CN106226284A - 相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测和显微成像***及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及光学领域，提供一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，包括飞秒脉冲激光器，将飞秒脉冲激光分为第一光束和第二光束的分束器；光子晶体光纤，用于经过第一光束泵浦以输出脉宽为皮秒级的超连续谱激光作为斯托克斯光；窄带滤光片，用于对第二光束进行滤波以及使脉冲展宽到与超连续谱相近的脉宽以作为泵浦光和探测光；延迟单元，用于使斯托克斯光、泵浦光和探测光同步；合束器，用于将斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束；探测器，用于探测相干反斯托克斯拉曼散射光谱。本发明可快速实现多个化学键的同时成像；对超连续谱光源的要求低；可获取完整的CARS光谱；可实现光束利用效率的最大化；可提高CARS成像的光谱分辨率。

Description

相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测和显微成像***及方法

技术领域

本发明属于光谱探测及显微成像技术领域，特别涉及一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测和显微成像***及方法。

背景技术

相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent anti-stokes Raman scattering，CARS)显微成像技术可以在无需外援性标记的情况下，根据物质分子的振动或者转动特性获得反斯托克斯信号，具有良好的化学特异性以及高灵敏度和高三维层析能力，因此被广泛应用于生物学领域中对脂类分子成像、对蛋白质和核酸进行选择性成像等，为生命科学和物质科学研究提供了灵敏和便利的无标记成像手段。一直以来，CARS显微成像技术多是基于分子内某一特定化学键的CARS信号表征特定分子。显然，这种靠单一化学键来区分种类繁多的生物分子是远远不够的。为了能够准确识别种类繁多的生物分子，需要尽可能获取其完整的CARS光谱，并获取其三维空间分布。

传统的CARS技术中通过连续改变两束激光脉冲中一束的波长，获取不同的频率差，实现分子中不同化学键的成像。主要有两种方案，第一，采用两台脉冲激光器，其中至少一台可调谐。由于两台激光器分别由不同的泵浦源进行泵浦，脉冲之间不可避免存在一定的频率差，因此，需要利用外置同步器将两台脉冲激光光源进行主动同步，这样不仅增加了成本，而且不容易维持同步的稳定性，增加了实验的难度。更重要的是，这样的光源方案一次仅能对分子单一化学键成像，只有通过不停改变可连续调谐光源的频率才能实现分子中不同种类的化学键成像，实现多个化学键成像的速度较慢且***复杂，成本很高。第二，采用脉冲泵浦的光学参量放大器(OPO)作为波长调谐的关键装置。OPO产生两束与泵浦光脉冲时序完全一致、波长可调谐的信号光与闲频光，通常采用其中的信号光与未耗尽的泵浦脉冲共同激发样品。这两束光的脉冲序列是同步的，可以通过光学时间延迟线可以使脉冲精确重合，产生CARS信号。这种光源方案不需要对两台脉冲光源主动同步，从一定程度上降低了CARS***的难度，也是目前国内外开展CARS成像研究的主要光源方案。这种方案的缺陷也是一次仅能对分子单一化学键成像，只有通过不停改变OPO信号光的频率才能对分子中不同种类的化学键成像，实现多个化学键成像的速度很慢。

近年来,利用超短激光脉冲抽运光子晶体光纤(photonic crystal fiber,PCF)产生超连续谱(supercontinuum,SC)激光作为光源,实现了可同时探测光谱范围的宽带CARS光谱和显微技术，现在主要有两种方法：第一，超短脉冲激光器输出的激光脉冲被分为两束,其中一束用于抽运PCF产生SC激光作为斯托克斯光(E_S),中心频率为ωs；另一束激光脉冲同时做为泵浦光(E_P)和探测光(E_P'),中心频率为ω_P＝ω_P′。两束激光同时激发待测样品产生CARS信号,称为双色宽带CARS技术。该方法由于激光脉冲脉宽很窄，因此无法同时获取其完整的CARS光谱。第二，使用具有足够宽的光谱范围的SC激光中不同的光谱成分同时作为E_P和E_S,具有一定时间延迟的飞秒激光脉冲作为E_P'，实现了宽带时间分辨CARS技术，该方法对既做泵浦光又做斯托克斯光的SC不仅要求具有较大的光谱展宽、较好的光谱平坦性和连续性，同时也要具有较佳的时谱结构，即不同频率的光谱成分间相对时间延迟小，对SC光源要求较高。因此我们提出一种对SC光源要求低、高谱分辨率和可同时获取完整CARS光谱的方法。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，旨在解决传统CARS技术无法在降低对超连续谱光源要求的同时获取高光谱分辨的完整CARS光谱的问题。

本发明是这样实现的，一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，包括：

飞秒脉冲激光器，用于输出飞秒脉冲激光；

分束器，用于将所述飞秒脉冲激光分为独立传播的第一光束和第二光束；

光谱展宽器件，设置于所述第一光束的光路上，用于经过所述第一光束泵浦以输出脉宽为皮秒级的超连续谱激光，所述超连续谱激光作为斯托克斯光；

窄带滤光片，设置于所述第二光束的光路上，用于对所述第二光束进行滤波及展宽，使其脉宽为与所述斯托克斯光脉宽相当的皮秒量级，滤波与展宽后的第二光束作为泵浦光和探测光；

延迟单元，设置于所述第二光束的光路上，用于使所述斯托克斯光、泵浦光和探测光同步；

合束器，用于将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束以作用于物体；

探测器，设置于所述物体的光输出方向，用于探测物体的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

本发明的另一目的在于提供一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，包括上述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，还包括用于动态承载所述物体以进行样品扫描进而获得相干反斯托克斯拉曼散射图像的样品台。

本发明的另一目的在于提供一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，包括上述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，在所述合束器的输出方向还设有使所述第三光束扫描所述物体进而获得相干反斯托克斯拉曼散射图像的扫描单元。本发明的另一目的在于提供一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测方法，包括下述步骤：

将飞秒脉冲激光分为独立传输的第一光束和第二光束；

利用所述第一光束泵浦光谱展宽器件，输出脉宽为皮秒量级的超连续谱激光作为斯托克斯光；

使所述第二光束经过延迟单元及窄带滤光片，获得与所述斯托克斯光同步且脉宽相当的泵浦光和探测光；

将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束，并将所述第三光束作用于物体，使物体发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出第四光束；

通过探测器探测所述第四光束，得到物体的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

本发明的另一目的在于提供一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法，包括下述步骤：

将飞秒脉冲激光分为独立传输的第一光束和第二光束；

利用所述第一光束泵浦光谱展宽器件，输出脉宽为皮秒量级的超连续谱激光作为斯托克斯光；

使所述第二光束经过延迟单元及窄带滤光片，获得与所述斯托克斯光同步且脉宽相当的泵浦光和探测光；

将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束；

通过光束扫描或者样品扫描使所述第三光束作用于物体，使物体发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出第四光束；

通过探测器探测所述第四光束，得到物体的相干反斯托克斯拉曼散射显微图像。

本发明提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***及显微成像***具有以下优点：

第一，不需采用可连续调谐光源并通过改变光源频率来实现分子中不同种类的化学键成像，可快速实现多个化学键同时成像，***结构简单。

第二，由于采用超连续谱作为斯托克斯光，采用飞秒脉冲激光作为泵浦光和探测光，与传统的采用超连续谱同时作为斯托克斯光和泵浦光的技术相比，不要求超连续谱光源具有较好的光谱平坦性和连续性，以及较佳的时谱结构，因此该***对超连续谱光源的要求较低，容易满足成像要求，进而可以降低成本和***的复杂度。

第三，与传统的采用超连续谱激光作为斯托克斯光，采用另一束激光作为泵浦光和探测光的技术相比，该***通过飞秒脉冲激光泵浦光子晶体光纤产生皮秒级的超连续谱激光作为斯托克斯光，该斯托克斯光具有足够的光谱宽度，可获取完整的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

第四，由于泵浦光和探测光的脉宽与斯托克斯光的脉宽相当，可以实现光束利用效率的最大化。

第五，由于泵浦光和探测光的谱宽可以通过窄带滤光片进行调节，而理论上相干反斯托克斯拉曼散射成像的光谱分辨率取决于该谱宽，因此，利用足够小带宽的窄带滤光片可以提高相干反斯托克斯拉曼散射成像的光谱分辨率。

因此，本发明降低了对超连续谱光源的要求并能够获得高光谱分辨的完整的相干反斯托克斯拉曼散射光谱，***结构简单易于实施，成本低，且成像效果好。

附图说明

图1是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***的结构示意图；

图2是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***采用的光子晶体光纤的色散曲线图；

图3是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***的超连续谱时谱图；

图4是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***的超连续谱波长与强度曲线图；

图5是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***的超连续谱时间与强度曲线图；

图6是提取图3中的835nm以上超连续谱的时谱图；

图7是提取图4中的835nm以上超连续谱的波长与强度曲线图；

图8是提取图5中的835nm以上超连续谱的时间与强度曲线图；

图9是提取0.38ps-0.4ps且835nm以上超连续谱的强度图；

图10是与图9对应的探测到的CARS信号光谱图；

图11是提取1.980ps-2ps且835nm以上超连续谱的强度图；

图12是与图11对应的探测到的CARS信号光谱图；

图13是提取0.58ps-0.6ps且835nm以上超连续谱的强度图；

图14是与图13对应的探测到的CARS信号光谱图；

图15是对应-0.5ps～2.5ps且835nm以上超连续谱的探测到的CARS信号光谱图；

图16是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测方法的流程图；

图17是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***的结构示意图；

图18是本发明另一实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***的结构示意图；

图19是本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设置于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者间接在该另一个元件上。当一个元件被称为“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至该另一个元件。

请参考图1，本发明提供一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，包括：飞秒脉冲激光器10，用于输出飞秒脉冲激光；分束器20，用于将飞秒脉冲激光分为独立传播的第一光束和第二光束；图1中第一光束为分束器20的反射光束，第二光束为分束器20的透射光束，当然，在另一实施例中，也可以将反射光束命名为第二光束，将透射光束命名为第一光束，本发明不局限于其中一种。该***还包括光谱展宽器件30，设置于第一光束的光路上，第一光束泵浦该光谱展宽器件30，输出脉宽为皮秒级的超连续谱激光，该超连续谱激光经过滤波后作为斯托克斯光；该***还包括延迟单元40和窄带滤光片50，依次设置于第二光束的光路上，第二光束经过延迟单元40和窄带滤光片50(使脉宽达到与斯托克斯光相当的皮秒量级)后作为泵浦光和探测光，经过延迟单元40后，使斯托克斯光、泵浦光和探测光同步；还包括合束器60，用于将斯托克斯光、泵浦光和探测光这两路光合为一束，即第三光束，以作用于待检测的物体，斯托克斯光和泵浦光作用物体发生相干反斯托克斯拉曼散射，通过探测光将该相干反斯托克斯拉曼散射信号进行提取；另外，在物体的光输出路径上设置有探测器70，用于探测物体80的相干反斯托克斯拉曼散射信号并进行成像。

具体地，该光谱展宽器件可采用光子晶体光纤或其它具有光谱展宽功能的材料或器件。

本发明实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***采用飞秒脉冲激光泵浦光谱展宽器件30，产生皮秒级的超连续谱激光，将该超连续谱激光作为斯托克斯光，同时对该飞秒脉冲激光进行滤波(脉宽达到与斯托克斯光相当的皮秒量级)和时间延迟后作为泵浦光和探测光，实现斯托克斯光与泵浦光和探测光的同步，将斯托克斯光与泵浦光和探测光同时入射物体80，使物体80发生相干反斯托克斯拉曼散射并输出光信号。该***具有以下优点：

第一，不需采用可连续调谐光源并通过改变光源频率来实现分子中不同种类的化学键成像，可快速实现多个化学键同时成像，***结构简单；

第二，由于采用超连续谱作为斯托克斯光，采用飞秒脉冲激光作为泵浦光和探测光，与传统的采用超连续谱同时作为斯托克斯光和泵浦光的技术相比，不要求超连续谱光源具有较好的光谱平坦性和连续性，以及较佳的时谱结构，因此该***对超连续谱光源的要求较低，容易满足成像要求，进而可以降低成本和***的复杂度；

第三，与传统的采用超连续谱激光作为斯托克斯光，采用另一束激光作为泵浦光和探测光的技术相比，该***通过飞秒脉冲激光泵浦光谱展宽器件产生皮秒级的超连续谱激光作为斯托克斯光，该斯托克斯光具有足够的光谱宽度，可获取完整的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

第四，由于泵浦光和探测光的脉宽与斯托克斯光的脉宽相当，可以实现光束利用效率的最大化。

第五，由于泵浦光和探测光的谱宽可以通过窄带滤光片进行调节，而理论上相干反斯托克斯拉曼散射成像的光谱分辨率取决于该谱宽，因此，利用足够小带宽的窄带滤光片可以提高相干反斯托克斯拉曼散射成像的光谱分辨率。

因此，本实施例提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***降低了对超连续谱光源的要求并能够获得完整的相干反斯托克斯拉曼散射光谱，***结构简单易于实施，成本低，且成像效果好。

作为本发明实施例的一种改进方案，可以采用高分辨率的窄带滤光片50，例如3nm以下带宽，优选采用0.1nm带宽的窄带滤光片50对第二光束进行滤波，0.1nm的带宽对应极限脉宽约为10ps，通常做斯托克斯光超连续谱的脉宽为10ps左右，这样，泵浦光和探测光的脉宽与斯托克斯光的脉宽相当，可以实现光束利用效率的最大化。使用0.1nm谱宽的泵浦光和探测光，得到高谱分辨率的CARS信号，770nm的CARS信号的谱分辨率达到1.68cm^-1，使得可以分辨开相隔很近的CARS峰。

进一步地，在飞秒脉冲激光器10和分束器20之间设有隔离器90，防止后向光信号损伤飞秒脉冲激光器10。

进一步地，在光谱展宽器件30的输入端设置有输入耦合透镜301，在光谱展宽器件30的输出端设有输出耦合透镜302，第一光束经过输入耦合透镜301耦合进入光谱展宽器件30，产生的超连续谱激光经输出耦合透镜302输出，进而提高第一光束的耦合效率和超连续谱激光的输出效率。

进一步地，在光谱展宽器件30和合束器60之间还设有一长波通滤光片100，用于对皮秒级的超连续谱进行滤波，获得预定波长范围的光作为斯托克斯光。

在本实施例中，斯托克斯光与泵浦光和探测光于合束器60处合并为第三光束，在合束器60的输出光路上还设有用于将第三光束聚焦于物体80上的聚焦透镜110，第三光束作用于物体80，物体80发生相干反斯托克斯拉曼散射，发出第四光束，在第四光束的路径上设有成像透镜120，用于将第四光束传输至探测器70，以实现相干反斯托克斯拉曼散射成像。

进一步地，在探测器70和成像透镜120之间还设有一短波通滤光片130，用于对第四光束进行滤波，并滤除外界杂散光。

进一步地，本发明实施例还包括若干个反射镜140，其分散设置在第一光束和第二光束的光路上，用于调整光路，使之合理紧凑。

具体地，本发明实施例中的飞秒激光器可采用脉冲半高宽50fs，峰值功率为8kw，中心波长为835nm的超短脉冲激光抽运长度为10cm，零色散波长为780nm的光谱展宽器件30，空气孔直径D＝1.4um，空气孔间距Λ＝1.6um，其色散曲线如图2所示。经飞秒激光泵浦该光谱展宽器件30后输出的超连续谱如图3和图4所示，图3为时谱图，图4为强度图。该超连续谱的脉宽约3ps，波长范围500～1200nm。通过长波通滤光片100截取835nm以上的超连续谱如图5和图6所示。待测物选择聚苯乙烯球，选取其三个分子共振键分别为：3066cm^-1，1603cm^-1，1003cm^-1，用中心波长为835nm飞秒脉冲激光经过0.1nm的窄带滤光片50滤波后的激光做泵浦光和探测光，利用835nm以上超连续谱做斯托克斯光，对应产生的CARS信号波长分别在664nm、736nm、770nm。

提取图3中380fs-400fs处波长强度，如图9所示，探测器70探测的光谱如图10所示，未产生CARS信号。提取图3中1980fs-2000fs处波长强度，如图11所示，产生图12所示的664nm的CARS信号。提取580fs-600fs波长强度，如图13所示，产生了图14所示的736nm、770nm的CARS信号。综上，在图3中-0.5ps—2.5ps之间且每隔20fs取波长强度图，做出CARS光谱图，中和到一幅图中如图15所示，对应的超连续谱中的斯托克斯光为：1122nm，964nm，911nm，对应产生的CARS信号波长分别在664nm、736nm、770nm。该***实现了聚苯乙烯球的三个分子共振键的同时检测。这仅是一个应用实例，该***可以用于测量多种生物分子种类，在此不再一一赘述。

以下提供一种基于上述***的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测方法，如图16所示，包括下述步骤：

在步骤S101中，将飞秒脉冲激光分为独立传输的第一光束和第二光束；

在步骤S102中，利用第一光束泵浦光谱展宽器件30，输出脉宽为皮秒量级的超连续谱激光作为斯托克斯光；

在步骤S103中，使第二光束经过延迟单元40及窄带滤光片50，获得与斯托克斯光同步且脉宽相当的泵浦光和探测光；

在步骤S104中，将斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束，并将第三光束作用于物体80，使物体80发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出第四光束；

在步骤S105中，通过探测器70探测第四光束，得到物体80的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

该方法是基于上述相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***实施的成像方法，作为该方法的进一步改进，同样可以基于上述成像***实施，例如，在对第二光束进行滤波时，可采用带宽为0.1nm的窄带滤光片50，以实现高谱分辨率成像。进一步地，可通过第二光束的光路上的延迟单元40对第二光束进行延迟，使泵浦光和探测光与斯托克斯光同步。

进一步地，斯托克斯光经过长波通滤光片100后与泵浦光和探测光合束为第三光束，第三光束通过聚焦透镜110作用于物体80，物体80发出的第四光束通过成像透镜120和短波通滤光片130后进入探测器70。

该方法采用了上述***，在降低对超连续谱光源的要求的同时实现了完整的CARS成像，且该方法易于实施，检测速度快，分辨率高，成本低，是一种较佳的生物分子检测方法。

基于上述***和方法，本发明进一步提供一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，如图17，该成像***是在上述相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***的基础上增加相应扫描结构而实现，具体地，该相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***包括本发明提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，还包括用于动态承载物体以进行样品扫描，进而获得相干反斯托克斯拉曼散射图像的样品台150。该显微成像***是在上述光谱探测***中增加样品扫描的样品台。

本发明还提供另一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，如图18，该成像***也是在上述相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***的基础上增加相应扫描结构而实现，具体地，该相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***包括本发明提供的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，还包括设置在合束器60的输出方向的使第三光束扫描物体，进而获得相干反斯托克斯拉曼散射图像的扫描单元160。该扫描单元可以是扫描镜或其他能够改变光束照射方向的器件。

进一步地，基于上述相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，本发明进一步地提供一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法，如图19，包括下述步骤：

在步骤S201中，将飞秒脉冲激光分为独立传输的第一光束和第二光束；

在步骤S202中，利用所述第一光束泵浦光谱展宽器件，输出脉宽为皮秒量级的超连续谱激光作为斯托克斯光；

在步骤S203中，使所述第二光束经过延迟单元及窄带滤光片，获得与所述斯托克斯光同步且脉宽相当的泵浦光和探测光；

在步骤S204中，将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束；

在步骤S205中，通过光束扫描或者样品扫描使所述第三光束作用于物体，使物体发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出第四光束；

在该步骤中，具体可以采用上述样品台带动物体移动实现样品扫描，或者采用上述扫描单元改变光束照射方位实现光束扫描。

在步骤S206中，通过探测器探测所述第四光束，得到物体的相干反斯托克斯拉曼散射显微图像。

上述相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***及显微成像方法与上述相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***及光谱探测方法具有相应的技术效果，此处不再重复说明。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，其特征在于，包括：

飞秒脉冲激光器，用于输出飞秒脉冲激光；

分束器，用于将所述飞秒脉冲激光分为独立传播的第一光束和第二光束；

光谱展宽器件，设置于所述第一光束的光路上，用于经过所述第一光束泵浦以输出脉宽为皮秒级的超连续谱激光，所述超连续谱激光作为斯托克斯光；

窄带滤光片，设置于所述第二光束的光路上，用于对所述第二光束进行滤波及展宽，使其脉宽为与所述斯托克斯光脉宽相当的皮秒量级，滤波与展宽后的第二光束作为泵浦光和探测光；

延迟单元，设置于所述第二光束的光路上，用于使所述斯托克斯光、泵浦光和探测光同步；

合束器，用于将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束以作用于物体；

探测器，设置于所述物体的光输出方向，用于探测物体的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

2.如权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，其特征在于，还包括设置于所述合束器的输出光路上用于将所述第三光束聚焦于物体上的聚焦透镜，以及用于收集所述物体发出的第四光束的成像透镜，所述探测器用于探测所述第四光束。

3.如权利要求2所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，其特征在于，在所述探测器和所述成像透镜之间设有短波通滤光片，在所述光谱展宽器件和合束器之间设有长波通滤光片。

4.如权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，其特征在于，在所述光谱展宽器件的输入端设有输入耦合透镜，在所述光谱展宽器件的输出端设有输出耦合透镜。

5.如权利要求1所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，其特征在于，所述窄带滤光片的带宽为为3nm以下。

6.一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，还包括用于动态承载所述物体以进行样品扫描进而获得相干反斯托克斯拉曼散射图像的样品台。

7.一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像***，其特征在于，包括权利要求1至5任一项所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测***，在所述合束器的输出方向还设有使所述第三光束扫描所述物体进而获得相干反斯托克斯拉曼散射图像的扫描单元。

8.一种相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测方法，其特征在于，包括下述步骤：

将飞秒脉冲激光分为独立传输的第一光束和第二光束；

利用所述第一光束泵浦光谱展宽器件，输出脉宽为皮秒量级的超连续谱激光作为斯托克斯光；

使所述第二光束经过延迟单元及窄带滤光片，获得与所述斯托克斯光同步且脉宽相当的泵浦光和探测光；

将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束，并将所述第三光束作用于物体，使物体发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出第四光束；

通过探测器探测所述第四光束，得到物体的相干反斯托克斯拉曼散射光谱。

9.如权利要求8所述的相干反斯托克斯拉曼散射光谱探测方法，其特征在于，所述第三光束通过聚焦透镜作用于所述物体，所述第四光束通过成像透镜收集并输出至所述探测器；所述斯托克斯光经过长波通滤光片后与所述泵浦光和探测光合束，所述第四光束经过短波通滤光片后进入所述探测器。

10.一种相干反斯托克斯拉曼散射显微成像方法，其特征在于，包括下述步骤：

将飞秒脉冲激光分为独立传输的第一光束和第二光束；

利用所述第一光束泵浦光谱展宽器件，输出脉宽为皮秒量级的超连续谱激光作为斯托克斯光；

使所述第二光束经过延迟单元及窄带滤光片，获得与所述斯托克斯光同步且脉宽相当的泵浦光和探测光；

将所述斯托克斯光、泵浦光和探测光合为第三光束；

通过光束扫描或者样品扫描使所述第三光束作用于物体，使物体发生相干反斯托克斯拉曼散射，并发出第四光束；

通过探测器探测所述第四光束，得到物体的相干反斯托克斯拉曼散射显微图像。