO/PS键联对ApoC III ASO活性的影响
每周一次以25mg/kg的ISIS 304801或ISIS 616468(上述两者)或用PBS处理的对照腹膜内注射人ApoC III转基因小鼠，持续两周。处理组由3只动物组成并且对照组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死。
如上所述收集样品并且分析以测定肝脏中的ApoC III蛋白水平(实施例20)。来自那些分析的数据呈现于以下表33中。
这些结果表明相对于全部PS(ISIS 304801)，在翼中具有PO/PS的反义化合物(ISIS 616468)效力减小。
表33
ASO处理对人ApoC III转基因小鼠中ApoC III蛋白水平的影响
实施例27：化合物56
化合物56可从Glen Research商业上获得或可根据由Shchepinov等，NucleicAcids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的已公布工序制备。
实施例28：制备化合物60
根据实施例2中说明的工序制备化合物4。化合物57为商业上可获得的。通过结构分析来证实化合物60。
化合物57意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他单保护的取代或未取代的烷基二醇包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备具有预先确定的组成的亚磷酰胺。
实施例29：制备化合物63
使用类似于由Tober等,Eur.J.Org.Chem.,2013,3,566-577和Jiang等,Tetrahedron,2007,63(19),3982-3988所报道的那些的工序制备化合物61和62。
或者，使用类似于由Kim等，Synlett,2003,12,1838-1840；和Kim等，已公布的PCT国际申请WO 2004063208的科学和专利文献中所报道的那些的工序制备化合物63。
实施例30：制备化合物63b
使用类似于由Hanessian等，Canadian Journal of Chemistry,1996,74(9),1731-1737所报道的那些的工序制备化合物63a。
实施例31：制备化合物63d
使用类似于由Chen等，Chinese Chemical Letters,1998,9(5),451-453所报道的那些的工序制备化合物63c。
实施例32：制备化合物67
根据实施例2中说明的工序制备化合物64。使用类似于由Or等，已公布的PCT国际申请WO 2009003009所报道的那些的工序制备化合物65。用于化合物65的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
实施例33：制备化合物70
根据实施例2中说明的工序制备化合物64。化合物68为商业上可获得的。用于化合物68的保护基意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他保护基包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些。
实施例34：制备化合物75a
根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的公布的工序制备化合物75。
实施例35：制备化合物79
根据由Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1997,25(22),4447-4454所报道的公布的工序制备化合物76。
实施例36：制备化合物79a
根据实施例35中说明的工序制备化合物77。
实施例37：用于通过固体载体制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的缀合低聚化合物82的一般方法(方法I)
其中GalNAc3-2具有以下结构：
缀合物基团GalNAc3-2的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-2a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-2a具有下式：
使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。分别根据实施例27和28中说明的工序制备亚磷酰胺化合物56和60。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯连接的缀合物基团的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例38：用于制备在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的低聚化合物82的替代方法(方法II)
使用用于自动化DNA/RNA合成的标准工序制备VIMAD结合的低聚化合物79b(参见Dupouy等，Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45,3623-3627)。根据实施例35中说明的工序制备GalNAc3-2聚簇亚磷酰胺，即化合物79。此替代方法允许在合成的最后一步将磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物一步装至低聚化合物。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元包括但不限于在本文的说明书中呈现的那些来制备在5’末端具有磷酸二酯缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例39：用于通过固体载体制备在5’末端包含GalNAc3-3缀合物的低聚化合物83h(针对5'末端连接修饰的GalNAc3-1)的一般方法
根据实施例4中说明的工序制备化合物18。化合物83a和83b为商业上可获得的。使用标准寡核苷酸合成工序制备包含磷酸二酯连接的己胺的低聚化合物83e。用氨水处理受保护的低聚化合物提供5'-GalNAc3-3缀合的低聚化合物(83h)。
其中GalNAc3-3具有以下结构：
缀合物基团GalNAc3-3的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-3a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-3a具有下式：
实施例40：用于通过固体载体制备在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-4缀合物的低聚化合物89的一般方法
其中GalNAc3-4具有以下结构：
其中CM为可裂解部分。在某些实施方案中，可裂解部分为：
缀合物基团GalNAc3-4的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-4a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。其中GalNAc3-4a具有下式：
受保护的Unylinker官能团化的固体载体化合物30为商业上可获得的。使用类似于文献中所报道的那些的工序制备化合物84(参见Shchepinov等，Nucleic AcidsResearch,1997,25(22),4447-4454；Shchepinov等，Nucleic Acids Research,1999,27,3035-3041；以及Hornet等，Nucleic Acids Research,1997,25,4842-4849)。
根据实施例28和36中说明的工序制备亚磷酰胺结构单元，即化合物60和79a。所说明的亚磷酰胺意在为代表性的并且不意图为限制性的，因为可使用其他亚磷酰胺结构单元来制备具有预先确定的序列和组成的在3’末端具有磷酸二酯连接的缀合物的低聚化合物。可调节添加至固体载体的亚磷酰胺的顺序和量来制备具有任何预先确定的序列和组成的如本文所述的低聚化合物。
实施例41：用于通过固相技术制备在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37，Bx为腺嘌呤)缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661134的制备)
除非另外说明，否则用于合成低聚化合物的所有试剂和溶液均购自商业来源。使用标准亚磷酰胺结构单元和固体载体来掺入核苷残基，所述核苷残基包括例如T、A、G以及mC残基。使用亚磷酰胺化合物56和60来合成5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物。0.1M的亚磷酰胺在无水乙腈中的溶液用于β-D-2’-脱氧核糖核苷和2’-MOE。
在ABI 394合成器(1-2μmol规模)上或在GE Healthcare Bioscienceoligopilot合成器(40-200μmol规模)上通过填充在柱中的VIMAD固体载体(110μmol/g，Guzaev等，2003)上的亚磷酰胺偶联方法来进行ASO合成。对于偶联步骤，以超过固体载体的初始负载量4倍的量递送亚磷酰胺并且持续10min进行亚磷酰胺偶联。所有其他步骤遵循由生厂商供应的标准协议。使用6％二氯乙酸在甲苯中的溶液来从核苷酸的5’-羟基上去除二甲氧基三苯甲基(DMT)。无水CH3CN中的4,5-二氰基咪唑(0.7M)用作偶联步骤过程中的活化剂。通过用苍耳烷氢化物在1:1吡啶/CH3CN中的0.1M溶液硫化3分钟的接触时间来引入硫代磷酸酯键联。使用20％叔丁基过氧化氢在含有6％水的CH3CN中的溶液作为氧化剂来提供磷酸二酯核苷间键联，其中接触时间为12分钟。
在装配希望的序列之后，使用20％甲苯中的二乙胺(v/v)将磷酸氰基乙酯保护基去保护，其中接触时间为45分钟。将固体载体结合的ASO悬浮在氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热6h。
然后过滤未结合的ASO并且将氨煮沸掉。将残余物通过高压液相色谱在强阴离子交换柱上纯化(GE Healthcare Bioscience，Source 30Q，30μm，2.54x8cm，A＝100mM于30％CH3CN水溶液中的醋酸铵，B＝1.5M于A中的NaBr，0-40％的B持续60min，流速14mL min-1，λ＝260nm)。残余物通过HPLC在反相柱上脱盐以得到基于固体载体上的初始负载量为15％-30％的分离产率的希望的ASO。使用Agilent 1100MSD***通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
表34
靶向SRB-1的在5’位上包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(例如cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-2a”的结构在实施例37中示出。
实施例42：用于通过固相技术制备在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO的一般方法(ISIS 661166的制备)
使用如实施例39和41中所说明的类似工序进行ISIS 661166的合成。
ISIS 661166为5-10-5MOE缺口聚物，其中5’位包含GalNAc3-3缀合物。使用Agilent 1100MSD***通过离子对HPLC偶联的MS分析来表征ASO。
表34a
靶向Malat-1的通过己基氨基磷酸二酯键联在5’位上包含GalNAc3-3缀合物的ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“5’-GalNAc3-3a”的结构在实施例39中示出。
实施例43：靶向SRB-1的5’末端处的磷酸二酯连接的GalNAc3-2(参见实施例37和41，Bx为腺嘌呤)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中，测试在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134(参见实施例41)对小鼠中SRB-1的反义抑制。未缀合的ISIS 440762和651900(3’末端处的GalNAc3-1缀合物，参见实施例9)包括在研究中用于比较并且先前描述于表17中。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 440762、651900、661134或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
如表35中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 661134)或包含连接在3’末端的GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 651900)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。此外，在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ISIS 661134与在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 651900相比效力相等。
表35
靶向SRB-1的含有GalNAc3-1或GalNAc3-2的ASO
先前在实施例9和37中描述了3’GalNAc3-1和5’GalNAc3-2的结构。
药物代谢动力学分析(PK)
如实施例20中所说明，以相同方式检验和评价来自高剂量组(7mg/kg)的ASO的PK。使用标准方案切碎并且提取肝脏样品。鉴定了661134(5’GalNAc3-2)和ISIS 651900(3’GalNAc3-1)的全长代谢物并且通过高分辨率质谱分析证实了其质量。结果显示针对在5’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-2缀合物的ASO(ISIS 661134)所检测到的主要代谢物为ISIS 440762(数据未示出)。在可检测水平下没有观察到另外的代谢物。不像其对应物，针对在3’末端具有GalNAc3-1缀合物的ASO(ISIS 651900)观察到类似于先前在表23a中报道的那些的另外的代谢物。这些结果表明具有磷酸二酯连接的GalNAc3-1或GalNAc3-2缀合物可在不损害其效力的情况下改进ASO的PK特征。
实施例44：PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物(参见实施例9)的ASO的反义抑制的影响
在单一施用研究中，针对其抑制小鼠中SRB-1的能力，对各自靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861和655862进行测试。在研究中包括母体未缀合化合物ISIS 353382用于比较。
ASO为5-10-5MOE缺口聚物，其中缺口区包含十个2’-脱氧核糖核苷并且每个翼区包含五个2’-MOE修饰核苷。使用如先前在实施例19中所说明的类似方法制备ASO并且在以下表36中描述。
表36
靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的修饰ASO
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-1”的结构在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量下，用ISIS 353382、655861、655862或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在处理之前以及在最后一次剂量之后，从每只小鼠中抽血并且分析血浆样品。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。在归一化为PBS处理的对照之前，测定相对于总RNA的SRB-1 mRNA水平(使用Ribogreen)。以下结果以归一化为PBS处理的对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下报告。
如表37中所说明，与PBS处理的对照相比，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的反义寡核苷酸(ISIS655861和655862)与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。此外，相对于全部PS(ISIS 655861)，具有混合的PS/PO键联的ISIS 655862显示出效力的改进。
表37
PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO的反义抑制的影响
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了器官重量。结果展示相比于PBS对照，在用ASO处理的小鼠中没有观察到转氨酶水平(表38)或器官重量(数据未示出)上升。此外，与全部PS(ISIS 655861)相比，具有混合的PS/PO键联的ASO(ISIS 655862)显示出类似的转氨酶水平。
表38
PO/PS键联对靶向SRB-1的在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ASO的转氨酶水平的影响
实施例45：PFP酯化合物110a的制备
单独用化合物103a或103b(38毫摩尔)和TMSOTf(0.5当量)以及二氯甲烷(200mL)中的分子筛处理化合物4(9.5g，28.8毫摩尔)，并且在室温下搅拌16小时。这时使有机层过滤通过硅藻土，然后用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到>80％产率的化合物104a和104b。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物104a和104b处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到>90％产率的化合物105a和105b。LCMS和质子NMR与结构一致。
在与对于化合物901a-d相同的条件下单独用化合物90处理化合物105a和105b，得到化合物106a(80％)和106b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物106a和106b处理至与对于化合物96a-d(实施例47)相同的条件，得到107a(60％)和107b(20％)。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物107a和107b处理至与对于化合物97a-d(实施例47)相同的条件，得到40％-60％产率的化合物108a和108b。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物108a(60％)和108b(40％)处理至与对于化合物100a-d(实施例47)相同的条件，得到>80％产率的化合物109a和109b。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物109a处理至与对于化合物101a-d(实施例47)相同的条件，得到30％-60％产率的化合物110a。LCMS和质子NMR与结构一致。或者，可以类似方式用化合物109b起始制备化合物110b。
实施例46：用于与PFP酯(寡核苷酸111)缀合的一般工序；ISIS 666881(GalNAc3-10)的制备
使用标准固相寡核苷酸工序合成并纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸。将5’-己基氨基修饰的寡核苷酸溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量的溶解于DMSO(50μL)中的所选的PFP酯化GalNAc3聚簇。如果在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，那么添加DMSO直到所有PFP酯溶解。在室温下混合约16h之后反应完全。用水将所得到的溶液稀释至12mL，然后在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。然后将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，并且在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干以提供GalNAc3缀合的寡核苷酸。
将寡核苷酸111与GalNAc3-10缀合。缀合物基团GalNAc3-10的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-10a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-，如用以下GalNAc3-10合成的寡核苷酸(ISIS666881)中所示。GalNAc3-10(GalNAc3-10a-CM-)的结构在以下示出：
根据此一般工序制备ISIS 666881。使用标准固相寡核苷酸工序合成并且纯化5’-己基氨基修饰的寡核苷酸ISIS 660254。将ISIS 660254(40mg，5.2μmol)溶解于pH 8.5的0.1M四硼酸钠(200μL)中，并且添加3当量溶解于DMSO(50μL)中的PFP酯(化合物110a)。在添加至ASO溶液时PFP酯沉淀，则需要另外的DMSO(600μL)来完全溶解PFP酯。在室温下混合16h之后反应完全。用水将溶液稀释至12mL总体积，并且在具有3000Da的质量截留的旋转过滤器中在3000rpm下离心沉降。将此过程重复两次以去除小分子杂质。将溶液冻干至干燥并且重新溶解于浓氨水中，同时在室温下混合2.5h，接着在真空中浓缩以去除大部分氨。通过RP-HPLC将缀合的寡核苷酸纯化和脱盐并且将其冻干，得到90重量％产率的ISIS 666881(42mg，4.7μmol)。
GalNAc3-10缀合的寡核苷酸
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
实施例47：制备包含GalNAc3-8的寡核苷酸102
将三元酸90(4g，14.43mmol)溶解于DMF(120mL)和N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(8.9mL，52毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。连同N,N-二异丙基乙胺(12.35mL，72毫摩尔)一起添加Boc-二胺91a或91b(68.87mmol)，并且使反应物在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->10％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物92a和92b。LCMS和质子NMR与结构一致。
在室温下用20mL二氯甲烷和20mL三氟乙酸将化合物92a或92b(6.7毫摩尔)处理16小时。蒸发所得到的溶液，然后溶解于甲醇中，并且用DOWEX-OH树脂处理30分钟。过滤所得到的溶液并且在减压下缩减至油状物，得到85％-90％产率的化合物93a和93b。
将化合物7或64(9.6毫摩尔)在DMF(20mL)中用HBTU(3.7g，9.6毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(5mL)处理15分钟。向其中添加化合物93a或93b(3毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到20％-40％产率的化合物96a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
在乙醇(75mL)中通过雷尼镍单独地将化合物96a-d(0.75毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除乙醇，得到80％-90％产率的化合物97a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物23(0.32g，0.53毫摩尔)在DMF(30mL)中用HBTU(0.2g，0.53毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.19mL，1.14毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.38毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到30％-40％产率的化合物98a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
将化合物99(0.17g，0.76毫摩尔)在DMF(50mL)中用HBTU(0.29g，0.76毫摩尔)和N,N-二异丙基乙胺(0.35mL，2.0毫摩尔)处理15分钟。单独地向其中添加化合物97a-d(0.51毫摩尔)，并且使其在室温下搅拌16小时。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(5％-->20％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到40％-60％产率的化合物100a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
单独地在甲醇/乙酸乙酯(1:1，50mL)中通过10％Pd(OH)2/C将化合物100a-d(0.16毫摩尔)氢化3小时。这时通过过滤通过硅藻土来去除催化剂并且在减压下去除有机物，得到80％-90％产率的化合物101a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
单独地将化合物101a-d(0.15毫摩尔)溶解于DMF(15mL)和吡啶(0.016mL，0.2毫摩尔)中。在氩气下逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(0.034mL，0.2毫摩尔)，并且使反应物在室温下搅拌30分钟。这时在减压下使DMF缩减>75％，然后将混合物溶解于二氯甲烷中。将有机层用碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层分离并且通过硫酸钠干燥，过滤并且在减压下缩减至油状物。通过硅胶色谱法(2％-->5％甲醇/二氯甲烷)纯化所得到的油状物，得到大约80％产率的化合物102a-d。LCMS和质子NMR与结构一致。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-8缀合物基团的低聚化合物102。缀合物基团GalNAc3-8的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-8a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在优选的实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-8(GalNAc3-8a-CM-)的结构在以下示出：
实施例48：制备包含GalNAc3-7的寡核苷酸119
根据文献中描述的工序合成化合物112(J.Med.Chem.2004,47,5798-5808)。
将化合物112(5g，8.6mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(22mL/22mL)中。添加碳上氢氧化钯(0.5g)。将此反应混合物在室温下在氢气下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用1:1甲醇/乙酸乙酯洗涤所述垫。合并滤液和洗涤物并且浓缩至干燥，得到化合物105a(定量的)。通过LCMS证实结构。
将化合物113(1.25g，2.7mmol)、HBTU(3.2g，8.4mmol)和DIEA(2.8mL，16.2mmol)溶解于无水DMF(17mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。添加该化合物105a(3.77g，8.4mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。将反应在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂以得到油。将残余物溶解于CH2Cl2(100mL)中并且用饱和NaHCO3水溶液(100mL)和盐水(100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用10％至20％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物114(1.45g，30％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物114(1.43g，0.8mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(4mL/4mL)中。添加钯碳(湿润，0.14g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物115(定量的)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物83a(0.17g，0.75mmol)、HBTU(0.31g，0.83mmol)和DIEA(0.26mL，1.5mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且将反应混合物在室温下搅拌5min。添加该化合物115(1.22g，0.75mmol)在无水DMF中的溶液，并且将反应在室温下搅拌6h。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CH2Cl2中。将有机层用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥并且过滤。将有机层浓缩至干燥，并且通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用3％至15％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物116(0.84g，61％)。通过LC MS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物116(0.74g，0.4mmol)溶解于1:1甲醇/乙酸乙酯(5mL/5mL)中。添加钯碳(湿润，0.074g)。用氢气冲洗反应混合物并且在氢气下在室温下搅拌12h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤。用甲醇/乙酸乙酯(1:1)洗涤硅藻土垫。将滤液和洗涤物合并在一起并且在减压下蒸发，得到化合物117(0.73g，98％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。
将化合物117(0.63g，0.36mmol)溶解于无水DMF(3mL)中。向此溶液中添加N,N-二异丙基乙胺(70μL，0.4mmol)和三氟乙酸五氟苯基酯(72μL，0.42mmol)。将反应混合物在室温下搅拌12h并且倾入到饱和NaHCO3水溶液中。将混合物用二氯甲烷萃取，用盐水洗涤并且通过无水Na2SO4干燥。将二氯甲烷溶液浓缩至干燥并且用硅胶柱色谱法纯化并且用5％至10％的二氯甲烷中的MeOH洗脱，得到化合物118(0.51g，79％)。通过LCMS以及1H与1H和19FNMR证实结构。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-7缀合物基团的低聚化合物119。缀合物基团GalNAc3-7的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-7a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-7(GalNAc3-7a-CM-)的结构在以下示出：
实施例49：制备包含GalNAc3-5的寡核苷酸132
将化合物120(14.01g，40mmol)和HBTU(14.06g，37mmol)溶解于无水DMF(80mL)中。添加三乙胺(11.2mL，80.35mmol)并且搅拌5min。在冰浴中冷却反应混合物并且添加化合物121(10g，mmol)在无水DMF(20mL)中的溶液。添加另外的三乙胺(4.5mL，32.28mmol)并且将反应混合物在氩气气氛下搅拌18h。通过TLC(乙酸乙酯:己烷；1:1；Rf＝0.47)监测反应。在减压下移除溶剂。将残余物吸收于EtOAc(300mL)中并且用1M NaHSO4(3x150mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x150mL)和盐水(2x100mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层。通过过滤去除干燥剂并且通过旋转蒸发浓缩有机层。通过硅胶柱色谱法纯化粗混合物并且通过使用35％–50％的己烷中的EtOAc洗脱，得到化合物122(15.50g，78.13％)。通过LCMS和1H NMR分析来证实结构。质量m/z 589.3[M+H]+。
将LiOH(92.15mmol)在水(20mL)和THF(10mL)中的溶液添加至溶解于甲醇(15mL)中的化合物122(7.75g，13.16mmol)的冷却溶液中。将反应混合物在室温下搅拌45min并且通过TLC(EtOAc:己烷；1:1)监测。在减压下将反应混合物浓缩至一半体积。在冰浴中冷却剩余的溶液并且通过添加浓HCl来中和。将反应混合物稀释，用EtOAc(120mL)萃取并且用盐水洗涤(100mL)。当静置过夜时形成乳液并且澄清。将有机层分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发，得到化合物123(8.42g)。残余的盐可能为质量过量的原因。LCMS与结构一致。产物无需任何进一步纯化即使用。计算的分子量：574.36；实测的分子量：575.3[M+H]+。
根据文献中描述的工序合成化合物126(J.Am.Chem.Soc.2011,133,958-963)。
将化合物123(7.419g，12.91mmol)、HOBt(3.49g，25.82mmol)和化合物126(6.33g，16.14mmol)溶解于DMF(40mL)中，并且在冰浴中冷却所得到的反应混合物。在氩气气氛下，向其中添加N,N-二异丙基乙胺(4.42mL，25.82mmol)、PyBop(8.7g，16.7mmol)，接着添加Bop偶联试剂(1.17g，2.66mmol)。去除冰浴并且使溶液升温至室温。在1h后反应完成，如通过TLC(DCM:MeOH:AA；89:10:1)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于EtOAc(200mL)中并且用1M NaHSO4(3x100mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x100mL)和盐水(2x100mL)洗涤。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法用50％己烷/EtOAC至100％EtOAc梯度纯化残余物，得到呈白色泡沫的化合物127(9.4g)。LCMS和1H NMR与结构一致。质量m/z 778.4[M+H]+。
将三氟乙酸(12mL)添加至化合物127(1.57g，2.02mmol)在二氯甲烷(12mL)中的溶液中，并且在室温下搅拌1h。将反应混合物与甲苯(30mL)在减压条件下共蒸发至干燥。使所获得的残余物与乙腈(30mL)和甲苯(40mL)共蒸发两次，得到呈三氟乙酸盐的化合物128(1.67g)并且无需进一步纯化即用于下一步。LCMS和1H NMR与结构一致。质量m/z 478.2[M+H]+。
将化合物7(0.43g，0.963mmol)、HATU(0.35g，0.91mmol)和HOAt(0.035g，0.26mmol)合并在一起并且在圆底烧瓶中在减压下通过P2O5干燥4h，然后溶解于无水DMF(1mL)中并且搅拌5min。添加该化合物128(0.20g，0.26mmol)在无水DMF(0.2mL)和N,N-二异丙基乙胺(0.2mL)中的溶液。在氩气气氛下在室温下搅拌反应混合物。在30min之后反应完全，如通过LCMS和TLC(7％MeOH/DCM)所测定的。在减压下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM(30mL)中并且用1M NaHSO4(3x20mL)、饱和NaHCO3水溶液(3x20mL)和盐水(3x20mL)洗涤。将有机相分离、用Na2SO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法使用5％-15％的二氯甲烷中的MeOH来纯化残余物，得到化合物129(96.6mg)。LC MS和1H NMR与结构一致。质量m/z883.4[M+2H]+。
在20mL闪烁瓶中将化合物129(0.09g，0.051mmol)溶解于甲醇(5mL)中。向其中添加少量的10％Pd/C(0.015mg)并且用H2气体冲洗反应容器。将此反应混合物在室温下在H2气氛下搅拌18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用甲醇洗涤硅藻土垫。将滤液洗涤物汇集在一起并且在减压下浓缩，得到化合物130(0.08g)。LCMS和1H NMR与结构一致。产物未进行进一步纯化即使用。质量m/z 838.3[M+2H]+。
向10mL刻度的圆底烧瓶中添加化合物130(75.8mg，0.046mmol)、0.37M吡啶/DMF(200μL)和搅拌棒。在搅拌的情况下向此溶液中逐滴添加0.7M三氟乙酸五氟苯基酯/DMF(100μL)。在1h后反应完成，如通过LC MS所测定的。在减压下去除溶剂并且将残余物溶解于CHCl3(大约10mL)中。将有机层用NaHSO4(1M，10mL)、饱和NaHCO3水溶液(10mL)和盐水(10mL)各分配三次。将有机相分离并且通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩，得到化合物131(77.7mg)。LCMS与结构一致。无需进一步纯化即使用。质量m/z 921.3[M+2H]+。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-5缀合物基团的低聚化合物132。缀合物基团GalNAc3-5的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-5a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-5(GalNAc3-5a-CM-)的结构在以下示出：
实施例50：制备包含GalNAc4-11的寡核苷酸144
化合物134的合成。向Merrifield烧瓶中添加用乙腈、二甲基甲酰胺、二氯甲烷和乙腈洗涤的氨甲基VIMAD树脂(2.5g，450μmol/g)。树脂在乙腈(4mL)中溶胀。通过添加20(1.0mmol，0.747g)、TBTU(1.0mmol,0.321g)、乙腈(5mL)和DIEA(3.0mmol，0.5mL)将化合物133在100mL圆底烧瓶中预先活化。使此溶液搅拌5min，然后在振荡的情况下添加至Merrifield烧瓶。使悬浮液震荡3h。排出反应混合物并且用乙腈、DMF和DCM洗涤树脂。通过测量DCM中的DMT阳离子在500nm(消光系数＝76000)处的吸光度来定量新树脂负载量并且测定为238μmol/g。通过悬浮于乙酸酐溶液中持续十分钟，进行三次，来将树脂加帽。
使用反复基于Fmoc(iterative Fmoc-based)的固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物141。拆下少量的固体载体并且将其悬浮于氨水(28-30重量％)中6h。通过LC-MS分析裂解的化合物并且所观察到的质量与结构一致。质量m/z 1063.8[M+2H]+。
使用固相肽合成方法来合成固体载体结合的化合物142。
在DNA合成器上使用标准固相合成来合成固体载体结合的化合物143。
将固体载体结合的化合物143悬浮于氨水(28-30重量％)中并且在55℃下加热16h。将溶液冷却并且过滤固体载体。浓缩滤液，将残余物溶解于水中并且通过HPLC在强阴离子交换柱上纯化。将含有全长化合物144的级分汇集在一起并且脱盐。通过LC-MS分析所得到的GalNAc4-11缀合的低聚化合物并且所观察到的质量与结构一致。
缀合物基团GalNAc4-11的GalNAc4聚簇部分(GalNAc4-11a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc4-11(GalNAc4-11a-CM)的结构在以下示出：
实施例51：制备包含GalNAc3-6的寡核苷酸155
如文献中所描述来合成化合物146(Analytical Biochemistry 1995,229,54-60)。
将化合物4(15g，45.55mmol)和化合物35b(14.3克，57mmol)溶解于CH2Cl2(200ml)中。添加活化的分子筛(2g，粉末状)，并且使反应物在氮气气氛下搅拌30分钟。添加TMS-OTf(4.1ml，22.77mmol)并且使反应物在室温下搅拌过夜。当完成时，通过倾入到饱和NaHCO3水溶液(500ml)和碎冰(大约150g)的溶液中来猝灭反应。将有机层分离、用盐水洗涤、通过MgSO4干燥、过滤并且在减压下浓缩至橙色油状物。通过硅胶柱色谱法纯化粗材料并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物112(16.53g，63％)。LCMS和1H NMR与预期的化合物一致。
将化合物112(4.27g，7.35mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(40ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯，400mg)，并且使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的CH2Cl2中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液，并且在高真空下简单干燥以得到化合物105a(3.28g)。LCMS和1H NMR与希望的产物一致。
将化合物147(2.31g，11mmol)溶解于无水DMF(100mL)中。添加N,N-二异丙基乙胺(DIEA，3.9mL，22mmol)，接着添加HBTU(4g，10.5mmol)。使反应混合物在氮气下搅拌大约15分钟。向其中添加化合物105a(3.3g，7.4mmol)在干燥DMF中的溶液并且在氮气气氛下搅拌2h。将反应物用EtOAc稀释并且用饱和NaHCO3水溶液和盐水洗涤。将有机相分离、干燥(MgSO4)、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法2％-5％的CH2Cl2中的MeOH来纯化粗材料，得到化合物148(3.44g，73％)。LCMS和1H NMR与预期的产物一致。
将化合物148(3.3g，5.2mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(75ml)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(350mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤通过硅藻土垫来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物149(2.6g)。LCMS与希望的产物一致。将残余物溶解于干燥DMF(10ml)中，其立即用于下一步。
将化合物146(0.68g，1.73mmol)溶解于干燥DMF(20ml)中。向其中添加DIEA(450μL，2.6mmol，1.5当量)和HBTU(1.96g，0.5.2mmol)。使反应混合物在氮气下在室温下搅拌15分钟。添加化合物149(2.6g)在无水DMF(10mL)中的溶液。通过添加DIEA(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。使反应在室温下在氮气下搅拌2h。在完成时，将反应物用EtOAc(100mL)稀释，并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤、接着用盐水洗涤。将有机相分离、用MgSO4干燥、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物150(0.62g，20％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
将化合物150(0.62g)溶解于1:1MeOH/EtOAc(5L)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(60mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物151(0.57g)。LCMS与希望的产物一致。将产物溶解于4mL干燥DMF中并且立即用于下一步。
将化合物83a(0.11g，0.33mmol)溶解于无水DMF(5mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(75μL，1mmol)和PFP-TFA(90μL，0.76mmol)。当接触时反应混合物变为洋红色，并且在接下来的30分钟里逐渐变为橙色。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时(形成PFP酯)，添加化合物151(0.57g，0.33mmol)在DMF中的溶液。通过添加N,N-二异丙基乙胺(如果必要的话)将反应物的pH调节至pH＝9-10。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2稀释残余物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机相分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过硅胶柱色谱法(2％-10％的CH2Cl2中的MeOH)纯化残余物，得到化合物152(0.35g，55％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
将化合物152(0.35g，0.182mmol)溶解于1:1MeOH/EtOAc(10mL)中。通过使氩气流鼓泡穿过溶液15分钟来吹扫反应混合物。添加Pearlman氏催化剂(碳上氢氧化钯)(35mg)。使氢气鼓泡穿过溶液30分钟。在完成时(TLC 10％的DCM中的MeOH和LCMS)，通过过滤(注射器针头式特氟龙过滤器，0.45μm)来去除催化剂。通过旋转蒸发来浓缩滤液并且将其在高真空下简单干燥，得到化合物153(0.33g，定量的)。LCMS与希望的产物一致。
在氮气下搅拌的情况下，将化合物153(0.33g，0.18mmol)溶解于无水DMF(5mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(65μL，0.37mmol)和PFP-TFA(35μL，0.28mmol)。将反应混合物在氮气下搅拌大约30min。当接触时反应混合物变为洋红色，并且逐渐变为橙色。通过添加更多的N,-二异丙基乙胺将反应混合物的pH维持在pH＝9-10。通过TLC和LCMS监测反应的进展。当完成时，在减压下去除大部分溶剂。用CH2Cl2(50mL)稀释残余物并且用饱和NaHCO3水溶液洗涤，接着用盐水洗涤。将有机层分离、通过MgSO4干燥、过滤并且浓缩至橙色浆状物。通过柱色谱法纯化残余物并且用2％-10％的CH2Cl2中的MeOH洗脱，得到化合物154(0.29g，79％)。LCMS和1H NMR与所需的产物一致。
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-6缀合物基团的低聚化合物155。缀合物基团GalNAc3-6的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-6a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。
GalNAc3-6(GalNAc3-6a-CM-)的结构在以下示出：
实施例52：制备包含GalNAc3-9的寡核苷酸160
根据文献中描述的工序合成化合物156(J.Med.Chem.2004,47,5798-5808)。
将化合物156(18.60g，29.28mmol)溶解于甲醇(200mL)中。添加钯碳(6.15g，10重量％，负载量(干基)，基质碳粉，湿润)。将此反应混合物在室温下在氢气下搅拌18h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且用甲醇彻底洗涤硅藻土垫。洗涤合并的滤液并且浓缩至干燥。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用5％-10％的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物157(14.26g，89％)。质量m/z 544.1[M-H]-。
将化合物157(5g，9.17mmol)溶解于无水DMF(30mL)中。添加HBTU(3.65g，9.61mmol)和N,N-二异丙基乙胺(13.73mL，78.81mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌5分钟。向其中添加化合物47(2.96g，7.04mmol)的溶液。将反应在室温下搅拌8h。将反应混合物倾入到饱和NaHCO3水溶液中。用乙酸乙酯萃取混合物，并且将有机层用盐水洗涤并干燥(Na2SO4)、过滤和蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化所获得的残余物并且用50％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物158(8.25g，73.3％)。通过MS和1H NMR分析来证实结构。
在减压下通过P2O5干燥化合物158(7.2g，7.61mmol)。将干燥的化合物溶解于无水DMF(50mL)中。向其中添加1H-四唑(0.43g，6.09mmol)和N-甲基咪唑(0.3mL，3.81mmol)以及2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基二氨基磷酸酯(3.65mL，11.50mmol)。将反应混合物在氩气气氛下搅拌4h。将反应混合物用乙酸乙酯(200mL)稀释。用饱和NaHCO3和盐水洗涤反应混合物。将有机相分离、干燥(Na2SO4)、过滤并且蒸发。通过硅胶柱色谱法纯化残余物并且用50％-90％的己烷中的乙酸乙酯洗脱，得到化合物159(7.82g，80.5％)。通过LCMS和31P NMR分析来证实结构。
使用标准寡核苷酸合成工序制备包含GalNAc3-9缀合物基团的低聚化合物160。将化合物159的三个单元偶联至固体载体，接着偶联核苷酸亚磷酰胺。用氨水处理受保护的低聚化合物得到化合物160。缀合物基团GalNAc3-9的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-9a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-9(GalNAc3-9a-CM)的结构在以下示出：
实施例53：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
使内酯161与二氨基丙烷(3-5当量)或单-Boc保护的二氨基丙烷(1当量)反应，以提供醇162a或162b。当未受保护的丙二胺用于上述反应时，通过在高真空下蒸发来去除过量的二胺并且使用CbzCl保护162a中的游离氨基，以在通过柱色谱法纯化之后提供呈白色固体的162b。在TMSOTf的存在下，使醇162b与化合物4进一步反应，以提供163a，所述163a通过使用催化氢化去除Cbz基团而转化为163b。通过使三元酸113(参见实施例48)与DMF(0.1M至0.5M)中的PFPTFA(3.5当量)和吡啶(3.5当量)反应来制备五氟苯基(PFP)酯164。使三酯164与胺163b(3-4当量)和DIPEA(3-4当量)直接反应，以提供化合物18。以上方法极大地促进中间体的纯化并且使副产物的形成最小化，所述副产物使用实施例4中描述的工序形成。
实施例54：用于制备化合物18(GalNAc3-1a和GalNAc3-3a)的替代工序
使用实施例53中概述的工序由酸113制备三PFP酯164并且使其与单-Boc保护的二胺反应，以提供基本上定量产率的165。用盐酸或三氟乙酸去除Boc基团以提供三胺，所述三胺在合适的碱如DIPEA的存在下与PFP活化的酸166反应，以提供化合物18。
通过用DMF中的PFPTFA(1-1.2当量)和吡啶(1-1.2当量)处理来由对应的酸制备PFP保护的Gal-NAc酸166。继而通过使用乙腈和水中的TEMPO(0.2当量)和BAIB的氧化来由对应的醇制备前体酸。使用先前在实施例47中描述的条件，通过与1,6-己二醇(或1,5-戊二醇或对于其他n值的其他二元醇)(2-4当量)和TMSOTf反应来由糖中间体4制备前体醇。
实施例55：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、3、8以及9)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
表39
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-9的结构先前在实施例52中示出。GalNAc3-3的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-8的结构先前在实施例47中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664078、661161、665001或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表40中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和GalNAc3-9缀合物的反义寡核苷酸(ISIS655861和ISIS 664078)和包含连接在5’末端的GalNAc3-3和GalNAc3-8缀合物的反义寡核苷酸(ISIS 661161和ISIS 665001)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。此外，在3'末端包含GalNAc3-9缀合物的ISIS 664078与在3’末端包含GalNAc3-1缀合物的ISIS 655861相比基本上效力相等。分别包含GalNAc3-3或GalNAc3-9的5'缀合的反义寡核苷酸ISIS 661161和ISIS 665001与3'缀合的反义寡核苷酸(ISIS 655861和ISIS664078)相比具有增加的效力。
表40
靶向SRB-1的含有GalNAc3-1、3、8或9的ASO
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
表41
实施例56：靶向SRB-1的包含3'-缀合物基团或5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1、2、3、5、6、7以及10)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。各种GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处，具有连接在3’末端处的GalNAc3缀合物基团的ISIS 655861除外。
表42
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-2a的结构先前在实施例37中示出。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-5a的结构先前在实施例49中示出。GalNAc3-6a的结构先前在实施例51中示出。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构先前在实施例46中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、655861、664507、661161、666224、666961、666981、666881或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,BarHarbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表43中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。事实上，缀合反义寡核苷酸与未缀合反义寡核苷酸(ISIS 353382)相比显示出效力的大致改进。5'缀合的反义寡核苷酸与3'缀合的反义寡核苷酸相比显示出效力稍微增加。
表43
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表44中示出。
表44
实施例57：靶向ApoC III的包含3'-缀合物基团的寡核苷酸的体内作用持续时间研究
用以下指示的剂量注射小鼠一次并且经过42天的过程监测ApoC-III和血浆甘油三酯(血浆TG)水平。在每个组中使用3只表达人APOC-III的转基因小鼠进行研究。
表45
靶向ApoC III的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
表46
ApoC III mRNA(第1天时的％盐水)和血浆TG水平(第1天时的％盐水)
如上表中可看出，与未缀合寡核苷酸相比，作用持续时间随着3'-缀合物基团的添加而增加。与缀合的全部PS寡核苷酸647535相比，对于缀合的混合PO/PS寡核苷酸647536存在作用持续时间的进一步增加。
实施例58：靶向SRB-1的包含3’-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-1和GalNAc4-11)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 440762作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-11a的结构先前在实施例50中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 440762、651900、663748或用盐水皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表47中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。在3’末端包含磷酸二酯连接的GalNAc3-1和GalNAc4-11缀合物的反义寡核苷酸(ISIS651900和ISIS 663748)与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 440762)相比显示出效力的大致改进。两种缀合寡核苷酸GalNAc3-1和GalNAc4-11效力相等。
表47
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表48中示出。
表48
实施例59：靶向FXI的GalNAc3-1缀合的ASO的体内作用
在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的FXI的反义抑制。包括ISIS404071作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'末端处。
表49
靶向FXI的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 404071、656172、656173或用PBS处理的对照皮下注射六周龄雄性Balb/c小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)，一周两次，持续3周。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏FXI mRNA水平。还使用ELISA测量了血浆FXI蛋白水平。在归一化为PBS处理的对照之前，确定相对于总RNA的FXI mRNA水平(使用)。以下结果以每个处理组的FXImRNA水平的平均百分比呈现。将数据归一化为PBS处理的对照并且表示为“％PBS”。使用如先前所述的类似方法测量ED50并且在以下呈现。
表50
因子XI mRNA(％盐水)
如表50中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI mRNA水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS 656173)来进一步提供效力改进。
如表50a中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低FXI蛋白水平。包含3'-GalNAc3-1缀合物基团的寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 404071)相比显示出效力的大致改进。在两种缀合寡核苷酸之间，通过用PO取代一些PS键联(ISIS 656173)来进一步提供效力改进。
表50a
因子XI蛋白(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素、总白蛋白、CRE和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化。ALT、AST、总胆红素和BUN值在下表中示出。
表51
实施例60：靶向SRB-1的缀合ASO的体外作用
在多剂量研究中测试以下列出的寡核苷酸对原代小鼠肝细胞中的SRB-1的反义抑制。包括ISIS 353382作为未缀合标准物。缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷可裂解部分连接在相应寡核苷酸的3'或5'末端处。
表52
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-8a的结构先前在实施例47中示出。GalNAc3-9a的结构先前在实施例52中示出。GalNAc3-6a的结构先前在实施例51中示出。GalNAc3-2a的结构先前在实施例37中示出。GalNAc3-10a的结构先前在实施例46中示出。GalNAc3-5a的结构先前在实施例49中示出。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
在体外在小鼠原代肝细胞中测试以上列出的寡核苷酸，所述小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度涂布并且用0.03、0.08、0.24、0.74、2.22、6.67或20nM修饰寡核苷酸处理。在大约16小时的处理期之后，从细胞中分离RNA并且通过定量实时PCR测量mRNA水平并且如通过所测量，根据总RNA含量调节SRB-1 mRNA水平。
使用标准方法计算IC50并且结果呈现于表53中。结果显示，在其中没有使用试剂或电穿孔技术来人工促进寡核苷酸进入到细胞中的自由摄取条件下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 353382)在肝细胞中显著更有效。
表53
ASO IC50(nM) 核苷间键联 缀合物 SEQ ID No.
ISIS 353382 190a PS 无 2256
ISIS 655861 11a PS GalNAc3-1 2257
ISIS 655862 3 PO/PS GalNAc3-1 2257
ISIS 661161 15a PS GalNAc3-3 2258
ISIS 665001 20 PS GalNAc3-8 2258
ISIS 664078 55 PS GalNAc3-9 2257
ISIS 666961 22a PS GalNAc3-6 2258
ISIS 664507 30 PS GalNAc3-2 2258
ISIS 666881 30 PS GalNAc3-10 2258
ISIS 666224 30a PS GalNAc3-5 2258
ISIS 666981 40 PS GalNAc3-7 2258
a多次运行的平均值。
实施例61：制备包含GalNAc3-12的低聚化合物175
化合物169为商业上可获得的。通过向化合物171添加苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯来制备化合物172。通过向DMF中的5-(苯甲氧基)-5-氧戊酸添加PFP-TFA和DIEA来制备苯甲基(全氟苯基)戊二酸酯。使用实施例46中说明的一般工序从化合物174制备包含GalNAc3-12缀合物基团的低聚化合物175。缀合物基团GalNAc3-12的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-12a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某一实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-12(GalNAc3-12a-CM-)的结构在以下示出：
实施例62：制备包含GalNAc3-13的低聚化合物180
使用实施例2中示出的一般工序制备化合物176。使用实施例49中说明的一般工序从化合物177制备包含GalNAc3-13缀合物基团的低聚化合物180。缀合物基团GalNAc3-13的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-13a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某一实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-13(GalNAc3-13a-CM-)的结构在以下示出：
实施例63：制备包含GalNAc3-14的低聚化合物188
化合物181和185为商业上可获得的。使用实施例46中说明的一般工序从化合物187制备包含GalNAc3-14缀合物基团的低聚化合物188。缀合物基团GalNAc3-14的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-14a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-14(GalNAc3-14a-CM-)的结构在以下示出：
实施例64：制备包含GalNAc3-15的低聚化合物197
化合物189为商业上可获得的。使用实施例31中示出的一般工序制备化合物195。使用标准寡核苷酸合成工序由化合物194和195制备包含GalNAc3-15缀合物基团的低聚化合物197。缀合物基团GalNAc3-15的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-15a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-15(GalNAc3-15a-CM-)的结构在以下示出：
实施例65：靶向SRB-1的包含5'-缀合物基团的寡核苷酸(比较GalNAc3-3、12、13、14以及15)的体内剂量依赖性研究
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。包括未缀合的ISIS 353382作为标准物。将GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的2'-脱氧腺苷核苷(可裂解部分)连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表54
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-12a的结构先前在实施例61中示出。GalNAc3-13a的结构先前在实施例62中示出。GalNAc3-14a的结构先前在实施例63中示出。GalNAc3-15a的结构先前在实施例64中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 353382、661161、671144、670061、671261、671262或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次或两次。给药两次的小鼠在第一次剂量之后三天接受第二次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表55中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。在接受单一剂量的动物与接受两次剂量的动物之间没有观察到靶敲除的显著差异(参见ISIS 353382剂量30mg/kg和2x15mg/kg；以及ISIS 661161剂量5mg/kg和2x2.5mg/kg)。包含磷酸二酯连接的GalNAc3-3、12、13、14以及15缀合物的反义寡核苷酸与未缀合的反义寡核苷酸(ISIS 335382)相比显示出效力的大致改进。
表55
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。
表56
实施例66：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3聚簇的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均通过磷酸二酯连接的核苷(可裂解部分(CM))连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表57
靶向SRB-1的修饰ASO
大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-13a的结构先前在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量下用ISIS 661161、670699、670700、670701、671165或用盐水皮下注射六至八周龄C57bl6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死，以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定肝脏SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表58中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。包含各种可裂解部分的反义寡核苷酸均显示出类似的效力。
表58
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著差异(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表56中示出。
表59
实施例67：制备包含GalNAc3-16的低聚化合物199
使用实施例7和9中说明的一般工序制备包含GalNAc3-16缀合物基团的低聚化合物199。缀合物基团GalNAc3-16的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-16a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-16(GalNAc3-16a-CM-)的结构在以下示出：
实施例68：制备包含GalNAc3-17的低聚化合物200
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-17缀合物基团的低聚化合物200。缀合物基团GalNAc3-17的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-17a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-17(GalNAc3-17a-CM-)的结构在以下示出：
实施例69：制备包含GalNAc3-18的低聚化合物201
使用实施例46中说明的一般工序制备包含GalNAc3-18缀合物基团的低聚化合物201。缀合物基团GalNAc3-18的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-18a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-18(GalNAc3-18a-CM-)的结构在以下示出：
实施例70：制备包含GalNAc3-19的低聚化合物204
使用实施例52中说明的一般工序从化合物64制备包含GalNAc3-19缀合物基团的低聚化合物204。缀合物基团GalNAc3-19的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-19a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-19(GalNAc3-19a-CM-)的结构在以下示出：
实施例71：制备包含GalNAc3-20的低聚化合物210
通过将PFP-TFA和DIEA添加至乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸来制备化合物205，所述乙腈中的6-(2,2,2-三氟乙酰氨基)己酸通过将三氟甲磺酸酐添加至6-氨基己酸来制备。将反应混合物加热至80℃，然后降低至室温。使用实施例52中说明的一般工序从化合物208制备包含GalNAc3-20缀合物基团的低聚化合物210。缀合物基团GalNAc3-20的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-20a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-20(GalNAc3-20a-CM-)的结构在以下示出：
实施例72：制备包含GalNAc3-21的低聚化合物215
化合物211为商业上可获得的。使用实施例52中说明的一般工序从化合物213制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物215。缀合物基团GalNAc3-21的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-21a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-21(GalNAc3-21a-CM-)的结构在以下示出：
实施例73：制备包含GalNAc3-22的低聚化合物221
使用二异丙基铵四唑由化合物219制备化合物220。使用实施例52中说明的一般工序从化合物220制备包含GalNAc3-21缀合物基团的低聚化合物221。缀合物基团GalNAc3-22的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-22a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，可裂解部分为-P(＝O)(OH)-Ad-P(＝O)(OH)-。GalNAc3-22(GalNAc3-22a-CM-)的结构在以下示出：
实施例74：各种可裂解部分对通过包含5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制的影响
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。GalNAc3缀合物基团中的每一个均连接在相应寡核苷酸的5'末端处。
表60
靶向SRB-1的修饰ASO
在所有表格中，大写字母指示每个核苷的核碱基并且mC指示5-甲基胞嘧啶。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o’”指示-O-P(＝O)(OH)-。缀合物基团以粗体表示。
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出。GalNAc3-17a的结构先前在实施例68中示出，并且GalNAc3-18a的结构在实施例69中示出。
处理
在以下示出的剂量下用列于表60中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1 mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表61中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸显示出类似的效力并且比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表61
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，相对于盐水注射的小鼠测量血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表62中示出。
表62
实施例75：包含5’-缀合物基团的寡核苷酸的药物代谢动力学分析
使用根据实施例65、66和74中描述的处理工序所获得的肝脏样品来评价以上表54、57和60中的ASO的PK。使用标准方案切碎并提取肝脏样品并且与内标物一起通过IP-HPLC-MS进行分析。通过对适当的UV峰进行积分，测量组合组织水平(μg/g)并且使用适当的提取离子色谱图(EIC)测量全长ASO缺失缀合物(“母体”，在该情况下的Isis No.为353382)的组织水平。
表63
肝脏中的PK分析
以上表63中的结果显示，在寡核苷酸施用之后72小时，尤其当考虑到具有与不具有GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸之间的给药差异时，包含GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏组织水平比不包含GalNAc3缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 353382)更高。此外，至72小时，40％-98％的包含GalNAc3缀合物基团的每个寡核苷酸代谢为母体化合物，表明GalNAc3缀合物基团从寡核苷酸上裂解。
实施例76：制备包含GalNAc3-23的低聚化合物230
化合物222为商业上可获得的。将44.48ml(0.33mol)的化合物222用吡啶(500mL)中的甲苯磺酰氯(25.39g，0.13mol)处理16小时。然后将反应物蒸发至油状物，溶解于EtOAc中并且用水、饱和NaHCO3、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将乙酸乙酯浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用EtOAc/己烷(1:1)洗脱，接着用10％的CH2Cl2中的甲醇洗脱，得到呈无色油状物的化合物223。LCMS和NMR与结构一致。在室温下将10g(32.86mmol)的1-甲苯磺酰基三甘醇(化合物223)用DMSO(100mL)中的叠氮化钠(10.68g，164.28mmol)处理17小时。然后将反应混合物倾倒在水上，并且用EtOAc萃取。将有机层用水洗涤三次并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥，得到5.3g的化合物224(92％)。LCMS和NMR与结构一致。在惰性气氛下用4A分子筛(5g)和二氯甲烷(100mL)中的TMSOTf(1.65ml，9.11mmol)处理1-叠氮基三甘醇(化合物224，5.53g，23.69mmol)和化合物4(6g，18.22mmol)。在14小时之后，过滤反应物以去除分子筛，并且将有机层用饱和NaHCO3、水、盐水洗涤，并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至4％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物225。LCMS和NMR与结构一致。通过Pearlman氏催化剂在EtOAc/甲醇(4:1，250mL)中氢化化合物225(11.9g，23.59mmol)。在8小时之后，通过过滤去除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到化合物226。LCMS和NMR与结构一致。
为了生成化合物227，用五氟三氟乙酸酯(9.05ml，52.65mmol)逐滴处理硝基甲烷三丙酸(4.17g，15.04mmol)和Hunig氏碱(10.3ml，60.17mmol)在DMF(100mL)中的溶液。在30分钟之后，将反应物倾倒在冰水上并且用EtOAc萃取。将有机层用水、盐水洗涤并且通过Na2SO4干燥。将有机层浓缩至干燥并且然后从庚烷中重结晶，得到呈白色固体的化合物227。LCMS和NMR与结构一致。将化合物227(1.5g，1.93mmol)和化合物226(3.7g，7.74mmol)在室温下在乙腈(15mL)中搅拌2小时。然后将反应物蒸发至干燥并且通过柱色谱法纯化，用2％至10％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到化合物228。LCMS和NMR与结构一致。在氢气气氛中，用乙醇(100mL)中的雷尼镍(约2g湿润)处理化合物228(1.7g，1.02mmol)。在12小时之后，通过过滤去除催化剂并且将有机层蒸发至固体，所述固体直接用于下一步。LCMS和NMR与结构一致。用DMF(5mL)中的苯甲基戊二酸(0.18g，0.8mmol)、HBTU(0.3g，0.8mmol)和DIEA(273.7μl，1.6mmol)处理此固体(0.87g，0.53mmol)。在16小时之后，在减压下在65℃下去除DMF至油状物，并且将油状物溶解于二氯甲烷。将有机层用饱和NaHCO3、盐水洗涤并且通过Na2SO4干燥。在有机层蒸发之后，通过柱色谱法纯化化合物并且用2％至20％梯度的二氯甲烷中的甲醇洗脱，得到偶联的产物。LCMS和NMR与结构一致。将苯甲酯在氢气气氛下用Pearlman氏催化剂去保护，持续1小时。然后通过过滤去除催化剂并且去除溶剂至干燥，得到酸。LCMS和NMR与结构一致。将酸(486mg，0.27mmol)溶解于干燥DMF(3mL)中。添加吡啶(53.61μl，0.66mmol)并且用氩气吹扫反应物。将五氟三氟乙酸酯(46.39μl，0.4mmol)缓慢添加至反应混合物中。反应物的颜色从浅黄色变为酒红色，并且放出轻烟，所述轻烟用氩气流吹走。使反应物在室温下搅拌一小时(通过LCMS证实反应完全)。在减压(旋转蒸发仪)下在70℃下去除溶剂。将残余物用DCM稀释并且用1N NaHSO4、盐水洗涤，再次用饱和碳酸氢钠和盐水洗涤。将有机物通过Na2SO4干燥、过滤并且浓缩至干燥，得到225mg的呈易碎黄色泡沫的化合物229。LCMS和NMR与结构一致。
使用实施例46中说明的一般工序由化合物229制备包含GalNAc3-23缀合物基团的低聚化合物230。GalNAc3-23缀合物基团的GalNAc3聚簇部分(GalNAc3-23a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc3-23(GalNAc3-23a-CM)的结构在以下示出：
实施例77：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表64
靶向SRB-1的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
处理
在以下示出的剂量下用列于表64中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表65中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。
表65
SRB-1 mRNA(％盐水)
使用标准方案，还测量了血清中的肝脏转氨酶水平，即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。还评价了总胆红素和BUN。评价了体重变化，其中与盐水组相比没有显著变化(数据未示出)。ALT、AST、总胆红素和BUN值在以下表66中示出。
表66
实施例78：通过包含GalNAc3缀合物的靶向血管紧张素原的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试以下列出的寡核苷酸对血压正常的斯普拉道来大鼠中的血管紧张素原(AGT)的反义抑制。
表67
靶向AGT的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表67中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性斯普拉道来大鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将大鼠处死。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测量AGT肝脏mRNA水平。用1:20,000稀释的血浆使用总血管紧张素原ELISA(目录号JP27412,IBL International,Toronto,ON)来测量AGT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的肝脏中AGT mRNA水平或血浆中AGT蛋白水平的平均百分比呈现。
如表68中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表68
AGT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
使用标准方案，在处死时还测量了血浆中的肝脏转氨酶水平(即丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST))和体重。结果在以下表69中示出。
表69
肝脏转氨酶水平和大鼠体重
实施例79：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于以下表70中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表70
靶向APOC-III的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
用列于表70中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的六至八周龄转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后72小时、1周、2周、3周、4周、5周和6周时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现，表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出比不具有缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS 304801)更长的作用持续时间，即使母体剂量为包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸剂量的三倍也是如此。
表71
转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
实施例80：通过包含GalNAc3缀合物的靶向α-1抗胰蛋白酶(A1AT)的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表72中的寡核苷酸对小鼠中的A1AT的剂量依赖性抑制。
表72
靶向A1AT的修饰ASO
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定A1AT肝脏mRNA水平。使用小鼠α1-抗胰蛋白酶ELISA(目录号41-A1AMS-E01,Alpco,Salem,NH)测定A1AT血浆蛋白水平。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平的平均百分比呈现。
如表73中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低A1AT肝脏mRNA和A1AT血浆蛋白水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比母体(ISIS 476366)显著更有效。
表73
A1AT肝脏mRNA和血浆蛋白水平
使用标准方案在处死时测量血浆中的肝脏转氨酶和BUN水平。还测量了体重和器官重量。结果在以下表74中示出。体重以相对于基线的％示出。器官重量以相对于PBS对照组的体重的％示出。
表74
实施例81：包含GalNAc3聚簇的靶向A1AT的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于表72中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
处理
用列于表72中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定基线并且在剂量之后5天、12天、19天和25天时抽血。通过ELISA测量血浆A1AT蛋白水平(参见实施例80)。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆A1AT蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸更有效并且比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 476366)具有更长的作用持续时间。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 678381、678382、678383和678384)通常比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656326)甚至更有效并且作用持续时间甚至更长。
表75
小鼠中的血浆A1AT蛋白水平
实施例82：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体外反义抑制
在处理之前2小时，以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝脏肝细胞接种于96孔平板中。以2、10、50或250nM在Williams E培养基中添加列于表76中的寡核苷酸，并且将细胞在37℃下在5％CO2中孵育过夜。在寡核苷酸添加之后16小时使细胞裂解，并且使用RNease3000BioRobot(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示，包含各种不同GalNAc缀合物基团和各种不同可裂解部分的寡核苷酸在体外自由摄取实验中比缺乏GalNAc缀合物基团的母体寡核苷酸(ISIS353382和666841)显著更有效。
表76
SRB-1表达的体外抑制
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-5a在实施例49中示出，GalNAc3-6a在实施例51中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-8a在实施例47中示出，GalNAc3-9a在实施例52中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-12a在实施例61中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，GalNAc3-14a在实施例63中示出，GalNAc3-15a在实施例64中示出，GalNAc3-17a在实施例68中示出，GalNAc3-18a在实施例69中示出，GalNAc3-19a在实施例70中示出，GalNAc3-20a在实施例71中示出，并且GalNAc3-23a在实施例76中示出。
实施例83：通过包含GalNAc3聚簇的靶向因子XI的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表77中的寡核苷酸对小鼠中的因子XI的剂量依赖性抑制。
表77
靶向因子XI的修饰寡核苷酸
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，并且GalNAc3-13a在实施例62中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用以下列出的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后剂量之后72小时将小鼠处死。根据标准方案使用实时PCR测量因子XI肝脏mRNA水平并且归一化为亲环蛋白。还测量了肝脏转氨酶、BUN和胆红素。以下结果以归一化为PBS对照的每个处理组的平均百分比呈现。
如表78中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子XI肝脏mRNA。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效。
表78
因子XI肝脏mRNA、肝脏转氨酶、BUN和胆红素水平
实施例84：包含GalNAc3缀合物的靶向因子XI的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于表77中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
处理
用列于表77中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射六至八周龄小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天通过尾部放血抽血以确定基线并且在剂量之后3天、10天和17天时抽血。使用来自R&D Systems,Minneapolis,MN的因子XI捕获和生物素化的检测抗体(分别为目录号AF2460和BAF2460)和OptEIA Reagent Set B(目录号550534,BDBiosciences,San Jose,CA)通过ELISA测量血浆因子XI蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆因子XI蛋白水平的平均百分比呈现。结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 404071)更有效且作用持续时间更长。此外，包含5’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 663086、678347、678348和678349)甚至比包含3’-GalNAc缀合物的寡核苷酸(ISIS 656173)更有效并且作用持续时间甚至更长。
表79
小鼠中的血浆因子XI蛋白水平
实施例85：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表76中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
处理
在以下示出的剂量(总共三次剂量)下，每周一次用列于表76中的寡核苷酸或用盐水各自皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后48小时将小鼠处死以使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定SRB-1mRNA水平。以下结果以归一化为盐水对照的每个处理组的肝脏SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。
如表80和81中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平。
表80
肝脏中的SRB-1 mRNA
表81
肝脏中的SRB-1 mRNA
还使用标准方案测量了肝脏转氨酶水平、总胆红素、BUN和体重。每个处理组的平均值在以下表82中示出。
表82
实施例86：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于以下表83中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
处理
每周一次用列于下表中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射八周龄TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。在整个实验的各个时间点进行尾部放血，测量血浆TTR蛋白、ALT和AST水平并且报道于表85-87中。在将动物处死之后，测量血浆ALT、AST和人TTR水平以及体重、器官重量和肝脏人TTR mRNA水平。使用临床分析仪(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人TTR mRNA水平。呈现于表84-87中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。体重为每个单独处理组的直到处死时从基线的重量变化的平均百分比。将示出的器官重量归一化为动物的体重，然后相对于PBS组的平均归一化器官重量呈现每个处理组的平均归一化器官重量。
在表84-87中，“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表84和85中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS 420915)更有效。此外，包含GalNAc缀合物和混合的PS/PO核苷间键联的寡核苷酸甚至比包含GalNAc缀合物和全部PS键联的寡核苷酸更有效。
表83
靶向人TTR的寡核苷酸
表85的图例可见于实施例74。GalNAc3-1的结构在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
表84
人TTR的体内反义抑制
表85
人TTR的体内反义抑制
表86
转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
表87
转氨酶水平、体重变化和相对器官重量
实施例87：单一剂量的包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试ISIS号420915和660261(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。在单一剂量研究中还测试ISIS号420915、682883和682885(参见表83)在小鼠中的作用持续时间。
处理
用100mg/kg ISIS No.420915或13.5mg/kg ISIS No.660261各自皮下注射表达人TTR的八周龄雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
表88
血浆TTR蛋白水平
处理
用100mg/kg ISIS No.420915、10.0mg/kg ISIS No.682883或10.0mg/kg 682885各自皮下注射表达人TTR的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药之前进行尾部放血以确定基线并且在剂量之后第3天、第7天、第10天、第17天、第24天和第39天时进行尾部放血。如实施例86中所描述来测量血浆TTR蛋白水平。以下结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆TTR水平的平均百分比呈现。
表89
血浆TTR蛋白水平
表88和89中的结果显示包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏缀合物的母体寡核苷酸(ISIS 420915)更有效并且作用持续时间更长。
实施例88：通过包含GalNAc3缀合物的靶向SMN的寡核苷酸进行的体内剪接调节
测试列于表90中的寡核苷酸对小鼠中的人存活运动神经元(SMN)的剪接调节。
表90
靶向SMN的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。“X”指示通过Gene Tools(Philomath,OR)产生的5’伯胺，并且GalNAc3-7b指示缺乏如下所示的接头的–NH-C6-O部分的GalNAc3-7a的结构：
ISIS号703421和703422为吗啉代寡核苷酸，其中两个寡核苷酸中的每个核苷酸为吗啉代核苷酸。
处理
用列于表91中的寡核苷酸或用盐水皮下注射表达人SMN的六周龄转基因小鼠一次。每个处理组由2只雄性和2只雌性组成。在剂量之后3天将小鼠处死，以根据标准方案使用实时PCR测定具有和不具有外显子7的肝脏人SMN mRNA水平。使用Ribogreen试剂测量总RNA。将SMN mRNA水平归一化为总mRNA，并且进一步归一化为盐水处理组的平均值。包括外显子7的SMN mRNA与缺失外显子7的SMN mRNA的所得平均比率在表91中示出。结果显示，调节剪接并包含GalNAc缀合物的完全修饰的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸在改变肝脏中的剪接上显著更有效。此外，对于多种修饰化学包括2’-MOE和吗啉代修饰的寡核苷酸，将维持这个趋势。
表91
靶向人SMN的寡核苷酸的体内作用
ISIS No. 剂量(mg/kg) +外显子7/-外显子7 GalNAc3聚簇 CM SEQ ID No.
盐水 n/a 1.00 n/a n/a n/a
387954 32 1.65 n/a n/a 2271
387954 288 5.00 n/a n/a 2271
699819 32 7.84 GalNAc3-7a PO 2271
699821 32 7.22 GalNAc3-7a PO 2271
700000 32 6.91 GalNAc3-1a Ad 2272
703421 32 1.27 n/a n/a 2271
703422 32 4.12 GalNAc3-7b n/a 2271
实施例89：通过包含GalNAc3缀合物的靶向载脂蛋白A(Apo(a))的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在研究中测试列于以下表92中的寡核苷酸对转基因小鼠中的Apo(a)的剂量依赖性抑制。
表92
靶向Apo(a)的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
处理
在以下示出的剂量(总共六次剂量)下，每周一次用列于表92中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射八周龄雌性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。每个处理组由3-4只动物组成。在第一次剂量前一天进行尾部放血并且每周在每次剂量之后进行尾部放血以测定血浆Apo(a)蛋白水平。在最后施用之后两天将小鼠处死。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)根据标准方案测定Apo(a)肝脏mRNA水平。使用ELISA测定Apo(a)血浆蛋白水平，并且测定肝脏转氨酶水平。表93中的mRNA和血浆蛋白结果以相对于PBS处理组的处理组平均百分比呈现。将血浆蛋白水平进一步归一化为PBS组的基线(BL)值。平均绝对转氨酶水平和体重(相对于基线平均值的％)报道于表94中。
如表93中所说明，用寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效并且作用持续时间更长。如表94中所说明，转氨酶水平和体重不受寡核苷酸的影响，表明寡核苷酸为耐受良好的。
表93
Apo(a)肝脏mRNA和血浆蛋白水平
表94
实施例90：通过包含GalNAc3聚簇的靶向TTR的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于以下表95中的寡核苷酸对表达人TTR基因的转基因小鼠中的人甲状腺素运载蛋白(TTR)的反义抑制。
处理
每周一次用列于表96中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射TTR转基因小鼠，持续三周，总共三次剂量。每个处理组由4只动物组成。在第一次剂量之前，进行尾部放血以测定基线(BL)处的血浆TTR蛋白水平。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用临床分析仪(AU480,Beckman Coulter,CA)测量TTR蛋白水平。根据标准方案使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.Eugene,OR)来测定肝脏人TTRmRNA水平。呈现于表96中的结果为每个处理组的平均值。mRNA水平为相对于PBS组的平均值的平均值。血浆蛋白水平为相对于基线处的PBS组的平均值的平均值。“BL”指示基线，即刚好在第一次剂量之前取得的测量结果。如表96中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低TTR表达水平。包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比缺乏GalNAc缀合物的母体(ISIS420915)更有效，并且包含磷酸二酯或脱氧腺苷可裂解部分的寡核苷酸与缺乏缀合物的母体相比显示出效力的显著改进(参见ISIS号682883和666943相对于420915并且参见实施例86和87)。
表95
靶向人TTR的寡核苷酸
表95的图例可见于实施例74。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。
表96
人TTR的体内反义抑制
实施例91：通过包含GalNAc3缀合物的靶向因子VII的寡核苷酸在非人灵长类动物中进行的体内反义抑制
在非终止的剂量递增研究(non-terminal,dose escalation study)中测试列于以下表97中的寡核苷酸对猴子中的因子VII的反义抑制。
处理
用递增剂量的列于表97中的寡核苷酸或用PBS在第0天、第15天和第29天时各自皮下注射非首次用于实验的猴子。每个处理组由4只雄性和1只雌性组成。在第一次剂量之前并且在此后的各个时间点进行抽血以测定血浆因子VII蛋白水平。通过ELISA测量因子VII蛋白水平。呈现于表98中的结果为相对于基线(BL)处的PBS组的平均值(刚好在第一次剂量之前取得的测量结果)的每个处理组的平均值。如表98中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低因子VII表达水平，并且包含GalNAc缀合物的寡核苷酸与缺乏GalNAc缀合物的寡核苷酸相比在猴子中显著更有效。
表97
靶向因子VII的寡核苷酸
表97的图例可见于实施例74。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。
表98
因子VII血浆蛋白水平
实施例92：通过包含GalNAc3缀合物的靶向Apo-CIII的反义寡核苷酸在原代肝细胞中进行的反义抑制
以15,000个细胞/孔将小鼠原代肝细胞接种于96孔平板中，并且以0.46nM、1.37nM、4.12nM或12.35nM、37.04nM、111.11nM或333.33nM或1.00μM添加靶向小鼠ApoC-III的列于表99中的寡核苷酸。在用寡核苷酸孵育24小时之后，使细胞裂解并且使用RNeasy(Qiagen)纯化总RNA。使用实时PCR和RNA定量试剂(Molecular Probes,Inc.)根据标准方案测定ApoC-III mRNA水平。使用Prism 4软件(GraphPad)确定IC50值。结果显示无论可裂解部分是否为磷酸二酯或磷酸二酯连接的脱氧腺苷，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸均比缺乏缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表99
小鼠原代肝细胞中小鼠APOC-III表达的抑制
GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a在实施例39中示出，GalNAc3-7a在实施例48中示出，GalNAc3-10a在实施例46中示出，GalNAc3-13a在实施例62中示出，并且GalNAc3-19a在实施例70中示出。
实施例93：通过包含混合翼和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表100中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表100
靶向SRB-1的修饰ASO
GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“k”指示6’-(S)-CH3双环核苷(cEt)；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。
处理
在以下示出的剂量下用列于表100中的寡核苷酸或用盐水皮下注射六至八周龄C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的SRB-1 mRNA水平的平均百分比呈现。如表101中所说明，用反义寡核苷酸处理以剂量依赖性方式降低SRB-1 mRNA水平，并且包含GalNAc缀合物并具有为全部cEt或混合糖修饰的翼的缺口聚物寡核苷酸比缺乏缀合物并包含全部cEt修饰的翼的母体寡核苷酸显著更有效。
还测量了体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN，并且每个处理组的平均值在表101中示出。体重以相对于刚好在寡核苷酸剂量之前测量的基线体重的体重平均百分比(％BL)示出。
表101
SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
实施例94：通过包含2’-糖修饰和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表102中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表102
靶向SRB-1的修饰ASO
下标“m”指示2’-O-甲基修饰的核苷。对于完整的表格图例参见实施例74。GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表103中示出并且显示包含GalNAc缀合物的2’-MOE和2’-OMe修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物的相应母体寡核苷酸显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
表103
SRB-1 mRNA
实施例95：通过包含双环核苷和5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表104中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
表104
靶向SRB-1的修饰ASO
下标“g”指示氟-HNA核苷，下标“l”指示包含2’-O-CH2-4’桥联的锁核苷。对于其他缩写参见实施例74表格图例。GalNAc3-1a的结构先前在实施例9中示出，GalNAc3-3a的结构先前在实施例39中示出，并且GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
处理
使用实施例93中描述的方案完成研究。结果在以下表105中示出并且显示包含GalNAc缀合物和各种双环核苷修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含双环核苷修饰的母体寡核苷酸显著更有效。此外，包含GalNAc缀合物和氟-HNA修饰的寡核苷酸比缺乏缀合物并包含氟-HNA修饰的母体显著更有效。体重、肝脏转氨酶、总胆红素和BUN测量的结果表明化合物均为耐受良好的。
表105
SRB-1 mRNA、ALT、AST、BUN和总胆红素水平以及体重
实施例96：包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸的血浆蛋白结合
在超滤测定中测试靶向ApoC-III的列于表70中的寡核苷酸和靶向Apo(a)的列于表106中的寡核苷酸以便评估血浆蛋白结合。
表106
靶向Apo(a)的修饰寡核苷酸
对于表格图例参见实施例74。GalNAc3-7a的结构先前在实施例48中示出。
将Ultrafree-MC超滤单元(30,000NMWL，低结合再生的纤维素膜，Millipore,Bedford,MA)用300μL的0.5％Tween 80预调节并且在2000g下离心10分钟，然后用300μL的对照寡核苷酸在H2O中的300μg/mL溶液预调节并且在2000g下离心16分钟。为了评估待用于研究中的来自表70和106的每个测试寡核苷酸对过滤器的非特异性结合，将300μL的pH 7.4的寡核苷酸在H2O中的250ng/mL溶液放置于预调节的过滤器中并且在2000g下离心16分钟。通过ELISA测定分析未过滤和过滤的样品以测定寡核苷酸浓度。对于每个样品，使用三次重复以获得平均浓度。相对于未过滤样品的过滤样品的平均浓度用来确定在不存在血浆的情况下通过过滤器回收的寡核苷酸的百分比(％回收)。
收集于K3-EDTA中的来自正常的无药物人志愿者、食蟹猴和CD-1小鼠的冷冻全血浆样品购自Bioreclamation LLC(Westbury,NY)。在两种浓度(5μg/mL和150μg/mL)下将测试寡核苷酸添加至1.2mL血浆等分试样中。将每个掺加的血浆样品的等分试样(300μL)放置于预调节的过滤器单元中并且在37℃下孵育30分钟，接着立即在2000g下离心16分钟。通过ELISA分析过滤和未过滤的掺加的血浆样品的等分试样，以测定每个样品中的寡核苷酸浓度。每个浓度使用三次重复，以确定每个样品中结合和未结合的寡核苷酸的平均百分数。使用相对于未过滤样品的浓度的过滤样品的平均浓度来确定血浆中未结合至血浆蛋白的寡核苷酸的百分比(％未结合)。通过将每个寡核苷酸的％未结合除以％回收来校正非特异性结合的最终未结合寡核苷酸值。通过从100中扣除最终％未结合值来确定最终％结合寡核苷酸值。对于在每种血浆中测试的两种浓度的寡核苷酸(5μg/mL和150μg/mL)，结果在表107中示出。结果显示GalNAc缀合物基团对血浆蛋白结合不具有显著影响。此外，具有全部PS核苷间键联的寡核苷酸和具有混合PO/PS键联的寡核苷酸均结合血浆蛋白，并且具有全部PS键联的那些寡核苷酸比具有混合PO/PS键联的那些寡核苷酸结合血浆蛋白的程度略微更大。
表107
结合至血浆蛋白的修饰寡核苷酸的百分比
实施例97：包含GalNAc3缀合物基团的靶向TTR的修饰寡核苷酸
将包含GalNAc缀合物的示于表108中的寡核苷酸设计成靶向TTR。
表108
靶向TTR的修饰寡核苷酸
表108的图例可见于实施例74。GalNAc3-1的结构在实施例9中示出。GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出。GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。GalNAc3-10a的结构在实施例46中示出。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出。GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
实施例98：在hPMBC测定中评价包含GalNAc缀合物的寡核苷酸的促炎性作用
在如实施例23和24中所描述的hPMBC测定中测试列于表109中的寡核苷酸的促炎性作用。(对于寡核苷酸的描述参见表30、83、95和108。)ISIS 353512为用作阳性对照的高响应者，并且其他寡核苷酸描述于表83、95和108中。使用来自一位志愿者供体的血液获得示于表109中的结果。结果显示，与具有全部PS键联的相同寡核苷酸相比，包含混合PO/PS核苷间键联的寡核苷酸产生显著较低的促炎性反应。此外，GalNAc缀合物基团在此测定中不具有显著作用。
表109
ISIS No. Emax/EC50 GalNAc3聚簇 键联 CM
353512 3630 n/a PS n/a
420915 802 n/a PS n/a
682881 1311 GalNAc3-10 PS Ad
682888 0.26 GalNAc3-10 PO/PS Ad
684057 1.03 GalNAc3-19 PO/PS Ad
实施例99：包含GalNAc缀合物的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力
在竞争性受体结合测定中测试列于表110中的寡核苷酸对去唾液酸糖蛋白受体的结合亲和力(对于寡核苷酸的描述，参见表76)。将竞争配体α1-酸糖蛋白(AGP)在50mM乙酸钠缓冲液(pH 5)中用1U神经氨酸酶-琼脂糖在37℃下孵育16小时，并且通过唾液酸测定或尺寸排阻色谱法(SEC)来证实>90％的去唾液酸化。根据Atsma等的工序使用一氯化碘来碘化AGP(参见J Lipid Res.1991年1月；32(1):173-81)。在此方法中，将去唾液酸化的α1-酸糖蛋白(de-AGP)添加至0.25M NaOH中的10mM氯化碘、Na125I和1M甘氨酸中。在室温下孵育10分钟之后，通过利用3KDMWCO自旋柱将混合物浓缩两次来从游离的125I中分离出125I-标记的de-AGP。在配备有Agilent SEC-3柱(7.8x300mm)和β-RAM计数器的HPLC***上测试蛋白质的标记效率和纯度。如下进行利用125I-标记的de-AGP和含有ASO的各种GalNAc-聚簇的竞争实验。将人HepG2细胞(106个细胞/毫升)涂布在6孔平板上处于2ml适当的生长培养基中。使用了用10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES补充的MEM培养基。将细胞分别在5％和10％CO2下在37℃下孵育16-20小时。在实验之前用不具有FBS的培养基洗涤细胞。将细胞在37℃下用1ml含有适当生长培养基的竞争混合物孵育30min，所述培养基具有2％FBS、10-8M 125I-标记的de-AGP和浓度在10-11至10-5M范围内的含有GalNAc-聚簇的ASO。在10-2M GalNAc糖存在下测定非特异性结合。将细胞用不具有FBS的培养基洗涤两次，以去除未结合的125I-标记的de-AGP和竞争者GalNAc ASO。使用含有1％β-巯基乙醇的Qiagen的RLT缓冲液使细胞裂解。在简短的10min冻/融循环之后将裂解液转移至圆底测定管中并且在γ-计数器上测定。在将125I蛋白计数除以最低GalNAc-ASO浓度计数的值之前扣除非特异性结合。使用非线性回归算法根据单一位点竞争结合方程式拟合抑制曲线以计算结合亲和力(KD’s)。
从在五个不同日子进行的实验中获得表110中的结果。用上标“a”标志的寡核苷酸的结果为在两个不同日子进行的实验的平均值。结果显示，在5’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以比在3’-末端包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸大1.5倍至16倍的亲和力结合人HepG2细胞上的去唾液酸糖蛋白受体。
表110
去唾液酸糖蛋白受体结合测定结果
实施例100：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在单一剂量研究中测试列于以下表111a中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表111a
靶向APO(a)的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
处理
每周一次用列于表111b中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雌性转基因小鼠，总共6次剂量。每个处理组由3只动物组成。在给药前一天抽血以测定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后72小时、1周和2周时抽血。在第一次剂量之后3周、4周、5周和6周时将发生另外的抽血。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表111b中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比呈现，所述结果表明包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸在Apo(a)表达中表现出蛋白质减少。对于包含全部PS核苷间键联的寡核苷酸和包含混合PO和PS键联的寡核苷酸观察到这种有效作用。
表111b
Apo(a)血浆蛋白水平
实施例101：通过包含经由稳定部分连接的GalNAc聚簇的寡核苷酸进行的反义抑制
测试列于表112中的寡核苷酸对小鼠APOC-III表达的体内抑制。用列于表112中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射C57Bl/6小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。用ISIS440670处理的每只小鼠接受2mg/kg、6mg/kg、20mg/kg或60mg/kg的剂量。用ISIS 680772或696847处理的每只小鼠接受0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg。ISIS 696847的GalNAc缀合物基团经由稳定部分连接，所述稳定部分为硫代磷酸酯键联而不是能够易于裂解的含磷酸二酯的键联。在剂量之后72小时将动物处死。使用实时PCR测量肝脏APOC-III mRNA水平。根据标准方案将APOC-III mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。结果以相对于盐水对照组的每个处理组的APOC-III mRNA水平的平均百分比呈现于表112中。结果显示包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸比缺乏缀合物基团的寡核苷酸显著更有效。此外，包含经由可裂解部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 680772)甚至比包含经由稳定部分连接至寡核苷酸的GalNAc缀合物基团的寡核苷酸(ISIS 696847)更有效。
表112
靶向小鼠APOC-III的修饰寡核苷酸
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
实施例102：包含GalNAc缀合物的反义寡核苷酸在肝脏中的分布
评价了不包含GalNAc缀合物的ISIS 353382(参见表36)和包含GalNAc缀合物的ISIS 655861(参见表36)的肝脏分布。以列于表113中的剂量用ISIS 353382或655861皮下注射雄性balb/c小鼠一次。每个处理组由3只动物组成，除了ISIS 655861的18mg/kg组，所述组由2只动物组成。在剂量之后48小时将动物处死以确定寡核苷酸的肝脏分布。为了测量每个细胞的反义寡核苷酸分子的数量，将钌(II)三-联吡啶标签(MSD TAG，Meso ScaleDiscovery)缀合至用来检测反义寡核苷酸的寡核苷酸探针。呈现于表113中的结果为以百万个寡核苷酸分子/细胞单位计的每个处理组的寡核苷酸的平均浓度。结果显示，在等效剂量下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更高的浓度存在于总肝脏和肝细胞中。此外，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的寡核苷酸以更低的浓度存在于非实质肝脏细胞中。虽然ISIS 655861在肝细胞和非实质肝脏细胞中的浓度为每个细胞类似的，但是肝脏大约为80体积％肝细胞。因此，存在于肝脏中的大多数ISIS 655861寡核苷酸见于肝细胞中，而存在于肝脏中的大多数ISIS 353382寡核苷酸见于非实质肝脏细胞中。
表113
实施例103：包含GalNAc3缀合物的靶向APOC-III的寡核苷酸的体内作用持续时间
在单一剂量研究中测试列于以下表114中的寡核苷酸在小鼠中的作用持续时间。
表114
靶向APOC-III的修饰ASO
GalNAc3-3a的结构在实施例39中示出，并且GalNAc3-19a的结构在实施例70中示出。
处理
用列于表114中的寡核苷酸或用PBS各自皮下注射表达人APOC-III的雌性转基因小鼠一次。每个处理组由3只动物组成。在给药之前抽血以确定基线并且在剂量之后3天、7天、14天、21天、28天、35天和42天时抽血。如实施例20中所描述来测量血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平。表115中的结果以归一化为基线水平的每个处理组的血浆甘油三酯和APOC-III水平的平均百分比呈现。实施例79的表71中的结果与以下表115中的结果的比较显示，包含磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷间键联的混合物的寡核苷酸表现出比仅包含硫代磷酸酯核苷间键联的相当(equivalent)寡核苷酸增加的作用持续时间。
表115
转基因小鼠中的血浆甘油三酯和APOC-III蛋白水平
实施例104：包含5’-GalNAc2缀合物的寡核苷酸的合成
化合物120为商业上可获得的，并且化合物126的合成描述于实施例49中。将化合物120(1g，2.89mmol)、HBTU(0.39g，2.89mmol)以及HOBt(1.64g，4.33mmol)溶解于DMF(10mL中。并且添加N,N-二异丙基乙胺(1.75mL，10.1mmol)。在约5min之后，将氨基己酸苄基酯(1.36g，3.46mmol)添加至反应物中。在3h之后，将反应混合物倾入100mL的1M NaHSO4中并且用2x50mL乙酸乙酯萃取。合并有机层并且用3x40mL饱和NaHCO3和2x盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法(DCM:EA:Hex，1:1:1)纯化产物，得到化合物231。LCMS和NMR与结构一致。将化合物231(1.34g，2.438mmol)溶解于二氯甲烷(10mL)中并且添加三氟乙酸(10mL)。在室温下搅拌2h之后，将反应混合物在减压下浓缩并且与甲苯共蒸发(3x10mL)。在减压下干燥残余物，得到呈三氟乙酸盐的化合物232。化合物166的合成描述于实施例54中。将化合物166(3.39g，5.40mmol)溶解于DMF(3mL)中。将化合物232(1.3g，2.25mmol)的溶液溶解于DMF(3mL)中并且添加N,N-二异丙基乙胺(1.55mL)。将反应物在室温下搅拌30分钟，然后倾入水(80mL)并且用EtOAc(2x100mL)萃取水层。将有机相分离并且用饱和NaHCO3水溶液(3x80mL)、1M NaHSO4(3x80mL)和盐水(2x80mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)、过滤并且浓缩。通过硅胶柱色谱法纯化残余物，得到化合物233。LCMS和NMR与结构一致。将化合物233(0.59g，0.48mmol)溶解于甲醇(2.2mL)和乙酸乙酯(2.2mL)中。添加钯/碳(10重量％Pd/C，湿，0.07g)并且将反应混合物在氢气气氛下搅拌3h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，并且浓缩以得到羧酸。将羧酸(1.32g，1.15mmol，不含聚簇的酸)溶解于DMF(3.2mL)中。向其中添加N,N-二异丙基乙胺(0.3mL，1.73mmol)和PFPTFA(0.30mL，1.73mmol)。在室温下搅拌30min之后，将反应混合物倾入水(40mL)中并且用EtOAc(2x50mL)萃取。如上所述完成标准的后处理，得到化合物234。LCMS和NMR与结构一致。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸235。缀合物基团GalNAc2-24的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-24a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc2-24(GalNAc2-24a-CM)的结构在以下示出：
实施例105：包含GalNAc1-25缀合物的寡核苷酸的合成
化合物166的合成描述于实施例54中。使用实施例46中描述的一般工序制备寡核苷酸236。
或者，使用以下示出的方案合成寡核苷酸236，并且使用实施例10中描述的工序使用化合物238来形成寡核苷酸236。
缀合物基团GalNAc1-25的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-25a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-25(GalNAc1-25a-CM)的结构在以下示出：
实施例106：通过包含5’-GalNAc2或5’-GalNAc3缀合物的靶向SRB-1的寡核苷酸进行的体内反义抑制
在剂量依赖性研究中测试列于表116和117中的寡核苷酸对小鼠中的SRB-1的反义抑制。
处理
用2mg/kg、7mg/kg或20mg/kg的ISIS No.440762，或用0.2mg/kg、0.6mg/kg、2mg/kg、6mg/kg或20mg/kg的ISIS No.686221、686222或708561，或用盐水皮下注射六周龄雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)一次。每个处理组由4只动物组成。在最后施用之后72小时将小鼠处死。使用实时PCR测量肝脏SRB-1 mRNA水平。根据标准方案将SRB-1 mRNA水平归一化为亲环蛋白mRNA水平。反义寡核苷酸以剂量依赖性方式降低SRB-1mRNA水平，并且ED50结果呈现于表116和117中。尽管先前的研究示出三价的GalNAc缀合的寡核苷酸比二价的GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效，所述二价的GalNAc缀合的寡核苷酸继而比一价的GalNAc缀合的寡核苷酸显著更有效(参见例如Khorev等,Bioorg.&Med.Chem.,第16卷,5216-5231(2008))，用包含一价、二价以及三价的GalNAc聚簇的反义寡核苷酸处理以如表116和117中所示的相似效力降低SRB-1 mRNA水平。
表116
靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
对于表格图例，参见实施例93。GalNAc3-13a的结构在实施例62中示出，并且GalNAc2-24a的结构在实施例104中示出。
表117
靶向SRB-1的修饰寡核苷酸
对于表格图例，参见实施例93。GalNAc1-25a的结构在实施例105中示出。
使用实施例75中描述的工序，还评价了表116和117中的寡核苷酸在肝脏中的浓度。如通过UV以μg寡核苷酸/克肝脏组织的单位所测量，示于以下表117a和117b中的结果为每个处理组的平均总反义寡核苷酸组织水平。结果显示，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸以显著高于相同剂量的缺乏GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的水平在肝脏中积累。此外，在其相应缀合物基团中包含一个、两个或三个GalNAc配体的反义寡核苷酸均以类似水平在肝脏中积累。由以上引用的Khorev等参考文献来看此结果为令人惊奇的并且与示于以上表116和117中的活性数据一致。
表117a
包含GalNAc2或GalNAc3缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
表117b
包含GalNAc1缀合物基团的寡核苷酸的肝脏浓度
实施例107：包含GalNAc1-26或GalNAc1-27缀合物的寡核苷酸的合成
通过使用DMF中的HBTU和DIEA将化合物47(参见实施例15)偶联至酸64(参见实施例32)来合成寡核苷酸239。将所得到的含酰胺化合物亚磷酸酯化，然后使用实施例10中描述的工序添加至寡核苷酸的5’-末端。缀合物基团GalNAc1-26的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-26a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-26(GalNAc1-26a-CM)的结构在以下示出：
为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用实施例7中描述的工序将由化合物47和64反应所形成的酰胺添加至固体载体上。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸240。
缀合物基团GalNAc1-27的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-27a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-27(GalNAc1-27a-CM)的结构在以下示出：
实施例108：靶向Apo(a)的包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸的体内反义抑制
在单一剂量研究中在小鼠中测试列于以下表118中的寡核苷酸。
表118
靶向APO(a)的修饰ASO
GalNAc3-7a的结构在实施例48中示出。
处理
用列于表119中的寡核苷酸和剂量或用PBS各自皮下注射表达人Apo(a)的雄性转基因小鼠一次。每个处理组由4只动物组成。在给药前一天抽血以确定血浆中Apo(a)蛋白的基线水平并且在第一次剂量之后1周时抽血。另外的抽血将每周发生，持续大约8周。使用ELISA测量血浆Apo(a)蛋白水平。表119中的结果以归一化为基线水平(基线％)的每个处理组的血浆Apo(a)蛋白水平的平均百分比呈现，所述结果表明反义寡核苷酸减少了Apo(a)蛋白表达。此外，包含GalNAc缀合物基团的寡核苷酸表现出甚至比不包含缀合物基团的寡核苷酸更有效的Apo(a)表达减少。
表119
Apo(a)血浆蛋白水平
实施例109：包含GalNAc1-28或GalNAc1-29缀合物的寡核苷酸的合成
使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成亚磷酰胺中间体，接着使用实施例10中描述的工序合成寡核苷酸来合成寡核苷酸241。缀合物基团GalNAc1-28的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-28a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-28(GalNAc1-28a-CM)的结构在以下示出：
为了将GalNAc1缀合物基团添加至寡核苷酸的3’-末端，使用类似于实施例71中描述的那些的工序形成羟基中间体，然后使用实施例7中描述的工序将所述羟基中间体添加至固体载体。然后使用实施例9中描述的工序完成寡核苷酸合成以便形成寡核苷酸242。
缀合物基团GalNAc1-29的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-29a)可与寡核苷酸上存在的任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。GalNAc1-29(GalNAc1-29a-CM)的结构在以下示出：
实施例110：包含GalNAc1-30缀合物的寡核苷酸的合成
如上所示，合成包含GalNAc1-30缀合物基团的寡核苷酸246，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc1-30的GalNAc1聚簇部分(GalNAc1-30a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，Y为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，Y为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc1-30a的结构如下所示：
实施例111：包含GalNAc2-31或GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成
如上所示，合成包含GalNAc2-31缀合物基团的寡核苷酸250，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-31的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-31a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc2-31a的结构如下所示：
以下示出包含GalNAc2-32缀合物的寡核苷酸的合成。
如上所示，合成包含GalNAc2-32缀合物基团的寡核苷酸252，其中Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。缀合物基团GalNAc2-32的GalNAc2聚簇部分(GalNAc2-32a)可与任何可裂解部分组合以提供各种缀合物基团。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为可裂解部分的一部分。在某些实施方案中，直接与寡核苷酸的5’-末端相邻的含Y基团为稳定部分的一部分，并且可裂解部分存在于寡核苷酸上。GalNAc2-32a的结构如下所示：
实施例112：包含GalNAc1缀合物的修饰寡核苷酸
用GalNAc1缀合物基团合成靶向SRB-1的表120中的寡核苷酸，以便进一步测试包含含有一个GalNAc配体的缀合物基团的寡核苷酸的效力。
表120
实施例113：包含GalNAc聚簇的靶向激肽释放酶B、血浆(Fletcher因子)1的反义寡核苷酸
表121中的寡核苷酸被设计来靶向人激肽释放酶B、血浆(Fletcher因子)1或激肽释放酶(PKK)。
表121
实施例114：通过具有2’-MOE糖修饰的反义寡核苷酸进行的对HepaRGTMT细胞中的人PKK的反义抑制
反义寡核苷酸被设计成靶向PKK核酸并且测试其在体外对PKK mRNA的作用。筛子中使用HepaRGTM细胞，其为末端分化的衍生自人肝祖细胞系的肝脏细胞并且保持原代人肝细胞的许多特性(Lubberstedt M.等,J.Pharmacol.Toxicol.Methods 2011 63:59-68)。
以下表中的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。缺口聚物长为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-O-甲氧基乙基修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1(GENBANK登录号NM_000892.3)的人PKK mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:10(从核苷酸111693001至111730000截短的GENBANK登录号NT_016354.19)的人PKK基因组序列。‘n/a’表示反义寡核苷酸不靶向那个特定基因序列。
使用电穿孔以3,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepaRGTM细胞。在大约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量PKK mRNA水平。使用人类引物探针集RTS3454(正向序列CCAAAAAAGGTGCACCAGTAACA，在本文中命名为SEQ ID NO:20；反向序列CCTCCGGGACTGTACTTTAATAGG，在本文中命名为SEQ ID NO:21；探针序列CACGCAAACATTTCACAAGGCAGAGTACC，在本文中命名为SEQ ID NO:22)测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的PKK的抑制百分比。
表122
表123
表124
表125
实施例115：通过具有2’-MOE糖修饰的反义寡核苷酸进行的对HepaRGTM细胞中的人PKK的反义抑制
设计其他靶向PKK核酸的反义寡核苷酸且测试其在体外对PKK mRNA的作用。
以下表中的嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物、4-9-4MOE缺口聚物、4-10-4MOE缺口聚物、4-10-3MOE缺口聚物、3-10-4MOE缺口聚物或3-10-3MOE缺口聚物。5-10-5MOE缺口聚物的长度为20个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含五个核苷的翼区段。4-9-4MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含九个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含四个核苷的翼区段。4-10-4MOE缺口聚物的长度为18个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含四个核苷的翼区段。4-10-3MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含四个和三个核苷的翼区段。3-10-4MOE缺口聚物的长度为17个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上分别侧接包含三和四个核苷的翼区段。3-10-3MOE缺口聚物长为16个核苷，其中，中心缺口区段包含十个2’-脱氧核苷并且在5’方向和3’方向上各自侧接包含三个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-O-甲氧基乙基修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:10。‘n/a’表示反义寡核苷酸不靶向那个特定基因序列。
使用电穿孔以5,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepaRGTM细胞。在大约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量PKK mRNA水平。使用人引物探针集RTS3454测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的PKK的抑制百分比。
表126
表127
表128
表129
表130
表131
表132
表133
表134
表135
表136
表137
表138
表139
实施例116：通过具有MOE、脱氧以及cEt糖修饰的反义寡核苷酸进行的对HepaRGTM细胞中的人PKK的反义抑制
设计其他靶向PKK核酸的反义寡核苷酸且测试其在体外对PKK mRNA的作用。
下表中的嵌合反义寡核苷酸被设计为脱氧、MOE以及cEt缺口聚物。缺口聚物的长度为16个核苷，其中核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧修饰。‘化学’列描述各寡核苷酸的糖修饰。‘k’指示cEt糖修饰；数字指示脱氧核苷的数目；另外，‘d’指示脱氧核苷；且‘e’指示2’-O-甲氧基乙基修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。整个各寡核苷酸当中的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“终止位点”表示人基因序列中缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。将列于以下表中的每个缺口聚物靶向在本文中指定为SEQ ID NO:1的人PKK mRNA或在本文中指定为SEQ ID NO:10的人PKK基因组序列。‘n/a’表示反义寡核苷酸不靶向那个特定基因序列。
使用电穿孔以1,000nM反义寡核苷酸转染密度为每孔20,000个细胞的培养的HepaRGTM细胞。在大约24小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量PKK mRNA水平。使用人引物探针集RTS3454测量mRNA水平。ISIS 531231包括在测定中。根据如由所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的PKK的抑制百分比。
表140
表141
表142
表143
表144
表145
表146
表147
表148
表149
表150
表151
表152
实施例117：在HepaRGTM细胞中对人PKK的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对PKK mRNA展现显著体外抑制的缺口聚物且在HepaRGTM细胞中以各种剂量测试。将细胞以每孔20,000个细胞的密度铺板并且使用电穿孔，以0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM以及10.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在大约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量PKK mRNA水平。使用人PKK引物探针集RTS3454测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的PKK的抑制百分比。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，PKK mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。
表153
表154
实施例118：在HepaRGTM细胞中对人PKK的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对PKK mRNA展现显著体外抑制的缺口聚物且在HepaRGTM细胞中以各种剂量测试。将细胞以每孔20,000个细胞的密度铺板并且使用电穿孔，以0.19μM、0.56μM、1.67μM以及5.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在大约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量PKK mRNA水平。使用人PKK引物探针集RTS3454测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的PKK的抑制百分比。‘n/a’表示未针对那个特定反义寡核苷酸针对那个特定剂量进行测量。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，PKK mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。
表155
表156
表157
表158
表159
表160
表161
表162
表163
表164
实施例119：在HepaRGTM细胞中对人PKK的剂量依赖性反义抑制
选择来自以上所述的研究且对PKK mRNA展现显著体外抑制的缺口聚物且在HepaRGTM细胞中以各种剂量测试。将细胞以每孔20,000个细胞的密度铺板并且使用电穿孔，以0.11μM、0.33μM、1.00μM以及3.00μM浓度的反义寡核苷酸进行转染。在大约16小时的处理期后，自细胞分离RNA且通过定量实时PCR测量PKK mRNA水平。使用人PKK引物探针集RTS3454测量mRNA水平。根据如由所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。在具有类似培养条件的一系列实验中测试反义寡核苷酸。每个实验的结果呈现在以下所示的单独表格中。结果呈现为相对于未处理的对照细胞的PKK的抑制百分比。‘n/a’表示未针对那个特定反义寡核苷酸针对那个特定剂量进行测量。
也呈现了各寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。在反义寡核苷酸处理的细胞中，PKK mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。
表165
表166
表167
表168
实施例120：靶向人PKK的反义寡核苷酸在转基因小鼠中的功效
用选自以上所述研究的ISIS反义寡核苷酸处理含有人KLKB1基因序列(染色体4：187148672-187179625位，登录号：NC_000004.11)的37,390个碱基对片段，所述转基因小鼠用于评估该模型的功效。
处理
每周两次向转基因小鼠的组皮下注射2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周的ISIS 546232、ISIS 546251、ISIS 546254、ISIS 546343、ISIS 546828、ISIS547455、ISIS 547457、ISIS 547927以及ISIS 548048，持续3周。每周两次向一组转基因小鼠皮下注射PBS，持续3周。最后一次剂量48小时后使小鼠安乐死，并且收获器官和血浆用于进一步分析。
RNA分析
为评估ISIS寡核苷酸对靶减少的效应，自肝脏组织提取RNA用于人PKK的实时PCR分析。结果呈现为相对于PBS对照的PKK mRNA的抑制百分比。如在表169中示出，用ISIS反义寡核苷酸处理导致相比于PBS对照的PKK mRNA显著减少。
表169
相对于PBS对照的转基因小鼠肝脏中PKK mRNA的抑制百分比
蛋白质分析
评估所有组中的血浆PKK蛋白质水平。结果呈现为相对于PBS对照的PKK蛋白质的抑制百分比。如在表170中示出，用ISIS反义寡核苷酸处理导致相比于PBS对照的PKK蛋白质水平显著减少。
表170
相对于PBS对照的转基因小鼠中PKK蛋白质水平的抑制百分比
实施例121：食蟹猴中靶向人PKK的ISIS反义寡核苷酸的作用
将食蟹猴用选自以上研究的ISIS反义寡核苷酸处理。评估反义寡核苷酸功效和耐受性。所测试的人反义寡核苷酸与恒河猴基因组序列(从核苷酸2358000至2391000截短的GENBANK登录号NW_001118167.1，在本文中命名为SEQ ID NO:18)交叉反应。相对于SEQ IDNO:18的每一寡核苷酸的靶起始位点在表171中呈现。‘错配’指示寡核苷酸序列与恒河猴序列之间错配的核苷酸的数目。人寡核苷酸与恒河猴序列之间的互补性越高，人寡核苷酸与恒河猴序列交叉反应的可能性越大。‘n/a’表示寡核苷酸与恒河猴基因序列具有3个以上的错配。
表171
与SEQ ID NO:18互补的反义寡核苷酸
处理
在研究之前，将猴子保持隔离30天的时间，在此期间，每天观察动物的一般健康状况。猴子是2-4岁并且重量在2至4kg之间。向四只随即指派的雄性食蟹猴的十个组皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS。在研究的第一周(第1、3、5以及7天)时，首先用由四个剂量组成的负载方案施用剂量为40mg/kg的PBS溶液或ISIS寡核苷酸，接着为由在第14天(第2至13周)时开始每周一次施用组成的维持方案。以顺时针旋转在背部上的4个位点进行皮下注射；每剂量一个位点。注射位点由刺纹绘出，同时使用***使其镇静，并且被最小3cm分开。
在研究期期间，每天最少一次观察猴子的生病或不适的迹象。将经历因治疗、损伤或生病所引起的超过瞬时或轻微的疼痛或不适的任何动物迅速地报告至负责兽医和实验负责人。鉴定出任何处于不良健康状况或处于可能的濒死状况的动物以供进一步监测以及可能的安乐死。例如，由于减弱的行为、侧卧位、缺乏对刺激的应答以及降低的呼吸，使用ISIS 547445处理的两只猴子安乐死。实施例中所述的实验方案得到了InstitutionalAnimal Care and Use Committee(IACUC)的批准。
靶减少
RNA分析
在第87或88天时，在最后剂量48小时后，自肝脏组织提取RNA，以使用引物探针集RTS3455(正向序列CCTGTGTGGAGGGTCACTCA，在本文中称为SEQ ID NO:23，反向序列CCACTATAGATGCGCCAAACATC，在本文中称为SEQ ID NO:24；探针序列CCCACTGCTTTGATGGGCTTCCC，在本文中称为SEQ ID NO:25)，进行PKK的实时PCR分析。将结果归一化为管家基因、亲环蛋白。结果呈现为相对于PBS对照的PKK mRNA的抑制百分比。如在表172中示出，用ISIS反义寡核苷酸处理导致相比于PBS对照的PKK mRNA显著减少。
表172
相对于PBS对照的食蟹猴肝中PKK mRNA的抑制百分比
ISIS No ％抑制
546232 88
546251 90
546254 88
546343 74
546828 45
547455 90
547457 89
547927 54
548048 95
蛋白质分析
在第17天、第31天、第45天、第59天以及第73天，在给药前每次自所有可获得的动物收集大约0.9mL血液，并且放入含有3.2％的柠檬酸钠的试管中。将试管离心(在室温下以3000rpm保持10min)以获得血浆。通过ELISA测量血浆中的PKK蛋白质水平。结果呈现于表173中，其表示为相比于PBS对照水平的抑制百分比。结果显示ISIS寡核苷酸显著减小了PKK蛋白质水平。
表173
相对于对照水平的食蟹猴血浆中的PKK蛋白质水平减小(％)
第17天 第31天 第45天 第59天 第73天
ISIS 546232 53 58 72 75 70
ISIS 546251 71 75 75 81 77
ISIS 546254 38 51 63 74 73
ISIS 546343 56 74 69 70 70
ISIS 546828 0 8 23 39 39
ISIS 547455 26 33 43 58 58
ISIS 547457 68 75 79 76 80
ISIS 547927 8 0 15 10 18
ISIS 548048 90 93 95 95 95
耐受性研究
肝功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肝功能的效应，使猴子禁食过夜。自所有研究组收集大约1.5mL血液样品。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后在3,000rpm下离心10分钟。使用Toshiba 120FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)来测量各种肝功能标志物的水平。所述结果呈现于表174中并且显示反义寡核苷酸对超出反义寡核苷酸预期范围之外的肝功能没有作用。
表174
食蟹猴血浆中的肝功能标记物
白蛋白(g/dL) AST(IU/L) ALT(IU/L)
PBS 4.2 48 60
ISIS 546232 4.1 63 140
ISIS 546251 3.7 51 58
ISIS 546254 3.8 68 54
ISIS 546343 4.3 49 76
ISIS 546828 3.7 75 67
ISIS 547455 3.8 56 61
ISIS 547457 4.0 54 52
ISIS 547927 4.2 59 61
ISIS 548048 4.2 44 47
血液学
为了评价食蟹猴中的ISIS寡核苷酸对血液学参数的任何效应，在给药前和在第87天或第88天时从每个可用的研究动物收集大约1.2mL的血液的血液样品置于含有K2-EDTA的试管中。使用ADVIA2120i血细胞分析仪(SIEMENS,USA)分析样品的红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血小板计数、血红蛋白含量以及红细胞压积。数据列于表175中。
所述数据示出用大多数寡核苷酸的处理不会引起超出在该剂量下的反义寡核苷酸的预期范围之外的血液学参数的任何改变。
表175
食蟹猴中的血液学参数
肾功能
为了评估ISIS寡核苷酸对肾功能的效应，使猴子禁食过夜。自所有研究组收集大约1.5mL血液样品。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后在3,000rpm下离心10分钟。使用Toshiba 120FR NEO化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)来测量BUN和肌酸酐的水平。结果呈现于表176中，以mg/dL表示。血浆化学数据表示大部分ISIS寡核苷酸对超出反义寡核苷酸预期范围之外的肾功能没有任何作用。具体地，用ISIS 546254处理在猴子肾功能方面是良好耐受的。
肾功能还通过验尿进行评估。使用干净的保持盘自所有的动物，将新鲜的尿液收集于湿冰上。在新鲜的尿液收集前一天，禁食一整夜，但是供应水。使用Toshiba 120FR NEO自动化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)来测量总蛋白质和肌酸酐水平并且计算蛋白质与肌酸酐的比。结果呈现于表177中。
表176
食蟹猴中的血浆BUN和肌酸酐水平(mg/dL)
BUN 肌酸酐
PBS 22.8 0.9
ISIS 546232 22.7 1.0
ISIS 546251 25.4 1.1
ISIS 546254 25.7 0.9
ISIS 546343 26.2 1.0
ISIS 546828 24.7 0.9
ISIS 547455 29.4 0.9
ISIS 547457 24.3 1.0
ISIS 547927 22.3 1.0
ISIS 548048 21.9 0.9
表177
食蟹猴中的尿液蛋白质/肌酸酐的比
比
ISIS 546232 0.03
ISIS 546251 0.12
ISIS 546254 0.04
ISIS 546343 0.01
ISIS 546828 0.03
ISIS 547455 0.70
ISIS 547457 0.03
ISIS 547927 0.04
ISIS 548048 0.03
PBS 0.06
C-反应蛋白水平分析
为了评估ISIS寡核苷酸在食蟹猴中的任何炎性效应，使猴子禁食过夜。自所有研究组收集大约1.5mL血液样品。在无用于血清分离的抗凝剂情况下，将血液收集于试管中。将试管在室温下保持最少90分钟，并且然后在3,000rpm下离心10分钟。使用Toshiba 120FRNEO化学分析仪(Toshiba Co.,Japan)测量在肝脏中合成并且用作炎症的标志物的C反应蛋白(CRP)。补体C3也被类似地测量，并且数据呈现为基线值的百分比。结果呈现于表178中并且表示用ISIS寡核苷酸治的处理未导致猕猴任何炎症。
表178
食蟹猴血浆中的C-反应蛋白和C3水平
CRP(mg/dL) C3(基线的％)
PBS 0.2 73
ISIS 546232 0.5 50
ISIS 546251 0.7 62
ISIS 546254 0.8 61
ISIS 546343 0.2 60
ISIS 546828 0.6 56
ISIS 547455 1.9 64
ISIS 547457 0.3 53
ISIS 547927 0.2 73
ISIS 548048 0.2 69
实施例122：小鼠原代肝细胞中的鼠PKK mRNA的反义抑制
设计靶向鼠PKK核酸的反义寡核苷酸且测试其在体外对PKKmRNA的作用。使用细胞转染剂以12.5nM、25.0nM、50.0nM、100.0nM以及200.0nM的反义寡核苷酸转染密度为每孔10,000个细胞的培养的小鼠原代肝细胞。在大约24小时的处理期间后，自细胞分离RNA并且使用小鼠引物探针集RTS3313(正向序列TGCCTGCTGTTCAGCTTTCTC，在本文中称为SEQ IDNO:2228，反向序列TGGCAAAGTCCCTGTAATGCT，在本文中称为SEQ ID NO:2229；探针序列CGTGACTCCACCCAAAGAGACAAATAAACG，在本文中称为SEQ ID NO:2230)，通过定量实时PCR测量鼠PKK mRNA水平。根据如由RIBOGREEN所测量的总RNA含量调整PKK mRNA水平。
嵌合反义寡核苷酸被设计为5-10-5MOE缺口聚物。所述缺口聚物的长度为20个核苷，其中中心缺口区段包含10个2'-脱氧核苷且在两侧上(在5'及3'方向上)由各自包含5个核苷的翼侧接。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷具有2’-O-甲氧基乙基修饰。每个缺口聚物整个的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。每个缺口聚物整个的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。结果表明PKK mRNA水平以剂量依赖性反式显著降低。
在一个具体实施例中，ISIS 482584(GGCATATTGGTTTTTGGAAT；SEQ ID NO:2244)以剂量依赖性反式降低了PKK mRNA，得到84nM的半数最大抑制浓度(IC50)(参见表179)。ISIS482584靶向SEQ ID NO:11(GENBANK登录号NM_008455.2)并且具有1586的靶起始位点和1605的靶终止位点。“靶起始位点”表示缺口聚物所靶向的最5’核苷酸。“靶终止位点”表示缺口聚物所靶向的最3’核苷酸。
表179
通过ISIS 482584的鼠PKK mRNA水平的剂量依赖性抑制
剂量 ％抑制
12.5nM 0
25.0nM 47
50.0nM 27
100.0nM 60
200.0nM 82
实施例123：BALB/c小鼠中的PKK mRNA的反义抑制
在体内测试ISIS 482584对鼠PKK mRNA的作用。
处理
用2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg、40.0mg/kg或80.0mg/kg的ISIS482584各自处理雄性BALB/c小鼠的六个组，每周两次皮下施用保持3周(5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg、40.0mg/kg、80.0mg/kg或160.0mg/kg的周剂量)。用PBS处理BALB/c小鼠的对照组，每周两次皮下施用保持3周。在反义寡核苷酸或PBS的最后剂量之后两天，用混合有10mg/kg赛拉嗪的150mg/kg***麻醉来自所有组的小鼠，通过腹膜内注射施用。收集肝脏用于RNA分析。
RNA分析
自肝脏组织提取RNA用于PKK的实时PCR分析。使用小鼠引物探针集(正向序列ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC，在本文中命名为SEQ ID NO:2231；反向序列GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT，在本文中命名为SEQ ID NO:2232；探针序列AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC，在本文中命名为SEQ ID NO:2233)测量PKK mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照的PKK的抑制百分比。如表180所示，用ISIS 482584处理导致相比于PBS对照的PKK mRNA的剂量依赖性显著减少。
表180
BALB/c小鼠肝脏中的PKK mRNA的剂量依赖性减少
蛋白质分析
将血浆收集于含有柠檬酸钠作为抗凝剂的试管中。将样品在4-12％梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上运行，接着通过用鼠PKK抗体(R&D***)进行免疫印迹。用次级荧光团标记抗体(LI-COR)温育印迹并且在Odyssey成像器(LI-COR)中成像。结果呈现为相对于PBS对照的PKK的抑制百分比。如表181所示，用ISIS 482584处理导致相比于PBS对照的PKK血浆蛋白的剂量依赖性显著减少。
表181
BALB/c小鼠血浆中的PKK蛋白的剂量依赖性减少
n.d.＝无数据
实施例124：血管性水肿小鼠模型中的鼠PKK反义抑制的体内作用
遗传性血管性水肿(HAE)的特征在于局部肿胀和皮下组织中的血管渗透性增加(Morgan,B.P.N.Engl.J.Med.363:581-83,2010)。它由C1抑制剂、补体***的蛋白质的缺陷所引起。在这个研究中使用两个小鼠模型，包括建立的C1-INH缺陷小鼠模型和卡托普利诱导的水肿模型，所述模型均引起血管渗透性、HAE的标志。血管渗透性的逆转伴有增加的高分子量激肽原(HMWK)的血浆水平。
在第一个模型中，通过用已知的抗高血压剂卡托普利处理诱导血管性水肿，所述抗高血压剂增加了小鼠的血管渗透性并且复制遗传性血管性水肿的病理。
在第二个模型中，通过用靶向小鼠C1抑制剂mRNA的反义寡核苷酸ISIS 461756处理诱导血管性水肿，所述抗高血压剂增加了小鼠的血管渗透性并且复制遗传性血管性水肿的病理。ISIS 461756(SEQ ID NO:2245；AAAGTGGTTGATACCCTGGG)为靶向NM_009776.3(SEQID NO:2243)的核苷1730-1749的5-10-5MOE缺口聚物。
在血管渗透性的卡托普利和ISIS 461756诱导的小鼠模型中评估PKK的反义寡核苷酸抑制剂HOE-140和ISIS 482584的作用。用缓激肽B2受体的选择性拮抗剂HOE-140处理一些小鼠组，所述选择性拮抗剂阻碍血管舒张和血管渗透性(Cruden和Newby,ExpertOpin.Pharmacol.9:2383-90,2008)。其他小鼠用抑制PKK mRNA表达的ISIS 482584处理。将用HOE-140处理的效应与用ISIS 482584处理的效应做比较。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表182中。
组1由用每周两次皮下施用保持4周的PBS处理的4只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量血管渗透性的基础水平。
组2由用每周两次皮下施用保持4周的PBS处理的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在处理结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组2用作用于卡托普利诱导的血管渗透性的PBS对照组。
组3由用每周两次皮下施用保持4周的PBS处理的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在第14天时，将小鼠用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸ISIS 461756进行处理，每周两次皮下施用保持2周。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组3用作用于卡托普利和ISIS 461756诱导的血管渗透性的PBS对照。
组4由用每周两次皮下施用保持4周的PBS处理的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在第14天时，将小鼠用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸ISIS 461756进行处理，每周两次皮下施用保持2周。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。然后，小鼠还被腹膜内注射施用30μg的HOE-140。组4用作用于抑制具有HOE-140的血管渗透性的阳性对照。
组5由8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成，所述小鼠用40mg/kg的带有未知鼠靶的5-10-5MOE缺口聚物的对照寡核苷酸ISIS 141923(CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC；SEQ ID NO:2246)进行处理，每周两次皮下施用保持4周。在第14天时，将小鼠用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸ISIS 461756进行处理，每周两次皮下施用保持2周。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组5用作用于卡托普利和ISIS 461756诱导的血管渗透性的对照组。
组6由8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成并且用40mg/kg的ISIS 482584进行处理，每周两次皮下施用保持4周。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组6用作用于测试PKK ASO对卡托普利诱导的血管渗透性的效应的实验处理组。
组7由8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成，所述小鼠用40mg/kg的ISIS 482584进行处理，每周两次皮下施用保持4周。在第14天时，将小鼠用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸ISIS 461756进行处理，每周两次皮下施用保持2周。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组7用作用于测试PKK ASO对卡托普利和ISIS 461756诱导的血管渗透性的效应的实验处理组。
然后，将所有的组注射30mg/kg的Evans蓝溶液至尾静脉。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚、耳朵以及肠。通过心脏穿刺采集血液样品。
表182
处理组
血管渗透性的量化
将从脚、结肠、耳朵以及肠收获的组织单独放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有耳朵和脚组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度并且呈现于表183中。显示血管性水肿的任何表现的小鼠吸收更多的染料并且因此表明高的OD值。
如表183所呈现的，与相应的PBS对照(组2和3)相比，用ISIS 482584处理阻止用卡托普利处理的小鼠(组6)和用卡托普利和ISIS 461756处理的小鼠(组7)的血管渗透性。与用对照寡核苷酸ISIS 141923处理的小鼠(组5)相比，大多数组织中的组6和7的小鼠中的血管渗透性的测量值也有所降低，其中血管渗透性由卡托普利和ISIS 461756进行诱导。将两个处理组(组6和7)的结肠和脚组织中的血管渗透性的测量值与基础水平做比较，如在仅用PBS处理的小鼠(组1)中所观察到的。将用ISIS 482584处理的小鼠中的血管渗透性的减少与用缓激肽2受体拮抗剂HOE140处理的用作此分析的阳性对照的小鼠中所见的做比较。
因此，PKK mRNA的反义抑制可能有利于治疗和预防血管渗透性，所述血管渗透性为HAE的症状。
表183
测量血管渗透性的Evans蓝染料的OD600nm
高分子量激肽原(HMWK)的量化
来自血液样本的HMWK的蛋白质印记量化呈现于图1。
如图1所示，与组6和7相比，来自组1和2的样品具有低水平的HMWK，表示组6和7中的血管渗透性是反向的。还如图1所示，如与组6和7相比，来自组1和2的样品具有增加的HMWK分解产物。因此，HMWK缺乏是由HMWK PKK分解成分解产物(包括缓激肽和HKa)所引起的。
实施例125：鼠PKK对小鼠的基础渗透性和卡托普利诱导的渗透性的反义抑制的体内效应
基础渗透性为首次未处理的小鼠的组织中出现的血管渗透性的水平。评估阻止血管渗透性(基础的或卡托普利诱导的)中的ISIS 482584的效应。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表184中。
组1由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持4周的PBS进行处理。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量血管渗透性的基础水平。
组2由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持4周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组2用作用于卡托普利诱导的血管渗透性的阴性对照组。
组3由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持4周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用30μg的HOE-140。组3用作用于抑制基础血管渗透性的阳性对照。
组4由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持4周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。小鼠还被腹膜内注射施用30μg的HOE-140。组4用作用于抑制卡托普利诱导的血管渗透性的阳性对照。
组5由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持4周的40mg/kg ISIS 482584进行处理。组5用作用于测试ISIS 482584对基础血管渗透性的效应的实验处理组。
组6由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持4周的40mg/kg ISIS 482584进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组6用作用于测试ISIS 482584对卡托普利诱导的血管渗透性的效应的实验处理组。
然后，将所有的组注射30mg/kg的Evans蓝溶液。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚、耳朵以及肠。
表184
处理组
血管渗透性的量化
将从脚、结肠、肠以及耳朵收获的组织单独放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有脚和耳朵组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度并且呈现于表185中。显示血管性水肿的任何表现的小鼠吸收更多的染料并且因此表明高的OD值。
如表185中所呈现的，与PBS对照(组5与组1)相比，用ISIS 482584处理的小鼠表明减小的基础血管渗透性。将通过用ISIS 482584处理所引起的基础血管渗透性的减小与用HOE-140处理(组3，其用作阳性对照)所引起的基础血管渗透性的减小做比较。与PBS对照(组6与组2)相比，用ISIS 482584处理的小鼠还展示减小的卡托普利诱导的血管渗透性。将通过用ISIS 482584处理所引起的卡托普利诱导的基础血管渗透性的减小与用HOE-140处理(组4，其用作阳性对照)所引起的基础血管渗透性的减小做比较。
表185
测量血管渗透性的Evans蓝染料的OD600nm
组号 处理 卡托普利 HOE-140 结肠 脚 肠 耳朵
1 PBS 否 否 0.27 0.08 0.23 0.06
2 PBS 是 否 0.61 0.08 0.24 0.01
3 PBS 否 是 0.18 0.06 0.21 0.03
4 PBS 是 是 0.29 0.03 0.14 0.00
5 ISIS 482584 否 否 0.19 0.07 0.22 0.04
6 ISIS 482584 是 否 0.37 0.05 0.22 0.00
实施例126：鼠PKK对卡托普利诱导的血管渗透性的反义抑制的剂量依赖性效应
评估ISIS 482584对卡托普利诱导的血管渗透性的变化剂量的效应。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表186中。
组1由4只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量血管渗透性的基础水平。
组2由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组2用作用于卡托普利诱导的血管渗透性的对照组。
组3由4只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。小鼠还被腹膜内注射施用30μg的Icatibant(HOE-140)。组4用作用于抑制卡托普利诱导的血管渗透性的阳性对照。
组4、5、6、7、8以及9各自由8只小鼠组成并且分别用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg(对应于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg或160mg/kg)的ISIS 482584处理，每周两次皮下施用保持3周。在处理期间结束时，所有组的小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组4-9用作用于测试ISIS 482584对卡托普利诱导的血管渗透性的变化剂量的效应的实验处理组。
然后，将所有的组注射30mg/kg的Evans蓝溶液于尾静脉中。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚、耳朵以及肠。通过心脏穿刺采集血液样品。
表186
处理组
血管渗透性的量化
将收获的组织放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有脚和耳朵组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度并且呈现于表187中。显示血管性水肿的任何表现的小鼠吸收更多的染料并且因此表明高的OD值。
如表187中所呈现的，与对应的PBS对照(组2)相比，用较高剂量的ISIS 482584处理的小鼠(组4、5以及6)具有减小水平的卡托普利诱导的血管渗透性。将这些处理组(组4和5)的小鼠的血管渗透性的减小与基础血管渗透性(如组1所示)以及用HOE-140(组3)处理的小鼠的水平做比较。
表187
测量血管渗透性的Evans蓝染料的OD600nm
血管泄漏的量化
将通过心脏穿刺抽出的血液立刻与3倍体积的冰冷乙醇混合。将溶液在15,000g下在4℃下离心20分钟以去除细胞碎片和沉淀的血浆蛋白质。进一步通过超滤通过10kDaMWCO过滤器对乙醇提取物进行纯化。然后，在OD620nm下测量乙醇提取血浆溶液的颜色强度。将结果以组1PBS对照的OD值的增加或减小百分比呈现于表188中。预期来自显示血管性水肿表现的小鼠的组织可从血浆泄露更多的染料并且因此，展示低的OD值，然而由于减小的血管泄露，处理组可以显示较高的OD值。与用卡托普利处理的PBS阴性对照(组2)，用160mg/kg/周和80mg/kg/周的ISIS 482584处理的小鼠(组4和5)展示较少的血管泄露。将来自组4和5的结果与用HOE-140处理的阳性对照(组3)做比较。
表188
相比于测量血管泄露的PBS基础对照的Evans蓝染料的OD620nm的百分比
组号 处理 剂量(mg/kg) 卡托普利 HOE-140 血浆
2 PBS - 是 否 -43
3 PBS - 是 是 5
4 ISIS 482584 160 是 否 91
5 ISIS 482584 80 是 否 40
6 ISIS 482584 40 是 否 -31
7 ISIS 482584 20 是 否 -26
8 ISIS 482584 10 是 否 -20
9 ISIS 482584 5 是 否 -23
实施例127：鼠PKK对小鼠的基础渗透性的反义抑制的剂量依赖性效应
评估ISIS 482584对基础血管渗透性的变化剂量的效应。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表189中。
组1由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量血管渗透性的基础水平。
组2由4只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用30μg的HOE-140。组2用作用于抑制基础血管渗透性的阳性对照。
组3、4、5、6、7以及8各自由8只小鼠组成并且分别用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg(对应于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg或160mg/kg)的ISIS 482584处理，每周两次皮下施用保持3周。组4-9用作用于测试ISIS482584对基础血管渗透性的变化剂量的效应的实验处理组。
然后，将所有的组注射30mg/kg的Evans蓝溶液于尾静脉中。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚和耳朵并且检测渗透性缺陷。通过心脏穿刺采集血液样品。
表189
处理组
血管渗透性的量化
将从脚、结肠以及耳朵收获的组织放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有脚和耳朵组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度并且呈现于表190中。较高的OD值与较高水平的渗透性相关。
如表190中所呈现的，与PBS对照(组1)相比，用ISIS 482584以所有剂量处理的小鼠(组3-8)的大多数组织表明减小的基础血管渗透性。将ISIS寡核苷酸处理的组的基础血管渗透性的减少与用HOE-140处理的阳性对照组(组2)中所显示的相同。
表190
测量血管渗透性的Evans蓝染料的OD600nm
组号 处理 剂量(mg/kg/周) HOE-140 结肠 脚 耳朵
1 PBS - 否 0.27 0.17 0.013
2 PBS - 是 0.24 0.09 0.047
3 ISIS 482584 160 否 0.25 0.11 0.019
4 ISIS 482584 80 否 0.24 0.09 0.014
5 ISIS 482584 40 否 0.27 0.11 0.011
6 ISIS 482584 20 否 0.26 0.11 0.009
7 ISIS 482584 10 否 0.31 0.10 0.015
8 ISIS 482584 5 否 0.32 0.11 0.009
血管泄漏的量化
将通过心脏穿刺抽出的血液立刻与3倍体积的冰冷乙醇混合。将溶液在15,000g下在4℃下离心20分钟以去除细胞碎片和沉淀的血浆蛋白质。进一步通过超滤通过10kDaMWCO过滤器对乙醇提取物进行纯化。然后，在OD620nm下测量乙醇提取血浆溶液的颜色强度。将结果以组1PBS对照的OD值的增加或减小百分比呈现于表191中。预期由于减小的血管泄露，处理组可以显示较高的OD值。与PBS阴性对照相比，ISIS寡核苷酸处理的组中的所有小鼠展示血管泄露显著减小。
表191
相比于测量血管泄露的PBS基础对照的Evans蓝染料的OD620nm的百分比
组号 处理 剂量(mg/kg/周) HOE-140 血浆
2.(N＝8) ISIS 482584 160 否 95
3.(N＝8) ISIS 482584 80 否 93
4.(N＝8) ISIS 482584 40 否 83
5.(N＝8) ISIS 482584 20 否 56
6.(N＝8) ISIS 482584 10 否 36
高分子量激肽原(HMWK)的量化
来自血液样本的HMWK的蛋白质印记量化呈现于图2和表192和193中。
如表192所示，与PBS对照相比，用482584处理的组具有较高水平的HMWK，以剂量依赖性方式增加。用PKK反义寡核苷酸处理导致HMWK的稳定性。因此，血管渗透性在ISIS482584处理的组中以剂量依赖性方式减小。如表193所示，与PBS对照相比，用ISIS 482584处理的组具有较少的HMWK分解产物，以剂量依赖性方式减小。因此，减小的HMWK是由HMWKPKK分解成分解产物(包括缓激肽和HKa)所引起的。数据如通过密度计量学所测量的呈现于强度单位中。
表192
通过密度计量学的HMWK的量化
组号 处理 剂量(mg/kg/周) 强度单位
1 PBS - 89
3 ISIS 482584 160 21358
4 ISIS 482584 80 7279
5 ISIS 482584 40 873
6 ISIS 482584 20 608
7 ISIS 482584 10 507
表193
通过密度计量学的HMWK分解产物的量化
组号 处理 剂量(mg/kg/周) 强度单位
1 PBS - 401738
3 ISIS 482584 160 19936
4 ISIS 482584 80 204482
5 ISIS 482584 40 388135
6 ISIS 482584 20 403360
7 ISIS 482584 10 414774
实施例128：靶向PKK和因子12的反义寡核苷酸对卡托普利诱导的小鼠的血管渗透性的组合治疗
在卡托普利诱导的血管渗透性模型中，将小鼠用变化剂量的靶向因子12的5-10-5MOE缺口聚物ISIS 410944(GCATGGGACAGAGATGGTGC；SEQ ID NO:2247)和ISIS 482584处理。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表194中。
组1由4只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量血管渗透性的基础水平。
组2由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组2用作用于卡托普利诱导的血管渗透性的对照组。
组3由4只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。小鼠还被腹膜内注射施用30μg的HOE-140。组3用作用于抑制卡托普利诱导的血管渗透性的阳性对照。
组4、5、6、7以及8各自由8只小鼠组成并且分别用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg(对应于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)的ISIS482584和ISIS 410944处理，每种每周两次皮下施用保持3周。在处理期间结束时，所有组的小鼠被腹膜内注射施用20μg的卡托普利。组4-8用作用于测试ISIS 410944和ISIS 482584对卡托普利诱导的血管渗透性的效应的实验处理组。
然后，将所有的组注射30mg/kg的Evans蓝溶液于尾静脉中。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚、耳朵以及肠。
表194
处理组
血管渗透性的量化
将从脚、结肠以及耳朵收获的组织放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有脚和耳朵组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度并且呈现于表195中。较高的OD值与较高水平的渗透性相关。
如表195中所呈现的，与PBS对照(组1)相比，用ISIS 482584和ISIS 410944的组合以所有剂量处理的小鼠(组3-8)的大多数组织表明减小的基础血管渗透性。将ISIS寡核苷酸处理的组的血管渗透性的减少与基础PBS对照(组1)以及用HOE-140处理的阳性对照组(组2)中所显示的相同。PKK和因子12反义寡核苷酸的组合导致渗透性的协同减少。可以预知，还观察到血管泄露的对应的协同减少。
表195
测量血管渗透性的Evans蓝染料的OD600nm
实施例129：靶向PKK和因子12的反义寡核苷酸对小鼠的基础血管渗透性的组合治疗
在基础血管渗透性模型中，将小鼠用靶向因子12的反义寡核苷酸ISIS 410944和ISIS 482584的变化剂量处理。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表196中。
组1由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量血管渗透性的基础水平。
组2由4只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。在处理期间结束时，小鼠被腹膜内注射施用30μg的HOE-140。组2用作用于抑制基础血管渗透性的阳性对照。
组3、4、5、6以及7各自由8只小鼠组成并且分别用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg(对应于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)的ISIS482584和ISIS 410944处理，每种每周两次皮下施用保持3周。组3-7用作用于测试ISIS410944和ISIS 482584对基础血管渗透性的效应的实验处理组。
然后，将所有的组注射30mg/kg的Evans蓝溶液于尾静脉中。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚、耳朵以及肠。
表196
处理组
组号 处理 剂量(mg/kg/周) HOE-140
1.(N＝8) PBS - 否
2.(N＝4) PBS - 是
3.(N＝8) ISIS 482584+ISIS 410944 80 否
4.(N＝8) ISIS 482584+ISIS 410944 40 否
5.(N＝8) ISIS 482584+ISIS 410944 20 否
6.(N＝8) ISIS 482584+ISIS 410944 10 否
7.(N＝8) ISIS 482584+ISIS 410944 5 否
血管渗透性的量化
将从脚、肠、结肠以及耳朵收获的组织放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有脚和耳朵组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度并且呈现于表197中。较高的OD值与较高水平的渗透性相关。
如表197中所呈现的，与PBS对照(组1)相比，用ISIS 482584和ISIS 410944的组合以所有剂量处理的小鼠(组2-7)的大多数组织表明减小的基础血管渗透性。将ISIS寡核苷酸处理的组的血管渗透性的减少与用HOE140处理的阳性对照组(组2)中所显示的相同。PKK和因子12反义寡核苷酸的组合导致渗透性的协同减少。可以预知，还观察到血管泄露的对应的协同减少。
表197
测量血管渗透性的Evans蓝染料的OD600nm
实施例130：通过ISIS 482584对因子12蛋白活化的抑制
评估PKK mRNA对因子12蛋白活化的反义抑制的效应。
处理
用于此分析的各种处理组呈现于表198中。
组1由8只小鼠组成并且用每周两次皮下施用保持3周的PBS进行处理。未对用作对照组的组1施用其他处理以测量因子12活化。
组2、3、4、5以及6各自由8只小鼠组成并且分别用2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg(对应于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)的ISIS482584处理，每周两次皮下施用保持3周。组2-6用作用于测量ISIS 482584对因子12活化的效应的处理组。
在处理期间结束时，基于血浆中的因子12的酰胺分解测定，从小鼠收获血浆用于因子12a。
表198
处理组
组号 处理 剂量(mg/kg/周)
1.(N＝8) PBS -
2.(N＝8) ISIS 482584 80
3.(N＝8) ISIS 482584 40
4.(N＝8) ISIS 482584 20
5.(N＝8) ISIS 482584 10
6.(N＝8) ISIS 482584 5
用于血浆中的因子12活化的测定
将血浆(5μL)添加至85μL带有1ug/ml硫酸葡聚糖(500kDa)的PBS的96孔聚丙烯微板中并且将溶液在室温下温育5分钟。添加FXIIa(10μL的2mM溶液)和0.2mMKALLISTOPTM溶液并且在405nm下测量动力学吸光度。在吸光度累积的线性脉冲相位中，测量因子12活化。结果以PBS对照样品中所测量的因子12活化的百分比呈现于表199中。如表199中所观察的，通过ISIS 482584对PKK的抑制导致通过其底物减小因子12的活化，意味着PKK为适当的因子12活化所需的。
表199
相比于PBS对照的因子12活化的百分比
剂量(mg/kg/周) ％F12活化
80 14
40 24
20 47
10 63
5 82
实施例131：鼠PKK对C1-INH反义寡核苷酸诱导的血管渗透性的反义抑制的体内效应
通过用靶向小鼠C1抑制剂mRNA的反义寡核苷酸ISIS 461756诱导的血管渗透性，增加了小鼠的血管渗透性并且复制遗传性血管性水肿的病理。评估ISIS 482584对这个模型的效应。
处理
用每周两次皮下施用保持3周(80mg/kg的周剂量)的40mg/kg ISIS 482584处理8只小鼠的组。用每周两次皮下施用保持3周(80mg/kg的周剂量)的40mg/kg对照寡核苷酸ISIS 141923处理8只小鼠的第二个组。用PBS处理8只小鼠的第三个组，每周两次皮下施用保持3周。在第14天时，用每周两次皮下施用保持3周(25mg/kg的周剂量)的12.5mg/kg ISIS461756处理所有的组。用PBS处理小鼠的对照组，每周两次皮下施用保持3周，但是不施用ISIS 461756。
在处理期间结束时，所有的组被注射30mg/kg的Evans蓝溶液于尾静脉中。在Evans蓝溶液施用之后30min，处死小鼠，并且收获结肠、脚、耳朵以及肠。还收获肝脏用于RNA分析。
RNA分析
从肝脏分离RNA用于C1-INH和PKK mRNA的RT-PCR分析。C1-INH的引物探针集为RTS3218(正向序列GAGTCCCCCAGAGCCTACAGT，在本文中命名为SEQ ID NO:2234；反向序列TGTCATTTGTTATTGTGATGGCTACA，在本文中命名为SEQ ID NO:2235；探针序列CTGCCCTCTACCTGGCCAACAACCA，在本文中命名为SEQ ID NO:2236)。PKK的引物探针集为RTS3287(正向序列ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC，在本文中命名为SEQ ID NO:2237；反向序列GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT，在本文中命名为SEQ ID NO:2238；探针序列AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC，在本文中命名为SEQ ID NO:2239)。数据以相比于未用ISIS461756处理的PBS对照的抑制百分比呈现于表200中。数据表示ISIS 461756显著减小了C1-INH mRNA表达并且用ISIS 482584的处理显著减小了PKK表达。
表200
相比于未处理的PBS对照，用ISIS 461756处理的小鼠的mRNA表达的抑制百分比
血管渗透性的量化
将从脚、结肠以及肠收获的组织放入甲酰胺溶液中过夜以渗出Evans蓝染料。将含有脚组织的甲酰胺溶液加热至55℃并且放置过夜。然后，在OD600nm下测量染料输注的甲酰胺溶液的颜色强度。数据以相比于未用ISIS 461756处理的PBS对照的增加或减小百分比呈现于表201中。数据表示用ISIS 482584处理阻止由ISIS 461756诱导的血管渗透性。
表201
相比于未处理的PBS对照，用ISIS 461756处理的小鼠的血管渗透性的变化百分比
处理 结肠 脚 肠
PBS 13 70 27
ISIS 141923 2 80 14
ISIS 482584 -23 2 -25
实施例132：在FeCl3诱导的下腔静脉血栓模型中，鼠PKK的反义抑制的体内效应
在FeCl3诱导的下腔静脉血栓小鼠模型中，评估在体外和体内展示显著PKK抑制的ISIS 482584。
处理
用10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 482584处理8只雄性BALB/c小鼠的三个组，每周两次皮下施用保持3周(20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg的周剂量)。用PBS各自处理12只BALB/c小鼠的两个对照组，每周两次皮下施用保持3周。在反义寡核苷酸或PBS的最后剂量之后两天，用混合有10mg/kg赛拉嗪的150mg/kg***麻醉来自所有组的小鼠，通过腹膜内注射施用。在除第一对照组之外的所有组的麻醉小鼠中，用FeCl3诱导血栓形成。
在进行FeCl3处理的小鼠中，通过在腔静脉上直接施加用10％FeCl3溶液预饱和的一片滤纸(2x4mm)诱导血栓形成。暴露3分钟之后，去除滤纸。施加滤纸三十分钟之后，将含有血栓的固定长度的静脉切割下来用于血小板分析。收集肝脏用于RNA分析。
血小板组合物的量化
使用血小板因子-4(PF-4)的实时PCR量化来定量腔静脉中的血小板，作为血栓形成的量度。使用小鼠引物探针集mPF4_LTS_00086(正向序列AGACCCATTTCCTCAAGGTAGAACT，在本文中命名为SEQ ID NO:2240；反向序列CGCAGCGACGCTCATG，在本文中命名为SEQ IDNO:2241；探针序列TCTTTGGGTCCAGTGGCACCCTCTT，在本文中命名为SEQ ID NO:2242)测量PF-4mRNA水平。结果以相比于两个PBS处理的对照组的ISIS寡核苷酸处理的小鼠中的PF-4的百分比呈现。如表202所示，用ISIS 482584处理导致相比于PBS对照显著减小的PF-4。因此，由本文提供的化合物引起的PKK减小可用于抑制血栓形成。
表202
通过实时PCR量化FeCl3诱导的静脉血栓模型中的PF-4的血栓形成的分析
实施例133：尾部出血测定的鼠PKK反义抑制的体内作用
测量尾部出血以观察用ISIS 482584处理是否会引起小鼠的过量出血或流血。
处理
用10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 482584处理10只雄性BALB/c小鼠的组，每周两次皮下施用保持3周(20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg的周剂量)。用PBS处理8只BALB/c小鼠的对照组，每周两次皮下施用保持3周。
尾部出血测定
在最后处理ISIS寡核苷酸或PBS之后两天，将小鼠放入尾部出血室中。将小鼠在具有异氟烷的室中麻醉。然后，用无菌剪子把尾部(距顶端大约4mm)剪切成小片。将剪切的尾部立刻放入填充有升温至37℃的大约10mL的0.9％NaCl缓冲溶液的15mL Falcon管中。经过40分钟后，收集血液。在出血之前和之后，均称量盐水填充的管。结果在表203中提供。
用ISIS 482584处理不会显著影响出血。这些数据表明本文提供的化合物的出血性潜能低。这些数据连同实施例19中提供的结果一起表明本文所述的化合物对PKK的抑制可用于提供无相关出血风险的抗血栓形成活性。
表203
用ISIS 482584处理之后的尾部出血测定
实施例134：在FeCl3诱导的肠系膜血栓模型中，鼠PKK的反义抑制的体内效应
在FeCl3诱导的肠系膜血栓小鼠模型中评估ISIS 482584。
处理
用每周两次皮下施用保持3周(80mg/kg的周剂量)的40mg/kg ISIS 482584处理6-8只Swiss-Webster小鼠的组。用PBS处理6只Swiss-Webster小鼠的对照组，每周两次皮下施用保持3周。在最后剂量的反义寡核苷酸或PBS之后两天，用混合有25mg/kg赛拉嗪的75mg/kg***通过腹膜内注射施用，麻醉来自所有组的小鼠。
以5mg/kg的剂量皮下注射Rhodamine 6G染料以使血小板着色。通过尾部静脉注射，以1mg/kg的剂量注射Alexa-647标记的抗纤维蛋白原抗体以使血纤维蛋白着色。通过中间切口打开腹部。将内脏肠系膜分散于玻璃盖片上并且在显微镜下通过观察定位肠系膜小动脉(70-120μm)。通过在靶血管上直接施加用6％FeCl3溶液预饱和的棉线(2x0.3mm)诱导血栓形成。暴露三分钟之后，去除线并且通过具有适当滤波器的荧光显微镜(OlympusFluoView 1000激光扫描共焦显微镜)记录染料的颜色强度70min。
对照和处理组中的血小板聚集的结果呈现于表204中，其以任意单位(a.u.)表示。与用PBS处理的小鼠相比，用ISIS 482584处理的小鼠中的血小板聚集以80mg/kg/周的剂量减小。对照和处理组中的血纤维蛋白形成的结果呈现于表205中，其也以任意单位(a.u.)表示。与用PBS处理的小鼠相比，用ISIS 482584处理的小鼠中的血纤维蛋白形成以80mg/kg/周的剂量减小。因此，这些结果表明ISIS 482584抑制血栓形成。
表204
通过实时测量FeCl3诱导的肠系膜血栓模型中的荧光强度(a.u.)的血小板聚集的分析
时间(秒) PBS 80mg/kg/周
752 54 74
1018 315 11
1284 485 7
1550 654 0
1815 1079 0
2081 1164 0
2347 1452 0
2613 1440 38
2879 1689 148
3144 1716 129
3410 1845 169
3676 1865 131
3944 2055 87
表205
通过实时测量FeCl3诱导的肠系膜血栓模型中的荧光强度(a.u.)的血纤维蛋白形成的分析
时间(秒) PBS 80mg/kg/周
752 9 54
1018 86 7
1284 203 1
1550 319 10
1815 521 16
2081 598 15
2347 831 61
2613 959 88
2879 1157 141
3144 1236 150
3410 1374 173
3676 1629 160
3944 1822 128
实施例135：在狭窄诱导的下腔静脉血栓模型中，鼠PKK的反义抑制的体内效应
在狭窄诱导的下腔静脉(IVC)血栓模型中评估ISIS 482584。减小的血液流和内皮损害为这个模型(也称为St.Tomas模型)的标志。
处理
用5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS 482584处理6-8只BALB/c小鼠的四个组，每周两次皮下施用保持3周(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg的周剂量)。用PBS处理8只BALB/c小鼠的对照组，每周两次皮下施用保持3周。在施用最后剂量的反义寡核苷酸或PBS之后两天，用2.5％的吸入剂异氟烷麻醉来自所有组的小鼠。通过低于左肾静脉的中线腹部切口暴露小鼠的IVC并且通过钝性分离自腹部主动脉分开。将6-0丝质带(Ethicon,UK)放置于血管后面仅低于左肾静脉并且将金属4-0缝合线(Ethicon,UK)纵向放在IVC上方以把丝质带拴在底部。然后，去除金属缝合线。将两个神经血管手术夹(BraunMedical Inc,PA)在其被去除之后各自放在低于连接的两个单独的位置20秒。然后，替换腹腔内容物并且关闭腹部。24小时后，暴露并且针对血栓形成检查IVC。收集所有形成的血栓并且在10％的***中固定24小时。
称量血栓并且结果呈现于表206中，其以毫克表示。如所述结果所表明的，用增加剂量的ISIS 482584处理导致血栓重量相应的减小。结果显示PKK的反义抑制可用于抑制血栓形成。
表206
狭窄诱导的IVC血栓模型中的血栓重量
实施例136：用包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸对鼠PKK的抑制
测试以下表中所示的ISIS 482584和ISIS 722059对鼠PKK mRNA的体内效应。
表207
包含GalNAc3缀合物基团的ISIS 722059和其母体ISIS 482584
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)；并且“o”指示-O-P(＝O)(OH)-。上标“m”指示5-甲基胞嘧啶。“GalNAc3-7”的结构在实施例48中示出。
处理
将四只C57Bl/6J-Tyrc-2J小鼠的四个组各自用5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg或40.0mg/kg的ISIS 482584处理，每周两次皮下施用保持3周(10.0mg/kg、20.0mg/kg、40.0mg/kg或80.0mg/kg的周剂量)。用1.0mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或8.0mg/kg的ISIS722059处理四只BALB/c小鼠的四个组，每周两次皮下施用保持3周(2.0mg/kg、4.0mg/kg、8.0mg/kg或16.0mg/kg的周剂量)。用PBS处理四只BALB/c小鼠的对照组，每周两次皮下施用保持3周。在最后剂量的反义寡核苷酸或PBS之后三天，将来自所有组的小鼠用在空气中占2.5％的汽化了的异氟烷麻醉用于诱导，接着通过头锥通过1-2％的异氟烷用于维护。这之后进行颈椎脱位法。安乐死之后，收集肝脏用于RNA分析。
RNA分析
自肝脏组织提取RNA用于PKK的实时PCR分析。使用小鼠引物探针集(正向序列ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC，在本文中命名为SEQ ID NO:2231；反向序列GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT，在本文中命名为SEQ ID NO:2232；探针序列AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC，在本文中命名为SEQ ID NO:2233)测量PKK mRNA水平。结果呈现为相对于PBS对照的PKK的抑制百分比。如以下表208所示，包含GalNAc3缀合物基团的Isis 722059在减小PKK mRNA方面比母体反义寡核苷酸Isis 482584显著更有效。对于小鼠和人两者中的许多靶基因而言，这个结果与以上实施例中的结果一致，其中包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸比其母体反义寡核苷酸显著更有效。因此，预期包含GalNAc3缀合物基团的人PKK反义寡核苷酸同样在减小人PKK mRNA方面比不包含缀合物基团的其母体反义寡核苷酸显著更有效。
表208
相对于PBS对照的肝中PKK mRNA的抑制百分比
实施例137：用包含GalNAc3缀合物基团的反义寡核苷酸对人PKK的抑制
测试以下表中所示的ISIS 546254和ISIS 721744对人PKK mRNA的体内效应。
表209
包含GalNAc3缀合物基团的SIS 721744和其母体ISIS 546254
下标：“e”指示2’-MOE修饰核苷；“d”指示β-D-2’-脱氧核糖核苷；“s”指示硫代磷酸酯核苷间键联(PS)；并且“o”指示磷酸二酯核苷间键联(PO)。“GalNAc3-7”的结构在实施例48中示出并且“GalNAc3-7a-o’”指示其中分解部分为-O-P(＝O)(OH)-的GalNAc3-7缀合物基团。
根据制造商说明书，使用包括基质细胞的原代人肝细胞共培养物以在体外模拟肝脏的生理微环境(HepatoPac试剂盒HPHU-TX-96S,Hepregen,Medford,MA)。在不存在任何转染试剂的情况下，将一定浓度列于下表中的Isis寡核苷酸或PBS添加至每个孔中。96小时后，细胞被裂解并且RNA从细胞分离。使用引物探针集RTS3454通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平并且归一化为RNA含量，如通过所测量的。结果以相对于PBS处理的细胞的PKK mRNA水平的抑制百分比呈现于下表中，并且使用4参数逻辑模型(JMP软件,Cary,NC)计算IC50值。结果显示，在其中没有使用试剂或电穿孔技术来人工促进寡核苷酸进入到细胞中的自由摄取条件下，包含GalNAc缀合物的寡核苷酸比不包含GalNAc缀合物的母体寡核苷酸显著更有效。
表210
相对于PBS对照的PKK mRNA的抑制百分比

Claims (218)

1.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:30-2226的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的所述核碱基序列。
2.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:570的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的所述核碱基序列。
3.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:705的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的所述核碱基序列。
4.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含SEQ ID NO:1666的核碱基序列的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列。
5.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO:570的核碱基序列。
6.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO:705的核碱基序列。
7.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成并且具有SEQ ID NO:1666的核碱基序列。
8.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：62、72、103、213、312、334-339、344、345、346、348、349、351、369、373、381、382、383、385、387-391、399、411、412、414、416、444、446-449、452、453、454、459、460、462-472、473、476、477、479、480、481、484、489-495、497、500、504、506、522、526、535、558、559、560、564、566、568-571、573、576、577、578、587、595、597-604、607、608、610、613、615、618、619、622、623、624、633、635、636、638、639、640、642、643、645、652、655-658、660、661、670、674-679、684、685、698、704、705、707、708、713、716、717、728、734、736、767、768、776、797、798、800、802、810、815、876、880、882、883、886、891、901-905、908-911、922、923、924、931、942、950-957、972、974、978、979、980、987-991、1005、1017-1021、1025、1026、1029、1030、1032、1034、1035、1037、1040、1041、1045、1046、1051、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1076、1087、1089、1111、1114、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1181、1182、1187、1196、1200、1214、1222、1267、1276、1277、1285、1286、1289、1290、1291、1303、1367、1389、1393、1398-1401、1406、1407、1408、1411、1419-1422、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1439、1440、1443、1444、1451、1452、1471、1516、1527、1535、1537、1538、1539、1540、1541、1563、1564、1567、1568、1616、1617、1623、1629、1664、1665、1666、1679、1687、1734、1804、1876、1886、1915、2008、2018、2100、2101、2115以及2116。
9.如权利要求8所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现PKK的至少80％的mRNA抑制。
10.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：62、72、103、213、334-339、344、346、348、349、351、381、382、383、385、389、390、391、446、448、452、453、454、466-473、476、481、484、491、492、494、495、497、504、526、558、559、566、568-571、576、578、587、595、597、598、600-604、607、610、613、618、619、624、635、638、639、645、652、656、657、658、660、674、675、676、684、698、704、705、707、713、716、768、876、880、901-905、908-911、922、923、924、931、942、951、954-957、972、974、978、979、987、988、990、1005、1019、1020、1021、1025、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1111、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1200、1222、1267、1285、1290、1291、1303、1367、1398、1399、1401、1406、1408、1411、1419、1420、1421、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1440、1443、1444、1451、1537-1540、1563、1616、1679、1687、1804、2008、2101、2115以及2116。
11.如权利要求10所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现PKK的至少85％的mRNA抑制。
12.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：334、346、351、382、390、391、446、448、452、453、468、469、470、471、472、476、481、491、495、504、558、566、568、570、571、578、587、597、598、600、604、613、635、638、645、656、658、660、674、675、684、704、705、880、901-905、909、922、931、951、954、956、990、1005、1020、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1075、1111、1125、1133、1153、1200、1267、1291、1303、1398、1399、1401、1406、1420、1426、1430、1431、1434、1435、1436、1440、1443、1451、1537-1540、2115以及2116。
13.如权利要求12所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现PKK的至少90％的mRNA抑制。
14.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：334、391、448、468、469、568、570、598、635、658、674、684、705、901、903、904、922、990、1267、1291、1420、1430、1431、1434、1435、1436、1537、1538以及1540。
15.如权利要求14所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现PKK的至少95％的mRNA抑制。
16.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：334、338、346、349、382、383、390、448、452、453、454、495、526、559、570、587、598、635、660、705、901、903、904、908、923、931、955、974、988、990、1020、1039、1040、1111、1117、1267、1291、1349、1352、1367、1389、1393、1399、1401、1408、1411、1426、1499、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1624、1643、1661、1665、1666、1673、1679、1695、1720、1804、1817、1876、1881、1886、1940、1947、2008、2018、2019、2031、2044、2100、2101、2115以及2116。
17.如权利要求16所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现0.4或更小的IC50(μM)。
18.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：334、346、349、382、453、454、495、526、570、587、598、635、660、901、903、904、931、955、990、1020、1111、1267、1349、1352、1367、1389、1399、1408、1411、1426、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1643、1661、1665、1666、1673、1695、1804、1876、1881、2019、2044、2100、2101、2115以及2116。
19.如权利要求18所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现0.3或更小的IC50(μM)。
20.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：334、346、382、453、495、526、570、587、598、635、901、904、931、955、1020、1111、1349、1352、1389、1426、1516、1535、1544、1548、1564、1569、1598、1616、1617、1665、1666、1804、1876、1881、2019、2044、2101以及2116。
21.如权利要求20所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现0.2或更小的IC50(μM)。
22.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且具有包含以下各项SEQ ID NO的核碱基序列中的任一个的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15或至少16个连续核碱基的所述核碱基序列：334、495、587、598、635、1349、1352、1389、1516、1544、1548、1569、1598、1617、1665、1666、1804、1881以及2019。
23.如权利要求22所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸实现小于0.2的IC50(μM)。
24.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基27427-27466的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
25.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基33183-33242的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
26.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基30570-30610的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
27.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基27427-27521的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
28.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基33085-33248的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
29.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基30475-30639的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
30.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基27362-27525的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
31.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基33101-33241的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
32.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与SEQ ID NO:10的核碱基30463-30639的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个所述连续核碱基的核碱基序列。
33.一种化合物，其包含修饰寡核苷酸和缀合物基团，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个连接核苷组成，并且包括包含与PKK核酸的外显子9、外显子12或外显子14的等长部分互补的至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
34.如权利要求24-33所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的所述核碱基序列与SEQID NO:10至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
35.如任一前述权利要求所述的化合物，所述化合物由单链修饰寡核苷酸和缀合物基团组成。
36.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中至少一个核苷间键是修饰的核苷间键。
37.如权利要求36所述的化合物，其中至少一个修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
38.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少1个磷酸二酯核苷间键联。
39.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少2个磷酸二酯核苷间键联。
40.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少3个磷酸二酯核苷间键联。
41.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少4个磷酸二酯核苷间键联。
42.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少5个磷酸二酯核苷间键联。
43.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少6个磷酸二酯核苷间键联。
44.如权利要求36所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少7个磷酸二酯核苷间键联。
45.如权利要求38-44中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷间键联选自磷酸二酯核苷间键联和硫代磷酸酯核苷间键联。
46.如权利要求37所述的化合物，其中每个核苷间键联是硫代磷酸酯键联。
47.如任一前述权利要求所述的化合物，其中至少一个核苷包含修饰的核碱基。
48.如权利要求39所述的化合物，其中所述修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
49.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个修饰的糖。
50.如权利要求49所述的化合物，其中所述修饰的糖为2’修饰的糖、BNA或THP。
51.如权利要求50所述的化合物，其中所述修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲基、限制性乙基、LNA或3’-氟代-HNA中的任一个。
52.如任一前述权利要求所述的化合物，所述化合物包含至少一个2’-O-甲氧基乙基核苷、2’-O-甲基核苷、限制性乙基核苷、LNA核苷或3’-氟代-HNA核苷。
53.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸包含：
由10个连接脱氧核苷组成的缺口区段；
由5个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由5个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段定位在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
54.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。
55.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。
56.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由18个连接核苷组成。
57.一种化合物，其由缀合物基团和根据下式的修饰寡核苷酸组成：Tes Ges mCes AesAes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
58.一种化合物，其由缀合物基团和根据下式的修饰寡核苷酸组成：mCes mCes mCesmCes mCes Tds Tds mCds Tds Tds Tds Ads Tds Ads Gds mCes mCes Aes Ges mCe；其中
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶；
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
59.一种化合物，其由缀合物基团和根据下式的修饰寡核苷酸组成：mCes Ges Aks TdsAds Tds mCds Ads Tds Gds Ads Tds Tds mCks mCks mCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶；
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰核苷，
k＝cEt修饰核苷，
d＝2’-脱氧核苷，并且
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
60.一种化合物，其由缀合物基团和根据下式的修饰寡核苷酸组成：
61.一种化合物，其由缀合物基团和根据下式的修饰寡核苷酸组成：
62.一种化合物，其由缀合物基团和根据下式的修饰寡核苷酸组成：
63.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的5’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。
64.如权利要求1至62中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团在所述修饰寡核苷酸的3’末端处连接至所述修饰寡核苷酸。
65.如权利要求1-64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好一个配体。
66.如权利要求1-64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好两个配体。
67.如权利要求1-64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含三个或更多个配体。
68.如权利要求1-64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含恰好三个配体。
69.如权利要求65-68中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：多糖、修饰的多糖、甘露糖、半乳糖、甘露糖衍生物、半乳糖衍生物、D-吡喃甘露糖、L-吡喃甘露糖、D-***糖、L-半乳糖、D-呋喃木糖、L-呋喃木糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-半乳糖、L-半乳糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、葡萄糖胺、唾液酸、α-D-半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖、2-脱氧-2-甲基氨基-L-吡喃葡萄糖、4,6-二脱氧-4-甲酰氨基-2,3-二-O-甲基-D-吡喃甘露糖、2-脱氧-2-磺氨基-D-吡喃葡萄糖、N-乙醇酰基-α-神经氨酸、5-硫代-β-D-吡喃葡萄糖、2,3,4-三-O-乙酰基-1-硫代-6-O-三苯甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷甲酯、4-硫代-β-D-吡喃半乳糖、3,4,6,7-四-O-乙酰基-2-脱氧-1,5-二硫代-α-D-吡喃葡庚糖苷乙酯、2,5-脱水-D-阿洛糖腈、核糖、D-核糖、D-4-硫代核糖、L-核糖、L-4-硫代核糖。
70.如权利要求69所述的化合物，其中每个配体为N-乙酰基半乳糖胺。
71.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
72.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
73.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
74.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
75.如权利要求1至64中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
76.如权利要求64至70中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含至少一个磷连接基团或中性连接基团。
77.如权利要求1至76中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的结构：
其中n为1至12；并且
其中m为1至12。
78.如权利要求1至76中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：
其中L为磷连接基团或中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
79.如权利要求78所述的化合物，其中缀合物基团包含具有选自以下的结构的系链：
其中Z2为H或CH3；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
80.如权利要求64至70中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团具有其结构选自以下的系链：
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
81.如权利要求1至80中任一项所述的化合物，其中所述缀合物基团共价连接至所述修饰寡核苷酸。
82.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
83.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中：
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分
C为缀合物接头
D为支链基团
每个E为系链；
每个F为配体；
每个n独立地为0或1；并且
q为1与5之间的整数。
84.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
85.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
86.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
C为缀合物接头；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
87.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
88.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
B为可裂解部分；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
89.如权利要求1至81中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有由下式表示的结构：
其中
A为所述修饰寡核苷酸；
D为支链基团；
每个E为系链；
每个F为配体；并且
q为1与5之间的整数。
90.如权利要求82至89中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个L独立地为磷连接基团或中性连接基团；并且
每个n独立地为1至20。
91.如权利要求83至90中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
92.如权利要求83至90中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：
93.如权利要求83至90中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
94.如权利要求83至90中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
95.如权利要求83至90中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
96.如权利要求83至96中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含吡咯烷。
97.如权利要求83至96中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含吡咯烷。
98.如权利要求83至98中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含PEG。
99.如权利要求83至99中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含酰胺。
100.如权利要求83至99中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含至少两个酰胺。
101.如权利要求83至99中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头不包含酰胺。
102.如权利要求83至102中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含聚酰胺。
103.如权利要求83至103中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含胺。
104.如权利要求83至104中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含一个或多个二硫键。
105.如权利要求83至105中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头包含蛋白质结合部分。
106.如权利要求106所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分包含脂质。
107.如权利要求106所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-二-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、维生素(例如，叶酸、维生素A、维生素E、生物素、吡哆醛)、肽、碳水化合物(例如，单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖、多糖)、溶内体组分、类固醇(例如，熊果醇、龙舌兰皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如，三萜烯，例如萨洒皂角苷配基、木栓酮、表木栓醇衍生的石胆酸)或阳离子脂质。
108.如权利要求106所述的化合物，其中所述蛋白质结合部分选自以下：C16至C22长链饱和或不饱和的脂肪酸、胆固醇、胆酸、维生素E、金刚烷或1-五氟丙基。
109.如权利要求82至109中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20；并且p为1至6。
110.如权利要求82至110中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为1至20。
111.如权利要求82至110中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
112.如权利要求82至110中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中n为1至20。
113.如权利要求82至110中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
114.如权利要求82至110中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
115.如权利要求82至110中任一项所述的化合物，其中所述缀合物接头具有以下结构：
116.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
117.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构之一：
其中A1各自独立地为O、S、C＝O或NH；并且
每个n独立地为1至20。
118.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
119.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
120.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
121.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
122.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含醚。
123.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
每个n独立地为1至20；并且
m为2至6。
124.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
125.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团具有以下结构：
126.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：
其中每个j为1至3的整数；并且
其中每个n为1至20的整数。
127.如权利要求82至116中任一项所述的化合物，其中所述支链基团包含：
128.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中L选自磷连接基团和中性连接基团；
Z1为C(＝O)O-R2；
Z2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；
R2为H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基；并且
每个m1独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m1大于0。
129.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中Z2为H或CH3；并且
每个m2独立地为0至20，其中对于每个系链，至少一个m2大于0。
130.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中n为1至12，并且
其中m为1至12。
131.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含乙二醇。
132.如权利要求82至128或130中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含酰胺。
133.如权利要求82至128或130中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含聚酰胺。
134.如权利要求82至128或130中任一项所述的化合物，其中至少一个系链包含胺。
135.如权利要求82至128或130中任一项所述的化合物，其中至少两个系链彼此不同。
136.如权利要求82至128或130中任一项所述的化合物，其中所有系链彼此相同。
137.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
其中每个n独立地为1至20；并且
每个p为1至约6。
138.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链选自以下：
139.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20。
140.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中每个系链具有以下结构：
141.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：
其中每个n独立地为0、1、2、3、4、5、6或7。
142.如权利要求82至128中任一项所述的化合物，其中所述系链具有选自以下的结构：
143.如权利要求140至143中任一项所述的化合物，其中所述配体为半乳糖。
144.如权利要求140至143中任一项所述的化合物，其中所述配体为甘露糖-6-磷酸。
145.如权利要求140至143中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：
其中R1各自选自OH和NHCOOH。
146.如权利要求140至143中任一项所述的化合物，其中每个配体选自以下：
147.如权利要求140至143中任一项所述的化合物，其中每个配体具有以下结构：
148.如权利要求140至143中任一项所述的缀合反义化合物，其中每个配体具有以下结构：
149.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含细胞靶向部分。
150.如权利要求150所述的化合物，其中所述缀合物基团包含具有以下结构的细胞靶向部分：
其中每个n独立地为1至20。
151.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
152.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20。
153.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
154.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
155.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
156.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
157.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
158.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
159.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
160.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
161.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
162.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
163.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
164.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
165.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
166.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
167.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
168.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
169.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
170.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
171.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
172.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
173.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
174.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
175.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分包含：
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
176.如权利要求150所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
177.如权利要求150所述的化合物，其中所述细胞靶向部分具有以下结构：
其中每个Y选自O、S、取代或未取代的C1-C10烷基、氨基、取代的氨基、叠氮基、烯基或炔基。
178.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
179.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
180.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
181.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
182.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含选自以下的可裂解部分：磷酸二酯、酰胺或酯。
183.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含磷酸二酯可裂解部分。
184.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团不包含可裂解部分，并且其中所述缀合物基团包含处于所述缀合物基团与所述寡核苷酸之间的硫代磷酸酯键联。
185.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酰胺可裂解部分。
186.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含酯可裂解部分。
187.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
188.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
189.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
190.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中每个n独立地为1至20；
Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；
Z为H或连接的固体载体；并且
Bx为杂环碱基部分。
191.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
192.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
193.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
194.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
195.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
196.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
197.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
198.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
199.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
200.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
201.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
202.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
203.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
204.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述缀合物基团包含：
其中Q13为H或O(CH2)2-OCH3；
A为所述修饰寡核苷酸；并且
Bx为杂环碱基部分。
205.如任一前述权利要求所述的化合物，其中Bx选自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
206.如任一前述权利要求所述的化合物，其中Bx为腺嘌呤。
207.如任一前述权利要求所述的化合物，其中Bx为胸腺嘧啶。
208.如任一前述权利要求所述的化合物，其中Q13为O(CH2)2-OCH3。
209.如任一前述权利要求所述的化合物，其中Q13为H。
210.一种化合物，其由根据以下的修饰寡核苷酸组成：
211.一种组合物，其包含如任一前述权利要求所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。
212.一种前药，其包含如权利要求1至212中任一项所述的化合物。
213.一种组合物，其包含如任一前述权利要求所述的化合物或其盐、和药学上可接受的载体或稀释剂中的至少一种。
214.一种方法，其包括向动物施用如任一前述权利要求所述的化合物或组合物。
215.如权利要求215所述的方法，其中所述动物为人。
216.如权利要求215或216所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗或减轻PKK相关疾病、病症或病状。
217.如权利要求217所述的方法，其中所述PKK相关疾病、病症或病状为遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑的血管性水肿、眼水肿、黄斑水肿、脑水肿、血栓、栓、血栓栓塞、深静脉血栓、肺栓塞、心肌梗塞、中风或梗塞。
218.任一前述权利要求所述的化合物或组合物用于制造用于治疗炎性疾病或血栓栓塞疾病的药物的用途。
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