CN106226895A - 一种带反馈的旋转全内反射显微方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；以及用于采集样品发出荧光的CCD。本发明还公开了一种带反馈的旋转全内反射显微方法。本发明通过对样品和显微物镜同步反馈控制，能够保证样品处于最佳照明面和最佳成像面，具有更好的照明均匀性和成像分辨率。

Description

一种带反馈的旋转全内反射显微方法及装置

技术领域

本发明涉及显微成像领域，特别涉及一种带反馈的旋转全内反射显微方法及装置。

背景技术

随着生物科学研究的发展，特别是与膜相关的生物现象的研究，对于一种仅观察单层样品结构的显微方法有着强烈的需求。传统的显微方法中，照明时整个视场在z轴方向上都被照明光束照明，z轴方向的分辨率和信噪比一直都做不高，为此光切片显微镜和全内反射显微镜(Tirf)都是提高z轴分辨率的技术手段。

光切片显微镜，采用横向照明的方法，但由于衍射极限的存在横向照明的最细光束只能做到半波长量级，其z轴分辨率依然达不到仅观察细胞膜结构的要求，而且由于细胞的贴壁生长，光切片显微技术很难准确照明到相应的位置。

Tirf是一种利用全内反射原理，由于倏逝场沿z轴方向的衰减特性，通过改变全内反射的入射角度可以实现不同的衰减系数，从而可以在细胞与装载波片之间形成200nm厚的光场，这层光场恰好与细胞的贴壁生长时细胞膜的位置重合，实现了细胞膜的准确照明。但是由于激光散斑的存在会导致照明光场不均匀，为此一种旋转的全内反射显微方法能够克服这种缺点实现均匀的全反射光场照明，旋转全反射照明的显微方法中，照明角度决定了照明深度，但在调整过程中属于一种开环控制，一种根据成像情况，来判断照明角度，但这个过程对照明角度的控制精度不够，且不能实时调整。

发明内容

为了解决旋转全内反射显微方法中对于入射角度，以及实现样品与显微物镜之间的最佳距离自动调整，本发明提供了一种带反馈的旋转全反射显微方法及装置，通过反馈信号的控制有效的增加了***对照明角度以及样品与显微物镜间的距离的自动的精度，为样品的层析照明、三维重构提供了技术上的保证。

本发明所采用的具体技术方案如下：

一种带反馈的旋转全内反射显微方法，包括以下步骤：

1)二维振镜扫描***可以改变激光光束的角度，与扫描透镜配合可在扫描透镜的前焦面上聚焦成一个位置可控的点；

2)所述聚焦的激光光束经过准直透镜成为平行光，平行光被一“X”型分束镜分光，一路照射到二色镜上，一路经聚焦透镜聚焦到光强位置探测器上，形成光点一，所述“X型反射镜的透反比在90％以上”；

3)所述照射到二色镜上的光被，聚焦到全反射物镜后焦面的光经过全反射显微物镜能够变成平行光照射到样品上，当照射到样品上的角度足够大时，会发生全反射，此时只有贴壁的薄层样品会被照明激发；

4)在样品处发生全反射的激光再被显微物镜接收，在全反射物镜后焦面聚焦，再镜显微场景成为平行光，镜二色镜反射后再经过“X”型分束镜反射，反射光经聚焦透镜聚焦到光强位置探测器上，形成光点二；

5)步骤2)中所述的光点一与步骤4)所述的光点二的位置信息反映了***的全反射照明情况。计算机控制二维扫描振镜、光强位置探测器和显微物镜，通过控制显微物镜使光点一与光点二重合，以确定样品离显微物镜间的距离，通过两个重合光点的位置来确定全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度。

6)样品发出的荧光被全反射物镜接收，然后经过显微场镜、透过二色镜、滤光片成像在CCD上。

所述的二维扫描振镜***在电压的控制下使激光在全内反射显微物镜的后焦面上的扫描轨迹为一个环形，环形的直径大小对应入射光的倾斜角度，CCD成像CCD的曝光时间等于振镜扫描周期的整数倍；

本发明还提供了一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：

照明模块：沿光路设置激光器、激光准直器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜，样品；

反馈模块，包含“X”型分束镜，聚焦透镜，光强位置探测器，以及与二维扫描振镜、光强位置探测器、显微物镜z轴控制连接的计算机控制***；

荧光成像模块，包含滤光片、CCD以及与照明模块共用的样品、全反射显微物镜、显微场镜和二色镜。

所述的照明模块，二维扫描振镜位于扫描透镜的后焦面上，扫描透镜与准直透镜构成4f***，准直透镜与显微场镜构成4f***，显微场镜与全反射显微物镜构成4f***，样品位于全反射显微物镜的前焦面上，二色镜位于准直透镜和显微场镜之间；

所述反馈模块，“X”型分束镜位于准直透镜跟二色镜之间，光强位置探测器位于聚焦透镜的前焦面上；

所述荧光成像模块，样品位于全反射显微物镜的前焦面上，场镜跟全反射显微物镜构成4f***，CCD位于场镜的后焦面上，二色镜，滤光片位于CCD跟场镜之间。

本发明的工作原理如下：

光在全反射时光强分布满足公式

$E=A\exp \[-k_{1}z\sqrt{{\sin }^2{\mathrm{\θ}}_1-n^2}\]\exp \[i(k_1{\mathrm{xsin\θ}}_1-\mathrm{\ω}t)\]$

当入射角度θ₁大于全反射角时，光强沿着z轴方向就有很强的衰减，衰减系数为因此能够实现薄样品照明，而且随着角度的改变衰减系数是不同的，因此可以通过改变角度实现z轴的差别照明，从而实现样品的3D还原。

照明光束聚焦在全反射物镜的后焦面聚焦点离中心光轴的距离决定了照明角度的大小。在旋转全反射照明***中，全反射面位于全反射显微物镜的前焦面上，因此，全反射光会沿着与入射光对称光路回射到显微物镜的后焦面上，显微物镜的后焦面与位置探测校准CCD处于共轭成像面上，全反射回去的光会聚焦在位置探测校准CCD成像面上，由于“X”型分束镜的作用，在“X”型分束镜正交放置时，从激光器照射过来的激光和全反射回来的光会重合成一个点。当旋转扫描时，聚焦点在CCD成像面上画成一个圈。假设全反射回来的激光形成的扫描环为环1，“X”型分束镜第一次反射形成的扫描环为环2，若环1的直径大于环2的直径，代表着样品向外离焦，若环1的直径小于环2的直径，代表样品向内离焦；环2直径的大小代表了全反射角度的大小。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

(1)自反馈全内反射***，能够根据照明位置探测CCD探测到的光斑位置，自动调整全反射角；

(2)用位置探测CCD探测光斑位置，能够比常规全反射显微***具有更高的角度控制分辨率；

(3)样品和显微物镜同步反馈控制，能够保证样品处于旋转全内反射显微***的最佳照明面和最佳成像面，具有更好的照明均匀性和成像分辨率。

附图说明

图1为本发明一种带反馈的旋转全内反射显微方法及装置的结构示意图。

图2为位置探测器探测到的光斑形状以及对应状态。

图3***控制信号图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，一种带反馈的旋转全内反射显微装置，包括：激光器1、第一准直透镜2、二维扫描***3、扫描透镜4、第二准直透镜5、“X”型分束镜6、二色镜7、显微场镜8、显微物镜9、样品10、滤光片11、CCD12、聚焦镜13、位置探测校准CCD14和主控计算机15。

“X”型分束镜单层膜的透反比为90％以上，当光照射到“X”型分束镜上时，有80％以上的光强会透射分束镜，20％以下的光强会被分束镜反射。

上述装置的工作过程如下：

(1)激光器1发出激光光束，经第一准直透镜2变成平行光，平行光照射到二维扫描***3，从二维扫描***3出射的光照射到扫描透镜4上，经过扫描透镜的激光聚焦在第二准直透镜5的后焦面上，然后入射至“X”型分束镜6，大部分光强透射“X”型分束镜6，少部分能量经“X”型分束镜反射，经过聚焦透镜13聚焦到位置探测校准CCD14上，形成的第一光斑(参考光斑)如图2a中黑点所示。

(2)透射“X”型分束镜6的激光经二色镜7反射到显微场镜8上，经显微场镜8的光聚焦到显微物镜9的后焦面上，经过显微物镜9的光平行照射到样品10上。样品10位于显微物镜9的前焦面上。其中，扫描透镜4、第二准直透镜5、显微场镜8和显微物镜9两两构成4f***，平行光照射在样品上，发生全反射。

(3)全反射的照明激光，反射回显微物镜9经显微场镜8、二色镜7、“X”型分束镜6和聚焦透镜13，聚焦到位置探测校准CCD14上，形成的第二光斑(样品光斑)如图2a中灰点所示。

(4)样品10被倏逝场波激发，发出荧光，荧光经显微物镜9、显微场镜8、二色镜7和滤光片11照射到CCD12上。

(5)主控计算机15控制二维扫描***3、显微物镜9、样品10、位置探测校准CCD14和CCD12。显微物镜9、样品10、位置探测校准CCD14相协调实现对样品位置的传感和控制。对二维扫描***3和CCD12的控制实现对样品的均匀照明和摄影。

本实施例中，利用上述装置所实现的旋转全内反射显微方法，其控制过程如下：

(1)激光器1发出激光经第一准直透镜2变成平行光，平行光进入到二维扫描***3中，经二维扫描***3的激光经过扫描透镜4、第二准直透镜5反射和“X”型反射镜6，聚焦透镜13聚焦到位置探测校准CCD14上，形成参考光斑。经样品10全反射回来的光经显微物镜9、显微场镜8、二色镜7和“X”型反射镜6反射，由聚焦透镜13聚焦到位置探测校准CCD14上，形成样品光斑。

(2)如图2a所示，黑色光斑和灰色光斑的相对位置，当黑色光斑和灰色光斑重合时，代表样品10位于显微物镜9的前焦面上。图2b显示当二维扫描***3扫描的时候，得到光斑轨迹，当灰色光斑轨迹半径大于黑色光斑轨迹半径时，主控计算机15控制样品10靠近显微镜9；如图2c显示当灰色光斑轨迹半径小于黑色光斑轨迹半径时，主控计算机15控制样品10远离显微物镜9，当两个光斑轨迹重合时代表样品恰好位于显微物镜9前焦面上，如图2d所示。图2的四幅图中虚线圈代表了全反射临界角对应的扫描位置。

(3)图3显示***控制二维扫描***3和CCD12的信号时间序列，二维扫描***扫描一个周期，CCD12成像一张。二维扫描***Y轴信号和二维扫描***X轴信号都为正弦信号，相位差90°，正弦信号的幅值对应照明角度的大小正相关，幅值越大角度越大。二维扫描***的扫描一个周期，CCD拍一张图片，CCD的曝光时间与扫描周期相同。

以上所述仅为本发明的较佳实施举例，并不用于限制本发明，凡在本发明精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种带反馈的旋转全内反射显微装置，其特征在于，包括：

沿光路依次设置的激光器、二维扫描振镜、扫描透镜、准直透镜、二色镜、“X”型分束镜、二色镜、显微场镜，全反射显微物镜和样品；

位于分束镜反射光路上的光强位置探测器，用于收集分束镜反射激光器发出照明光得到第一光点，以及收集样品处发生全反射形成的样品光得到第二光点；

计算机，用于根据第一光点和第二光电的位置信息，控制二维扫描振镜、光强位置探测器和显微物镜，使第一光点与第二光点重合，反馈得到全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；

以及用于采集样品发出荧光的CCD。

2.如权利要求1所述的旋转全内反射显微装置，其特征在于：所述的二维扫描振镜位于扫描透镜的后焦面上，扫描透镜与准直透镜构成4f***，准直透镜与全反射显微物镜构成4f***。

3.如权利要1所述的带反馈的旋转全内反射显微装置，起特征在于：所述的“X”型分束镜的透反比为90％以上。

4.一种基于权利要求1～3任一项所述旋转全内反射显微装置的旋转全内反射显微方法，其特征在于，包括：

利用二维振镜扫描***改变激光光束的角度，与扫描透镜配合在扫描透镜的前焦面上聚焦成一个位置可控的点；

聚焦后的激光光束经过准直透镜成为平行光，并被分束镜分为透射光和反射光，反射光被光强位置探测器收集得到第一光点，透射光聚焦到全反射物镜后焦面的光经过全反射显微物镜变成平行光照射到样品上发生全反射，且发生全反射的激光再被全反射显微物镜接收，沿光路返回经分束镜反射进入光强位置探测器，得到第二光点；

根据第一光点和第二光点的位置信息，通过计算机控制二维扫描振镜、光强位置探测器和显微物镜，使两个光点重合，以确定样品离显微物镜间的距离，并通过两个重合光点的位置来确定全反射照明的角度以及倏逝波的穿透深度；

利用全反射物镜接收样品被倏逝场波激发发出的荧光，并成像在CCD上。

5.如权利要求4所述的旋转全内反射显微方法，其特征在于：所述二维扫描振镜在计算机的控制下使激光在全内反射显微物镜的后焦面上的扫描轨迹呈环形。