因此,本发明的第一个目的在于提供编码人心钠素或其衍生物的核苷酸序列和编码人白细胞介素2衍生物的核苷酸序列的融合基因,该融合基因***合适的表达载体能高效表达心钠素或其衍生物和白细胞介素2衍生物的融合蛋白。
本发明的第二个目的在于提供心钠素或其衍生物与白细胞介素2衍生物的融合蛋白。
本发明的第三个目的在于提供一种编码人心钠素衍生物的DNA序列及由该序列编码的人心钠素衍生物,所述的DNA序列为上述融合基因的一部分,而所述的人心钠素衍生物为上述的融合蛋白经内肽酶凝血酶切断后所得的产物。该心钠素衍生物在活性和稳定性方面强于原来的28肽ANP。
本发明的第四个目的在于提供一种编码人白细胞介素2衍生物的DNA序列及由该序列编码的人白细胞介素2衍生物,所述的DNA序列为上述融合基因的一部分,而所述的人白细胞介素衍生物为上述的融合蛋白经内肽酶凝血酶切断后所得的产物。
本发明的第五个目的在于提供包含上述融合基因的高效表达载体及构建该载体的方法。
本发明的第六个目的在于提供含有所述的表达载体的能够生产三种活性多肽的工程菌,即“一菌三素”工程菌。
本发明的第七个目的在于上述的融合蛋白及人心钠素衍生物和人白细胞衍生物在制药中的应用。
根据本发明的一个方面,提供了编码人心钠素或其衍生物的核苷酸序列和编码人白细胞介素2衍生物的核苷酸序列的融合基因,其长度分别为486和504个碱基对,其核苷酸序列分别如序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示,其中SEQ ID NO:1为编码人心钠素衍生物sANP1的核苷酸序列与编码人白细胞介素2衍生物IL-2a的核苷酸序列的融合基因的核苷酸序列,而SEQ ID NO:2为编码28肽人心钠素的核苷酸序列与编码人白细胞介素2衍生物IL-2a的核苷酸序列的融合基因的核酸序列。在这两个融合基因中,人心钠素或其衍生物的编码序列与人白细胞介素衍生物的编码序列之间由编码凝血酶识别序列(Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg)的核苷酸接头相连接,在SEQ ID NO:1和2中,该核苷酸接头序列由下划线示出。由本文的实施例可以看出所述的两种融合基因克隆到表达载体后能高效表达出融合蛋白。
根据本发明的另一方面,提供了人心钠素或其衍生物和人白细胞介素2衍生物的融合蛋白,分别命名为DFP1和DFP3,其氨基酸序列分别如序列表的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。其中,DFP1是人心钠素衍生物sANP1和人白细胞介素2衍生物IL-2a的融合蛋白,而DFP3是全长人心钠素ANP和人白细胞介素2衍生物IL-2a的融合蛋白。在这两个融合蛋白中,人心钠素ANP或其衍生物sANP1和人白细胞介素2衍生物IL-2a之间由凝血酶识别序列相连,该识别序列在SEQ ID NO:3和4中以下划线示出。
根据本发明的再一方面,提供了一种本发明的融合蛋白DFP1经凝血酶酶切后的产物人心钠素衍生物sANP1及其DNA序列,sANP1含有22个氨基酸残基,它是将前述已知的三种提高活性和稳定性的可能性综合起来,经盒式突变与基因内重组,使其产物缺失了28肽心钠素(SEQ ID NO:5)N末端的6个氨基酸,并将其第8位的苯丙氨酸突变为丝氨酸,将其第12位的甲硫氨酸突变为异亮氨酸,所得的22肽ANP衍生物在活性和稳定性方面有显著的提高(如下所述)。因此本发明采用了这种经突变的心钠素衍生物编码基因。
根据本发明的另一方面,提供了一种本发明的融合蛋白DFP1或DFP3经凝血酶酶切后的产物人白细胞介素2衍生物IL-2a及其DNA序列,IL-2a共含有140个氨基酸残基,其中在C末端保留有6个氨基酸残基的凝血酶识别序列。与天然的IL-2相比,IL-2a的第100位氨基酸由谷氨酸变为甘氨酸,第125位氨基酸由半胱氨酸变为丝氨酸。
根据本发明的又一方面,提供了包含所述的融合基因的高效表达载体及该载体的构建方法。为提高基因表达的效率,将包含所述的包括融合基因的DNA片段在内的操纵子元件的1-4个拷贝正向***通用的表达载体如质粒pLY1,将重组质粒导入宿主如E.coli DH5α等即可高效表达本发明的融合蛋白。如此构建的工程菌构成了本发明的另一方面。包含本发明的融合基因DFP1和DFP3的大肠杆菌菌株E.coli DH5α/DFP1和E.coli DH5α/DFP3已于1996年9月4日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号分别为CCTCC M 96013和CCTCC M 96014。这两个菌株分别是将含有顺式双拷贝的DFP1或DFP3基因表达元件的质粒pAHQ6(含DFP1基因)或pCW122(含DFP3基因)转化大肠杆菌DH5α后筛选得到的转化子。所述的表达元件包括PL启动子、SD核糖体识别序列、融合基因DFP1或DFP3、T1T2终止序列。根据本发明的方法,可将1-4拷贝的表达元件***表达载体,实验表明双拷贝形式显著提高了融合基因的表达水平,3-4拷贝的表达元件的***而产生的质粒在表达水平方面仍有所提高,但将双拷贝的融合基因表达元件***表达载体已使表达水平高达45%细胞总蛋白,已完全符合生产的要求。
本发明还涉及所述的融合蛋白DFP1和DFP3在制备防止与抵御原位癌转移的药物中的应用,本发明的融合蛋白可能防止和抵御原位癌转移至肺、肾、肝或睾丸等,特别是对于原位癌转移至肺有更好的效果。由实施例可以看出,本发明的融合蛋白DFP1抵御癌细胞扩散与转移的能力比IL2强1倍,同时利用DFP1上的sANP1的利尿作用消除了IL2可能引起的急性肾衰,因此本发明还涉及所述的融合蛋白在制备抗少尿肾衰的药物中的应用。本发明的融合蛋白DFP1经凝血酶消化后所得到的心钠素衍生物sANP1的利尿和降压作用经药理活性测定也优于天然ANP。同28肽ANP比较,sANP1的利尿活性为其2.9倍,降压活性为其2.7倍,降压持续时间为其4.3倍,半衰期为其2倍。从而为sANP1在制备利尿和降压药物中的应用提供了可能性。
因此,本发明的融合基因和融合蛋白是在一种全新的理论基础上得到的产物。所述的融合蛋白是兼具导向抗肿瘤活性和利尿、降血压活性的双功能活性肽,其半寿期经实验结果推测可能为5-6分钟,比天然28肽ANP的半寿期2.5分钟要长约1倍,因而在体内能更好地发挥效力。而且该融合蛋白可经其中包括的ANP或其衍生物sANP1的制导与ANP受体结合,浓缩于肺、肝、肾等处,在防止与抵御原位癌转移于肺部方面比IL2强1倍;其次该融合蛋白可消除IL2引起的少尿急性肾衰、微血管渗漏、肺水肿、急性心衰等毒副作用。实验表明,与IL-2比较,在相同剂量下,IL-2的排尿活性为生理盐水的83%,而融合蛋白的排尿活性为生理盐水的120%。IL-2会引起室性早搏,而使用融合蛋白时心电图正常。另外融合蛋白DFP1的利尿活性为原来的28肽天然ANP的1.8倍,降压活性是原来的ANP的2.3倍,持续时间为ANP的4.3倍。
以下将参照附图和实施例对本发明作详细的描述,应理解的是实施例只是具体描述本发明而并非对本发明的限制。
图1示出实施例1得到的4种心钠素衍生物与28肽心钠素氨基酸序列的比较。
图2示出含有心钠素衍生物sANP1基因的质粒pAHQ1的构建。
图3示出含有IL-2a基因的质粒IL-2aINP的构建。
图4示出含有sANP1和IL-2a基因的质粒pAHQ2的构建。
图5示出含有sANP1和IL-2a融合基因DFP1基因的表达载体pAHQ3的构建。
图6示出含有融合基因DFP1的高效表达载体pAHQ5的构建。
图7示出具有双拷贝DFP1表达元件的载体pAHQ6的构建。
图8为表达载体pAHQ5和pAHQ6转化大肠杆菌DH5α后所得转化子经热诱导表达融合蛋白DFP1的SDS-PAGE图,图中泳道1为高密度发酵的未经诱导的DH5α/pAHQ5,泳道2为高密度发酵的诱导表达的DH5α/pAHQ5,泳道3和8为蛋白质分子量标准(由上至下依次为66200、43000、31000、20100及14400道尔顿),泳道4为未经诱导的DH5α/pAHQ5,泳道5为经诱导的DH5α/pAHQ5,泳道6为未经诱导的DH5α/pAHQ6,泳道7为经诱导的DH5α/pAHQ6,图中箭头所示为本发明的融合蛋白DFP1(分子量约18600)的位置。
图9A和图9B以图表形式示出本发明的DFP1融合蛋白与ANP、生理盐水和IL2在利尿方面的活性实验比较结果,其中图9A示出在实验不同的时间点上,不同实验组的小鼠的排尿量,图9B则示出在实验不同的时间点上,不同实验组的小鼠的总尿量。
图10详细示出含有ANP和IL-2a的融合基因DFP3基因的表达载体的构建过程。
图11为表达载体pCW120、pCW121、pCW122、pCW123和pCW124转化大肠杆菌DH5α后所得转化子经热诱导或未经诱导表达融合蛋白DFP3的SDS-PAGE图,图中M为蛋白质分子量标准(由上至下依次为66200、43000、31000、20100及14400道尔顿),泳道1为经42℃诱导的DH5α/pCW122,泳道2为未经诱导的DH5α/pCW122,泳道3为经42℃诱导的DH5α/pCW121、泳道4为未经诱导的DH5α/pCW121,泳道5为经42℃诱导的DH5α/pCW120,泳道6为未经诱导的DH5α/pCW120,泳道7为经42℃诱导的DH5α/pCW123,泳道8为未经诱导的DH5α/pCW123,泳道9为经42℃诱导的DH5α/pCW124,泳道10为未经诱导的DH5α/pCW124。图中箭头所示为本发明的融合蛋白DFP3的位置。
图12以图表形式示出本发明的DFP3融合蛋白与作为对照的标准ANP、生理盐水和标准IL2在利尿方面的活性实验比较结果。
图13以图表形式示出本发明的DFP3融合蛋白经凝血酶切割产生的ANP与作为对照的标准ANP、生理盐水在利尿方面的活性实验比较结果。
图14A和14B分别示出了DFP3和ANP样品的舒张血管活性实验的结果,实验采用离体的大鼠动脉血管条。
在下述实施例中,除非另有说明,所用的各种限制性内切酶及其它基因工程工具酶均购自Promega公司;Sephacryl S-200为Pharmacia公司产品;高压电泳仪Model 3000Xi,低压层析***Econo system,高速离心机Sorvall RC24,快速凝胶扫描仪Chromscan 3为Joyee loel产品,发酵***为New Brunswick Scientific产品。DNA消化和连接反应条件根据厂商提供的指导进行。宿主细胞的转化方法如Molecular Cloning-ALaboratory Manual所述。另外所使用的菌株和起始质粒如下:菌株:大肠杆菌DH5α起始质粒:pBSsk,购自协和医科大学友谊公司plyⅡ-13,本发明人所在研究室构建pLYⅠ,本发明人所在研究室构建实施例1 sANP1等4种心钠素衍生物基因的构建及其高效表达
为获得高活性和稳定性的心钠素衍生物,根据本文背景技术部分所述的三种可能性,将之综合为一突变盒,然后经心钠素基因内的重组置换而获得4种新型心钠素衍生物基因。sANP1基因为其中之一。具体步骤如下:(1)突变盒片段的制备
按以下序列分别合成两段寡聚核苷酸片段,凡须在同一位点引入多种突变时,则同时加入等量的两种碱基:片段1(32个碱基):T5’AATTCCATATGGAATGC TCGGTGGTCGTATG 3’A片段2(31个碱基):T5’GTCGATACGACCACCGG GCATTCCATATGG 3’A上述片段合成后经氨解、PAGE分离和Sep-Pak C18柱反相柱纯化后,进行退火及磷酸化。(2)通过基因内重组构建αhANP衍生物
首先,在αhANP(原28肽心钠素)基因的中部有一AvaⅡ位点。从重组体pLY1中分离出αhANP AvaⅡ位点至终止密码子TGA及后续至HindⅢ的350bp片段用于重组。pLY1(见图10)是以pBR322为框架,主要被重组进去的基因除了氨苄青霉素抗性基因和CIts857之外,还具有如下结构:PRPL-CII(SD)-Ref-αhANP以AvaⅡ和HindⅢ酶切pLY1,收集350bp的片段,即为αhANP的AvaⅡ-Stop-HindⅢ片段,备以重组之用。
其次,以pBS-Sk(+)为载体,用EcoRⅠ和HindⅢ酶切,收集2952bp大片段为新重组体的载体。
然后,按32bp突变盒片段∶350bp片段∶2952bp片段=20∶5∶1(摩尔比)的比例,将三片段混合,加入连接酶及其缓冲液在16℃连接过夜,转化感受态细胞JM101,即可获得转化子。
所得转化子经菌落原位杂交、质粒限制性酶谱分析以及阳性重组子的DNA序列分析,获得了4种符合要求的心钠素衍生物基因,分别称为sANP1、sANP2、sANP3、sANP4,其氨基酸序列与αhANP的氨基酸序列的比较如图1所示。(3)4种sANP的融合高效表达
将原克隆在pBS-Sk(+)上的4种sANP分别转移克隆于pLY1的Ref基因下游,构成:PRPL-CII(SD)-Ref(Glu)-sANP1-T1T2PRPL-CII(SD)-Ref(Glu)-sANP2-T1T2PRPL-CII(SD)-Ref(Glu)-sANP3-T1T2PRPL-CII(SD)-Ref(Glu)-sANP4-T1T2转化大肠杆菌DH5α,经温控表达,PAGE电泳,扫描检测,4种融合蛋白的表达均可达到约50%细胞总蛋白。实施例2 sANP1基因的扩增
以AHQ(序列为5’GGGGTTCGTGCTCCGCGTTGCTCCGGTGGTCGTATC 3’)及T7(购自Promega公司)为引物,利用克隆有sANP1基因的质粒plyⅡ-13(本实验室构建,带有盒式突变的sANP1基因)为模板,用加端PCR法扩增sANP1基因,其中引物AHQ中引入了对应于凝血酶识别序列的核苷酸接头(ad),反应体积为50μl(其中包括0.6pmol/μl引物AHQ、1pmol/μl T7引物、0.91μg plyⅡ-13、5μl 10×缓冲液、2μl dNTP、3μl MgCl2、0.5μl Taq DNA聚合酶和12.3μl三蒸水),反应步骤为94℃10分钟,然后加入0.5μl TaqDNA聚合酶和20μl石蜡油,5分钟后进行3个如下循环94℃40秒、53℃1分钟、72℃1.5分钟,而后再进行27个如下循环94℃40秒、53℃30秒、72℃1分钟,最后为72℃5分钟,储存至4℃直到进行下一步处理。将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,以pBR322/HinfⅠ为分子量标记,当目的条带446bp至适当位置后,用低融点琼脂糖控块回收该PCR产物。将如此得到的PCR产物用BamHⅠ消化,回收92bp的片段,即为ad-sANP1基因。实施例3 含sANP1基因的质粒pAHQ1的构建
如图2所示,以SmaⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pBSsk,用低琼脂糖控块回收2960bp的载体片段,该载体片段与实施例1中得到的ad-sANP1基因片段连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。以蓝白斑互补法(Molecular Cloning-A Laboratory Manual,2nd Edition)挑选白色菌落,接种于5ml Amp+LB培养基,37℃振荡过夜。用碱变性法快速小量制备质粒DNA,并用HindⅢ和BamHⅠ、SmaⅠ和BamHⅠ酶切鉴定pAHQ1,筛选出正确的重组子DH5α/pAHQ1。
用碱裂解法从经酶切鉴定正确的重组子克隆大量制备质粒DNA,用PEG沉淀法纯化质粒DNA,定量后,按照常规方法进行测序,测序结果显示ad-sANP1的序列是正确的。实施例4 IL-2a基因的克隆
以IL-2/pBR322(本实验室构建保存,含有IL-2基因)为模板,引物为5’AGCAGAATTCATATGGCACCTACTTCAAGTTCT 3’和5’GGGAGTTGTGTTGAGATGATGC 3’,用PCR扩增出经点突变的IL-2a基因,回收417bp的平端PCR产物片段,在如下反应体系中将该片段***经SmaⅠ酶切的测序载体pBSsk中,所述的反应体系为1μl pBSsk/SmaⅠ、2μl IL-2a PCR扩增片段、1μl T4连接酶、1μl 10×缓冲液及5μl三蒸水,将连接混合物在12℃保温过夜。将连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,用α-互补法从LB平板上筛选白色菌落,碱裂解法小量提取质粒。以pVUⅡ酶切初筛出具有与预期相符的843bp和2519bp片段的重组子,再用EcoRⅠ酶切鉴定得到所述IL-2a PCR片段以与lacZ基因相同和不同的两种方向***的重组质粒,分别命名为IL-2ainp和IL-2a insert-,见图3。将质粒IL-2ainp进行测序,证实其含有正确的IL-2a基因。天然IL2与该IL-2a基因所编码的多肽链的不同之处在于:100位的Glu被突变为Gly,第125位的Cys被突变为Ser,且后者的C末端接有Gly-Val-Arg-Gly-Pro-Arg的凝血酶识别序列。实施例5 含有sANP1和IL-2a融合基因的质粒pAHQ2的构建
如图4所示,以SmaⅠ和EcoRⅠ酶切实施例4得到的质粒IL-2ainp,回收其中含有IL-2a基因的408bp DNA片段。同样,将实施例3得到的含sANP1基因的载体pAHQ1用SmaⅠ和EcoRⅠ酶切,回收3034bp的载体片段。将得到的两种片段连接,连接混合物转化大肠杆菌DH5α,小量制备质粒,经限制性内切酶酶切证实得到了重组质粒,该质粒命名为pAHQ2。
由此,通过pAHQ2的构建实现了IL-2a-衔接头-sANP1基因的融合,所述的融合基因命名为DFP1基因。实施例6 含有sANP1和IL-2a融合基因DFP1基因的表达载体pAHQ3的构建
如图5所示,以NdeⅠ和BamHⅠ双酶切实施例5得到的质粒pAHQ2,回收含有IL-2a-sANP1的494bp的片段,由此制备目的基因片段。类似地,以NdeⅠ和BamHⅠ双酶切质粒pLYⅠ,回收4887bp的大片段,制备出载体片段,以供如下连接。
采用如上所述的连接条件,将494bp的IL-2a-sANP1片段与pLYⅠ/NdeⅠ+BamHⅠ连接,得到的重组载体命名为PAHQ3。实施例7 高效表达载体pAHQ5的构建
如图6所示,为提高融合基因DFP1的表达水平,采用亚克隆技术如下构建高表达质粒。以NdeⅠ酶切实施例6的载体pAHQ3,回收片段,在dNTP存在下,以Klenow酶补平NdeⅠ缺口。然后,用乙醇沉淀DNA,再连接成环状DNA,由此得到的质粒命名为pAHQ5。为保证补平的效率,连接混合物转化大肠杆菌前再用NdeⅠ酶切连接后的质粒。通过EcoRV和SmaⅠ双酶切初筛,再用NdeⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定重组质粒的NdeⅠ酶切位点消失,结果与设计相符。
通过这种亚克隆处理,增加了SD序列与起始密码子之间的距离,即SD序列与ATG密码子之间增加了两对核苷酸TA-AT,从而从基因表达调控方面提高了蛋白质的表达水平。实施例8 具有双拷贝DFP1表达元件的质粒pAHQ6的构建
如图7所示,用EcoRV完全酶切实施例6得到的质粒pAHQ5,酶切后将反应物分成两份,其中一份加热至70℃ 10分钟灭活EcoRV,乙醇沉淀回收线性化的pAHQ5,再用CIP(牛肠磷酸酶)去磷酸化以防止该质粒自连。另一份用SSPI酶切,回收其中含有DFP1融合基因及其旁侧序列的2144bp的片段。然后,将上述制备好的线性pAHQ5去磷酸化片段与该2144bp片段连接,得到具有双拷贝DFP1表达元件的重组质粒,命名为pAHQ6。用BamHⅠ酶切该质粒pAHQ6,如果为顺式双拷贝表达元件,则酶切图谱应显示2144bp和5383bp两个片段,而若为反式双拷贝表达元件,则酶切图谱显示2706bp和4821bp两个片段,结果表明只得到顺式双拷贝表达元件克隆。将所述的重组表达载体转化大肠杆菌DH5α,筛选转化子,含有该质粒的大肠杆菌DH5α/DFP1已于1996年9月4日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC M 96016。实施例9 DFP1基因的热诱导表达和SDS-PAGE检测
分别将实施例6、7和8得到的表达载体pAHQ3、pAHQ5和pAHQ6转化大肠杆菌DH5α,筛选得到转化子,分别命名为DH5α/pAHQ3、DH5α/pAHQ5和DH5α/pAHQ6。将三种转化子分别接种于5ml LB/Amp+培养基中并于32℃振荡培养过夜。再以2%接种量重新转接于5 ml LB/Amp+培养基中并于32℃振荡培养3-4小时,然后升温至42℃培养4-5小时,离心收集菌体,加入SDA-PAGE载样缓冲液于95℃保温30分钟,随后以8000转/分离心10分钟,收集上清备电泳之用。类似地,以不通过升温诱导培养三种转化子作为对照。
SDS-PAGE依常规方法(例见Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory)进行,用考马斯亮蓝R-250染色,脱色后用Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长扫描,计算表达蛋白含量。结果见图8。经扫描仪扫描计算,DH5α/pAHQ3的DFP1表达量约为20%细胞总蛋白(图中未示出);DH5α/pAHQ5的DFP1表达量约为30%,提示运用亚克隆技术调整SD与起始密码子之间的距离可调控蛋白的表达,此种处理蛋白表达量提高10%;而具有双拷贝表达元件的DH5α/pAHQ6的DFP1表达量达到细胞总蛋白的39%,较之DH5α/pAHQ5又提高表达量约10%,表明本发明的多拷贝表达元件构建载体方法达到了预期的效果。实施例10 DFP1融合蛋白的分离和纯化
采用New Brunswick Scientific高密度发酵***将转化子DH5α/pAHQ5进行高密度发酵,取60克菌体,经如下步骤处理纯化DFP1融合蛋白。A 细胞的破碎和包涵体的溶解(1)洗涤菌体和破壁
以10ml/g菌体的量加入3%Triton X-100及溶菌酶(1mg/ml),经Tris-HCl(pH7.0)溶解,搅匀数小时。6000rpm离心菌体15分钟,向细菌沉淀中加入裂解液(50mMTris-HCl,pH8.5,2mM EDTA,100mM NaCl,0.5%Triton X-100).,超声波破碎细胞至液体无粘稠感。而后10000rpm离心30分钟,弃去上清,向沉淀中加入核酸酶及相应的缓冲液,于37℃保温1小时,再于10000rpm离心30分钟,得到包涵体沉淀。(2)包涵体的洗涤
首先用5%Triton X-100搅拌洗涤包涵体2小时,于10000rpm离心30分钟,弃去上清。然后用50mM Tris-HCl,2M盐酸胍,10mM EDTA,100mM NaCl洗二次,再用除4M盐酸胍之外与上述清洗液相同的清洗液洗二次,洗涤时以超声波处理沉淀至其完全分散于清洗液中为止。(3)包涵体的溶解
经上述步骤清洗彻底的包涵体用10mM Tris-HCl pH8.8,100mM NaCl,2mM EDTA,10mMDTT和7M盐酸胍溶解。B Sephacryl S-200色谱纯化包涵体蛋白
柱体积为1.6cm×100cm,流动相为6M盐酸胍,10mM Tris-HCl,分别收集各流出峰,用SDS-PAGE检测目的蛋白DFP1所在峰。C 蛋白质复性
用6M Gdn预先稀释使蛋白质浓度在0.5mg/ml以下,再用稀释液(0.2M Tris-HCl pH8.8,5mM EDTA,4mM GSH+GSSG(分子比为9∶1),蔗糖1%)稀释使Gdn终浓度在1M-1.5M,室温搅拌复性48小时,透析除去盐酸胍,对蛋白质进行定量。D 超滤浓缩蛋白质
复性后用截流分子量为10000D的超滤膜(Milipore公司产品)浓缩蛋白,操作在冰浴中进行。实施例11 用凝血酶切割DFP1以获得sANP1
按凝血酶∶蛋白质=1∶20的比例将凝血酶与实施例10纯化得到的DFP1混合,缓冲体系为20mM Tris-HCl pH7.0,10mM CaCl2,1%甘油,于28℃酶切过夜。以截流分子量为5000D的超滤膜(Milipore公司产品)超滤,滤过液为sANP1(2316D),上层液则为IL-2a(15519D),再用截流分子量为1000D的超滤膜浓缩sANP1,然后用放射性免疫法测定sANP1浓度(500ng/ml)和用ELISA测定IL-2a浓度后,折算DFP1浓度,结果DFP1浓度为125μg/ml,折合每升发酵液的DFP1产量为252mg/L。实施例12 DFP1和sANP1的生理活性测定A DFP1的防止与抵御癌细胞转移与扩散实验
实验采用Lewis肺癌可移植瘤株(中国医学科学院基础所病理生理室保存),以3.6×106/0.2ml细胞的量给C57小鼠(中国医学科学院基础所病理生理室保存)背部腋窝皮下接种,72小时后腹腔用药,实验分为三组,每组15只小鼠,这三组分别是阳性对照组(IL2)、实验组(DFP1)和阴性对照组(生理盐水,NS),均为腹腔注射。每次注射的量为,IL2为3万单位,DFP1以IL2计相当于3万单位,生理盐水等体积注射。因药量有限,实验采用连续每日用药10次后,改为隔日给药,共给药14次,实验观察23天,观察指标包括瘤重、瘤体积、肺转移、肺表面结节数。当NS组出现死亡时,采用引颈法处死并解剖动物,观察结果。表1示出实验结果。
表1组别 肺转移率 瘤重 单个结节 中期肿瘤体积 备注cm2IL2 7/12 9.0±1.35 64 1.71±0.98 结节大小不一DFP1 7/11 9.9±1.35 32 1.87±0.62 结节大NS 9/10 10.33±1.82 61 2.94±0.87 结节大小不一注:未统计在内的小鼠盖因腹腔注射刺伤内脏引起腹腔出血而中途死亡。
关于肺转移率,因统计的基数过少,难以确定IL2和DFP1的区别。
由上述表1看出,令人感兴趣的是单个结节数,DFP1组是IL2组的一半,虽然DFP1组的结节较大。这或许可以看成是DFP1抵御癌细胞扩散与转移的能力比IL2强1倍,或者可把DFP1组出现的32个较大结节解释为,接种初期在肺部DFP1浓度偏低的情况下从原位瘤转移而来的,而到了中后期,因肺部DFP1浓度逐渐提高并因sANP1对其受体的结合而使DFP1上的IL2较长时间地停留在肺部,提高了浓度,增强了信号,激活免疫防御力效果好,从而有效地防止和抵御了癌细胞的转移与扩散。而IL2组,虽然肺部IL2浓度递增的情况与DFP1组相同,但IL2随着代谢的进程很快地离开肺部,以致肺部IL2的浓度不足以防止和抵御癌细胞在初、中、晚期全过程中对肺部的转移与扩散,也因此出现了大小不一的数量多了一倍的单个结节。
另外,此次实验还观察到DFP1组小鼠多尿消瘦,这一现象可以解释为DFP1上的sANP1的利尿作用,消除了IL2可能引起的急性肾衰,而消瘦则是肿瘤引起的。相反,观察到IL2组小鼠少尿、增胖,这一现象可以解释为IL2引起了少尿急性肾衰,尿潴留,因而增加了体重。下述IL2与ANP、NS的比较排尿实验结果支持了上述看法。B DFP1的利尿活性实验
实验动物采用Wistar大鼠(中国医学科学院药物所提供),称重,预先禁食、禁水并适应代谢笼环境1小时,灌以1%盐水(5ml/100g体重,使动物细胞外液增加,以模拟水、钠潴留状态)。10分钟后开始给药,共进行4组实验,分别为DFP1组、ANP组、生理盐水组和IL2组,给药方式采用腹腔注射5μg/kg体重,药浓度为0.5μg/ml,IL2按35μg/kg体重给药。于给水后4小时再次灌胃,补充1%盐水2.5ml/100g,记录1,2,3,4,5,6,7小时大鼠的尿量及总尿量。图9A和图9B分别示出了在实验不同的时间点上,不同实验组的大鼠的排尿量和总排尿量。
由图9A和9B可以看出,DFP1的总排尿重为76ml,ANP则为70.25ml,前者比后者多排了近6ml,这是DFP1中的sANP1的活性提高和半衰期延长的总效果。另外,NS的排尿量为62.9ml,而IL2仅为52.31ml,比生理盐水少了10.59ml。IL2的排尿量仅为生理盐水的83%。这一结果提示IL2引起了少尿急性肾衰。此外,采用如下公式计算利尿活性比:
例如根据上述公式计算得到,DFP1的利尿活性与ANP的利尿活性之比为(76-62.9)/(70.25-62.9)=1.8,即DFP1的利尿活性是ANP的1.8倍,同样计算得到原来sANP1的利尿活性应为ANP的2.9倍,看来,在DFP1中的sANP1用大约1/3的利尿活性去消除DFP1中IL2所引起的少尿作用。实验中,IL2组的排尿量仅为生理盐水组的83%。值得注意的是25μg IL2(大约为2.5万单位IL2/kg)即可引起少尿急性肾衰,而在DFP1的实验中,曾使用了其中IL2为35μg/kg(大约为3.5万单位)不仅未见少尿反应,反而看到利尿(尿排出量增加)现象(这时DFP1中的sANP1用量均为5μg/kg),提示sANP1具有极强的利尿活性。据计算,DFP1的排尿量为生理盐水的120%。C DFP1的降压作用实验
实验采用雄性Wistar大鼠,体重为291±7g,以50mg/kg的量注射Sodiumpentobarbital,以多导仪(RM-6000,日本光电公司产品)测定动脉压和心电图,测定样品一次性注入股静脉,为便于观察降血压的持续时间,采取麻醉大鼠卧式插管方式测量血压的变化及心电变化。使用的样品分别为ANP、DFP1、IL2,实验结果如表2所示。
表2 DFP1对大鼠动脉压及心率的影响(二次实验结果)平均动脉压 降压 降压 持续 心 率μg/kg 初始 给药后 差数 % 活性 时间 初始 给药后(mmHg) (mmHg) 倍数 (心跳/分) (心跳/分)ANP 10 97.5 91 6.5 6.6 1 7 316 300DFP1= 135 120 15 11 2.3 30 400 429sANP1 10+IL2 70IL2 70 135 127.5 7.5 5.5 1 30 333 300
如表2所示,相当于在DFP1中的sANP1为10μg/kg的DFP1在给药后,使大鼠的平均血压降低了15mmHg,而对照的10μg/kgANP仅降低6.5mmHg,而且前者持续时间为30分钟,后者仅为7分钟,由此表明,DFP1在降压方面优于ANP(28肽),据计算,DFP1的降压活性为ANP的2.3倍,持续时间为ANP的4.3倍(见表2)。另外,在血压实验过程中跟踪的心电图显示在以7万单位/kg IL2进行实验时,观察到3次偶发室性早搏,而在DFP1实验时未观察到心电失常现象。实施例13 含DFP3融合基因重组载体的构建
参见图10,采用与实施例2类似的方法,以含ANP基因的pHMseq质粒为模板,以5’GGGGTTCGTGGTCCGCGTTCTCTTCGTCGTTC 3’和pUC/M13 Reverse Primer(购自Promega公司)分别作为上下游引物,通过PCR扩增出Ref-Adaptor_of_Thrombin-ANP片段,用BamHⅠ酶切后,将其***pBSsk载体的SmaⅠ与BamHⅠ克隆位点间,经蓝白斑筛选及酶切鉴定,得到的重组质粒命名为pCW1,构建步骤详见图10。将pCW1质粒进行DNA测序,确认其核苷酸序列的正确性。接着,以BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pCW1,分离纯化得到120bp片段,该片段含有Ref-Adaptor_of_Thrombin-ANP基因;同时,将pLY1质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切回收 5373bp片段,用T4 DNA连接酶将所述两个片段连接,构建成温度诱导表达Ref-Adaptor_of_Thrombin融合蛋白的重组质粒pCW111。
随后,以IL-2/pBR322为模板,以5’AGCAGAATTCATATGGCACCTACTTCAAGTTCT 3’和5’GGGAGTTAGTGTTGAGATGATGC 3’为引物,所设计的下游引物中带有改变的核苷酸序列,使得PCR产物中IL-2的Cys(125位)变为Ser,最后C端增加了Pro(核苷酸密码为CCC),经PCR扩增出突变的IL-2产物。将该417bp的PCR产物克隆入pBSsk的SmaⅠ位点,得到的重组质粒命名为pCW2+。经蓝白斑筛选及酶切鉴定,然后经DNA测序确认其核苷酸序列的正确性。以NdeⅠ和SmaⅠ双酶切pCW2+,分离纯化得到405bp片段,该片段含有所构建的突变的IL-2基因;另外用NdeⅠ和SmaⅠ双酶切质粒pCW111并回收其中的4994bp片段;将所述的两个片段用T4 DNA连接酶连接,构建成温度诱导表达IL-2a-Adaptor_of_Thrombin-ANP即DFP3融合蛋白的重组质粒pCW120。
经检测,重组质粒pCW120在大肠杆菌宿主菌中DFP3融合蛋白的表达量只有细胞总蛋白的20%多,因此,为提高目的基因的表达水平,将该质粒以NdeⅠ酶切而线性化,经Klenow酶补平末端,再用T4 DNA连接酶环化,如此构建的载体命名为pCW121,这样,通过在SD序列与DFP3启动子之间增加了2个碱基,使得其表达融合蛋白的水平提高到占总细胞蛋白的39%。
为进一步提高表达水平,采用本发明的重复克隆表达元件的方法,构建了分别含有2,3,4拷贝表达元件的重组质粒,依次命名为pCW122,pCW123,pCW124。具体方法是用EcoRV和SspI酶切pCW121,回收其中的2256bp片段(其上含有PL启动子、SD核糖体识别序列、融合基因DFP3、T1T2终止序列),将该片段***pCW121质粒的EcoRV位点,得到pCW122,将所述的重组表达载体转化大肠杆菌DH5α,筛选转化子,含有该质粒的大肠杆菌DH5α/DFP3已于1996年9月4日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCCM 96017。采用同样的方法,构建得到重组质粒pCW123和pCW124。实施例14 DFP3基因的热诱导表达和SDS-PAGE检测
采用实施例9所述的方法,将实施例13得到的重组载体pCW120,pCW121,pCW122,pCW123,pCW124分别转化大肠杆菌DH5α,筛选转化子,将转化子通过温度调控进行表达,表达水平通过SDS-PAGE,考马斯亮蓝(R250)染色或银染,经激光密度扫描分析融合蛋白DFP3分别占细胞总蛋白的39%,50%,55%,61%。见图11。实施例15 DFP3融合蛋白的纯化
利用如实施例10所述相同的步骤,采用New Brunswick Scientific高密度发酵***将转化子DH5α/pCW122进行高密度发酵,取菌体依次进行细胞的破碎和包涵体的溶解,Sephacryl S-200包谱纯化包涵体蛋白,蛋白质复性,超滤浓缩蛋白质等步骤得到纯化的融合蛋白DFP3。随后,如实施例11所述,用凝血酶特异性切割融合蛋白DFP3,产生心钠素28肽ANP及带有凝血酶识别序列的白细胞介素衍生物IL-2a。用FPLC纯化目的蛋白ANP、DFP3,进行如下的生物活性检测。实施例16 DFP3和ANP的生物活性测定
参照实施例12的步骤,对实施例15纯化得到的DFP3融合蛋白及其经凝血酶切割的产物ANP进行如下生物活性检测。A DFP3的利尿活性实验
实验动物采用Wistar大鼠,称重,预先禁食、禁水并适应代谢笼环境1小时,灌以1%盐水(5ml/100g体重,使动物细胞外液增加,以模拟水、钠潴留状态)。10分钟后开始给药,共进行4组实验,分别为DFP1组、标准ANP对照组、生理盐水组和标准IL2对照组,给药方式采用腹腔注射5μg/kg体重,药浓度为0.5μg/ml,IL2按35μg/kg体重给药。于给水后4小时再次灌胃,补充1%盐水2.5ml/100g,记录1,2,3,4,5,6,7,8,9小时大鼠的尿量及总尿量。图12示出了在实验不同的时间点上,不同实验组的大鼠的总排尿量。由图12可以看出,本发明的DFP3具有与标准ANP同等明显的利尿作用,而作为对照的标准IL2则明显具有导致少尿的副作用。从7小时的结果看,IL2的排尿量为生理盐水的85.7%,DFP3的排尿量为生理盐水的113%。B 由DFP3经凝血酶酶切得到的ANP的利尿活性实验
实验动物采用Wistar大鼠,称重,预先禁食、禁水并适应代谢笼环境1小时,灌以1%盐水(5ml/100g体重,使动物细胞外液增加,以模拟水、钠潴留状态)。10分钟后开始给药,共进行3组实验,分别为样品ANP组、标准ANP对照组、生理盐水组,给药方式采用腹腔注射5μg/kg体重,药浓度为0.5μg/ml。记录1,2,3,4,5,6小时大鼠的尿量及总尿量。图13示出了在实验不同的时间点上,不同实验组的大鼠的排尿量。由图13可以看出,本发明的由DFP3酶切纯化得到的ANP具有与标准ANP同等明显的利尿作用。C DFP3和ANP的舒张血管活性实验
先以去钾肾上腺素使得离体大鼠动脉血管条(制备方法见《药理实验方法学》第2版,人民卫生出版社)收缩,加入定量的待测药品,用二导生理实验记录仪(四川仪表厂产品,型号XWT-204)记录血管条的收缩与舒张。分别测试DFP3和由其得到的ANP的舒张血管作用,同时以生理盐水和标准ANP(购自Sigma公司)为对照,图14A和14B分别示出了DFP3和ANP样品的舒张血管活性。如图所示,本发明的DFP3和ANP样品具有与标准ANP同等明显的舒张血管作用。序列表SEQ ID NO.1的信息序列类型:核酸序列长度:486bp链性:单链拓扑:线性分子类型:cDNA来源:人特征:1-402bp为人白细胞介素2衍生物IL-2a的编码序列403-420bp为对应于凝血酶识别序列的核苷酸接头421-486bp为人心钠素衍生物sANP1的编码序列序列描述:SEQ ID NO:1GCACCTACTT CAAGTTCTAC AAAGAAAACA CAGCTACAAC TGGAGCATTT ACTGCTGGAT 60TTACAGATGA TTTTGAATGG AATTAATAAT TACAAGAATC CCAAACTCAC CAGGATGCTC 120ACATTTAAGT TTTACATGCC CAAGAAGGCC ACAGAACTGA AACATCTTCA GTGTCTAGAA 180GAAGAACTCA AACCTCTGGA GGAAGTGCTA AATTTAGCTC AAAGCAAAAA CTTTCACTTA 240AGACCCAGGG ACTTAATCAG CAATATCAAC GTAATACTTC TGGAACTAAA GGGATCTGGA 300ACAACATTCA TGTGTGAATA TGCTGATGAG ACAGCAACCA TTGTAGAATT TCTGAACAGA 360TGGATTACCT TTTCTCAAAG CATCATCTCA ACACTAACTC CCGGGGTTCG TGGTCCGCGT 420TGCTCCGGTG GTCGTATCGA CCGTATCGGG GCTCAGTCTG GTCTTGGTTG CAACTCTTTC 480CGTTAC 486SEQ ID NO.2的信息序列类型:核酸序列长度:504bp链性:单链拓扑:线性分子类型:cDNA来源:人特征:1-402bp为人白细胞介素2衍生物IL-2a的编码序列403-420bp为对应于凝血酶识别序列的核苷酸接头421-504bp为人心钠素ANP的编码序列序列描述:SEQ ID NO:2GCACCTACTT CAAGTTCTAC AAAGAAAACA CAGCTACAAC TGGAGCATTT ACTGCTGGAT 60TTACAGATGA TTTTGAATGG AATTAATAAT TACAAGAATC CCAAACTCAC CAGGATGCTC 120ACATTTAAGT TTTACATGCC CAAGAAGGCC ACAGAACTGA AACATCTTCA GTGTCTAGAA 180GAAGAACTCA AACCTCTGGA GGAAGTGCTA AATTTAGCTC AAAGCAAAAA CTTTCACTTA 240AGACCCAGGG ACTTAATCAG CAATATCAAC GTAATAGTTC TGGAACTAAA GGGATCTGGA 300ACAACATTCA TGTGTGAATA TGCTGATGAG ACAGCAACCA TTGTAGAATT TCTGAACAGA 360TGGATTACCT TTTCTCAAAG CATCATCTCA ACACTAACTC CCGGGGTTCG TGGTCCGCGT 420TCTCTTCGTC GTTCTTCTTG CTTCGGTGGT CGTATGGACC GTATCGGGGC TCAGTCTGGT 480CTTGGTTGCA ACTCTTTCCG TTAC 504SEQ ID NO.3的信息序列类型:氨基酸序列长度:162个氨基酸链性:拓扑:线性分子类型:蛋白质来源:特征:1-134位氨基酸为人白细胞介素2衍生物IL-2a的氨基酸序列135-140位氨基酸为凝血酶识别序列141-162为人心钠素衍生物sANP1的氨基酸序列序列描述:SEQ ID NO.3Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His5 10 15Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys20 25 30Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys35 40 45Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys50 55 60Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu85 90 95Lys Gly Ser Gly Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala100 105 110Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile115 120 125Ile Ser Thr Leu Thr Pro Gly Val Arg Gly Pro Arg Cys Ser Gly Gly130 135 140Arg Ile Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe145 150 155 160Arg TyrSEQ ID NO.4的信息序列类型:氨基酸序列长度:168个氨基酸链性:拓扑:线性分子类型:蛋白质来源:人特征:1-134位氨基酸为人白细胞介素2衍生物IL-2a的氨基酸序列135-140位氨基酸为凝血酶识别序列141-168为人心钠素ANP的氨基酸序列序列描述:SEQ ID NO.4Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His5 10 15Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys20 25 30Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys35 40 45Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys50 55 60Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu85 90 95Lys Gly Ser Gly Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala100 105 110Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile115 120 125Ile Ser Thr Leu Thr Pro Gly Val Arg Gly Pro Arg Ser Leu Arg Arg130 135 140Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly Ala Gln Ser Gly145 150 155 160Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr165SEQ ID NO.5的信息序列类型:氨基酸序列长度:28个氨基酸链性:拓扑:线性分子类型:蛋白质来源:人特征:全长人心钠素ANP的氨基酸序列序列描述:SEQ ID NO.5Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly1 5 10 15Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Tyr20 25