CN106222201A - 一种制备car‑t细胞的方法以及制得的car‑t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学和分子生物学领域，特别涉及一种制备CAR‑T细胞的方法以及制得的CAR‑T细胞及其应用。一种制备CAR‑T细胞的方法，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到CAR‑T细胞。本发明还提供了制得的CAR‑T细胞以及含有CAR‑T细胞的组合物。本发明提供的制备CAR‑T细胞的方法，将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到CAR‑T细胞，能够工业化生产制备用于个体化治疗的CAR‑T细胞，制得的CAR‑T细胞消除了个体之间的排斥性，该方法制备得到的CAR‑T细胞的有效性更好、安全性更高。本发明还提供了CAR‑T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。

Description

一种制备CAR-T细胞的方法以及制得的CAR-T细胞及其应用
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学领域，具体而言，涉及一种制备CAR-T细胞的方法以及制得的CAR-T细胞及其应用。
背景技术
大部分具有B细胞恶性肿瘤—包括慢性淋巴细胞白血病(Chronic LymphocyticLeukemia，CLL)的患者，使用化疗、靶向治疗的治愈率以及预后都很差。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)的表达，靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR是被设计为以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别细胞表面抗原的抗原受体。利用表达CAR的基因修饰的T细胞治疗这些类型患者的尝试已经得到一定程度的成功(Molecular Therapy,2010,18:4,666-668；Blood,2008,112:2261-2271)。
随着嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)技术的不断发展，目前CAR-T主要可划分为三代。第一代CAR-T细胞由胞外结合区-单链抗体(single-chain fragment variable,scFV)、跨膜区(transmembrane region,TM)和胞内信号区-免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)组成，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD3ζ。该种CAR-T细胞可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et.al.Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-celllymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxicpathways,Cancer Res2007,67(22):11029-11036.]。
随后发展的第二代CAR-T细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR-T在体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et.al.CD28costimulation improves expansion and persistence ofchimeric antigen receptor modified T cells in lymphoma patients.J ClinInvest,2011,121(5):1822-1826]。
近些年发展的第三代CAR-T细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR-T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C.,et al.Control of large established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28andCD137domains.PNAS,2009,106(9):3360-3365.]。
CAR-T细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，目前，CAR-T细胞临床试验的细胞来源大多数都是取自患者自身的外周血T细胞，这样会导致如下三个十分显著的问题：1)患者的外周血采集后需要10-14天才能完成CAR-T回输，这段时间可能错过病人治疗的最佳时机；2)患者由于进行过多种治疗(例如，放化疗)，会使其T细胞活性过低，无法保证回输CAR-T的量；3)患者可能不适宜采血。这一短板严重制约着CAR-T细胞用于个体化治疗的应用和市场推广。另外，在同种异体的环境中，使用供体来源的CAR-T细胞会在患者体内引起免疫排斥反应。
综上可知，本领域迫切需要建立一种克服上述缺陷的制备CAR-T细胞的方法。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种制备CAR-T细胞的方法，该方法简单易行，易于工业化生产。
本发明的第二目的在于提供一种所述的方法制得的CAR-T细胞，该CAR-T细胞有效性更好，安全性更高，并且消除了个体之间的排斥反应。
本发明的第三目的在于提供含有上述CAR-T细胞的组合物。
本发明的第四目的在于提供上述CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种制备CAR-T细胞的方法，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到所述CAR-T细胞。
本发明提供的制备CAR-T细胞的方法，将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到CAR-T细胞，能够工业化生产制备用于个体化治疗的CAR-T细胞，制得的CAR-T细胞消除了个体之间的排斥性，该方法制备得到的CAR-T细胞的有效性更好、安全性更高。
进一步地，所述CD3阳性T细胞采用以下方式制备：
从脐带血中制得脐带血单核细胞，然后从所述脐带血单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞。
其中，脐带血是从脐带中制得，脐带可使用医院废弃的脐带，也可通过市售直接购买脐带血，如购买自各省的脐带血库。
进一步地，所述从脐带血中制得脐带血单核细胞的步骤具体为：
所述脐带血按体积比1:0.8-1.2加入DPBS或者生理盐水，得到稀释的脐带血细胞；
所述稀释的脐带血细胞与淋巴细胞分离液混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；
得到的白膜层细胞与无血清细胞培养基(包括但不限于Lonza x-vivo 15培养基)混合后离心，沉淀即为所述脐带血单核细胞。
采用上述步骤将脐带血通过逐步分离得到的脐带血单核细胞纯度高。
采血容器内壁覆盖抗凝剂，采集脐带血时，边采集边摇晃使得脐带血与抗凝剂充分混合，以防止得到的脐带血凝固，从而保证从脐带血中制得单核细胞的质量以及量。
进一步地，从所述脐带血单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞采用偶联CD3/CD28抗体的磁珠进行。
具体地，脐带血单核细胞进行计数，按照数量为1:1的比例加入偶联CD3/CD28抗体的磁珠，轻轻震荡20min，利用磁力架，得到CD3阳性的T细胞。
该方法分离得到的CD3阳性的T细胞纯度高，且不影响其自身的活性。
进一步地，制备得到的CD3阳性T细胞还包括进一步培养的步骤；
所述培养采用的培养基为Lonza x-vivo 15培养基。
Lonza x-vivo 15培养基通过市售购买即可。
通过将得到的CD3阳性T细胞进一步培养，得增加其数量，并且培养得到的CD3阳性T细胞活性高。
另外，本发明中包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞是将包含CAR的病毒与CD3阳性T细胞共培养，使包含CAR的病毒侵入CD3阳性T细胞。侵染时，MOI一般为2-4。
另外，本发明中包含CAR的病毒使用CN105177031A公开的pLenti-CMV-Egfp-F2A-CAR重组载体的慢病毒即可。
本发明还提供了上述方法制得的CAR-T细胞。
本发明制得的CAR-T细胞排除了个体之间的差异性，消除了个体之间的排斥性，制备得到的CAR-T细胞的有效性更好、安全性更高。
本发明还提供了含有上述CAR-T细胞的组合物。
为了制得的组合物便于使用和保存，进一步地，所述组合物还包含辅料。
进一步地，所述辅料为药用的稀释剂或赋形剂。
本发明还提供了所述的CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了制备CAR-T细胞的方法，该方法简单易行，制得的CAR-T细胞消除了个体之间的排斥性，该方法制备得到的CAR-T细胞的有效性更好、安全性更高。
(2)本发明还提供了上述制备方法制得的CAR-T细胞。
(3)本发明还提供了含有上述CAR-T细胞的组合物。
(4)本发明还提供了所述的CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例4中培养CD3阳性T细胞的效果曲线图；
图2为本发明实验例1中制得的CAR-T细胞中CAR表达率的结果图；
图3为本发明实验例2中制得的CAR-T细胞与外周血CAR-T细胞体外杀伤的对比图；
图4为本发明实验例3中制得的CAR-T细胞在体内验证的安全性和有效性的结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
脐带血的采集
对切断后的胎儿脐带清洁后进行采血，采血前使采血管壁充分覆盖抗凝剂；
然后将采血袋置于低于脐带的位置，将采血针刺入脐静脉充盈处的下端，利用重力及挤压使脐带血进入采血袋中；
边采集脐血边轻轻摇晃采血袋，使脐带血与抗凝剂充分混和；
当脐静脉塌陷、变白或者采集袋中的脐带血停止流入时即可终止采集脐带血；
采集的脐带血于4℃冰箱中暂存，并在24小时内经由配备有恒温设备的转运车运至GMP实验室进行分离和培养。
实施例2
脐带血单核细胞的制备
用移液管吸取DPBS或者生理盐水加入到采集的或是市售购买的脐带血中(体积比为1：1)以稀释脐带血细胞；
将脐带血细胞稀释液缓慢加入装有淋巴细胞分离液(Ficoll或者Histopaque-1077)的离心管中，以800g离心20-30分钟后，吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞；
吸取的白膜层细胞转入一个新的离心管中，加入Lonza x-vivo 15无血清细胞培养基，离心后弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀，即得到脐带血单核细胞。
实施例3
从脐带血单核细胞中富集CD3阳性T细胞
将实施例2中得到的脐带血单核细胞进行计数，按照1:1的比例加入偶联CD3/CD28抗体的磁珠(beads)，轻轻震荡20min，利用磁力架，得到CD3阳性的T细胞。
实施例4
制备CAR-T细胞
将CD3阳性T细胞用Lonza x-vivo 15培养基进行培养，培养结果如图1所示。
将实施例3中得到的CD3阳性T细胞用Lonza x-vivo 15培养基(含IL-2、IL-7、IL-15等细胞因子以及灭活AB血浆)进行培养。48小时后，细胞激活状态良好同时细胞数目基本维持不变，用含CAR的慢病毒(该病毒为pLenti-CMV-Egfp-F2A-CAR重组载体的慢病毒，参见发明专利公布号为CN 105177031A)以一定的MOI(2-4)对培养的细胞进行感染。12小时后，进行全量换液，以去除感染用的病毒，然后继续培养；根据细胞长势在后续的培养过程中进行细胞半换液，以补充细胞生长过程中所需的营养物质。
细胞培养结束后，取样后分装至取样管中，标记后送至第三方进行质控检测。
其中，全量换液：收集细胞悬液，离心弃上清，加入新培养基重悬培养。
细胞半换液：收集细胞悬液，离心后，将旧培养基转移至培养瓶后，旧培养基与新培养基以比例1：1或者其它比例(1:2，1:3，1:4等)重悬细胞。
实验例1
将制得的CAR-T细胞中衣原体、支原体、内毒素以及微生物进行检测，制得的CAR-T细胞中衣原体、支原体、内毒素以及微生物进行检测结果均为阴性；
将制得的CAR-T细胞进行CAR表达率的检测，结果如图2所示。
从图2可以看出，制得的CAR-T细胞中CAR的表达率在50％以上。
实验例2
对脐带血制成的CAR-T细胞与外周血CAR-T细胞进行体外杀伤对比，具体实验步骤如下：
第一步：Calcein-AM标记靶细胞
1)将Calcein-AM用DMSO稀释成1mg/mL；
2)将靶细胞用全培养基重悬成1×106/mL的密度；
3)加入15μM的Calcein-AM，37℃、5％CO2培养30min，每10min轻轻混匀；
4)1500rpm离心，去上清，用全培养基重悬，重复两遍；
第二步：杀伤
1)将标记好的靶细胞按照5000-50000个/mL的密度重悬，取100μL加入到96孔板中；
2)按照适当的ET比加入100μL效应细胞，每组3个平行；同时，有单独的A组6个平行，只有靶细胞(spontaneous release)；有单独的B组6个平行，只有靶细胞+2％Triton X-100(maximum release)；
第三步：
1)37℃、5％CO2培养4小时后，离心，取75μL上清，转移到一个新的培养板上；
2)样品利用pectramax Gemini dual-scanning microplatespectrofluorimeter检测(excitation filter:485±9nm；band-pass filter:530±9nm)，数据以AFU的形式显示；
3)计算细胞裂解的百分比：[(test release-spontaneous release)/(maximumrelease–spontaneous release)]*100。
得到的结果如图3所示。
从图3可以看出，脐带血CAR-T杀伤能力与一般外周血CAR-T杀伤能力基本一致。
实验例3
3.1对制得的CAR-T细胞体内验证其安全性和有效性。
首先利用肿瘤模型小鼠验证CAR-T细胞的有效性，具体步骤如下：
一、淋巴瘤小鼠模型的构建：
1.细胞系：人淋巴瘤细胞系Daudi；
Daudi细胞是人淋巴瘤细胞系，可以通过皮下注射的方式构建小鼠的人淋巴瘤模型。其CD19表达为阳性，可以作为IM19CAR-T细胞的靶细胞。
2.细胞培养
A.Daudi细胞培养(1640+20％FBS)
计数并测定活率，离心后用生理盐水重悬，调整其活细胞浓度为3×108个/mL，总数达1.8×109个。
B.T细胞培养
计数并测定T细胞的活率，离心后用生理盐水重悬，调整其浓度为5×105个/mL，总数达到6×105个。
C.CAR-T细胞培养
测定CAR-T细胞的CAR含量百分比，计数并测定活率，离心后用生理盐水重悬，调整有效CAR-T细胞(活细胞且CAR表达为阳性，本实验例中所提到的CAR-T细胞，均指有效CAR-T细胞)的浓度并准备CAR-T细胞。
3.细胞系接种
用生理盐水重悬Daudi细胞，调整其活细胞浓度为3×108个/mL，在冰上将其与Matrigel按照2：1的体积比充分混匀。通过皮下注射的方式进行接种。
以成功长出100mm3的肿瘤作为小鼠淋巴瘤模型构建成功的判定标准。其中肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm2)×0.5；
4.小鼠淋巴瘤模型给药。记录给药当天为D0，计算出接种当天的时间。通过尾静脉注射的方式进行给药，所有小鼠均单次给药，具体给药如表1所示。
表1给药具体信息
组别 给药细胞 给药体积(μL) 给药量(个/只)
空白组 无(PBS) 200 0
阴性对照组 脐带血T细胞 200 1×106
实验I组 脐带血CAR-T细胞 200 1×106
二、药效评价：
1、小鼠观察
从购入小鼠起，至给药后4周连续每天观察小鼠的生存状况，严格监控动物的体格特征，记录可能发生的不良情况如体重减少10％以上、脱毛、腹泻、结膜炎以及瘫痪等情况。经观察得知，三个组别之间无明显差异。
2、体重测定
分组时测定小鼠体重后随机分组；接种前和给药前分别测定小鼠体重；给药后每周2次测定小鼠体重。体重能反映出小鼠健康状况以及肿瘤增殖情况。用电子天平测量小鼠体重，小数点后保留一位有效数字。经测定得知，三个组别之间无明显差异。
3、肿瘤体积的测量
接种前测定小鼠的肿瘤体积(有肿瘤的情况)，接种后每周2次测定小鼠的肿瘤长径和短径，由此计算肿瘤体积。肿瘤体积能反映出小鼠体内肿瘤的增殖情况。用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm2)×0.5。比较各剂量组之间的差异以及各剂量组与阴性对照组之间的差异。具体结果如图4所示。
4、小鼠生存期的测定
每天观察小鼠的生存状况，当小鼠肿瘤体积达到3000mm3即记为死亡，记录接种后4周内每只小鼠死亡的时间及组别并统计，4周后肿瘤体积未达到3000mm3则记为存活小鼠。统计每组小鼠的平均生存时间。生存期反映了小鼠体内肿瘤的增殖情况。用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径2(mm2)×0.5。经测定得知，相对于其他两个组，CAR-T细胞治疗组能显著延长生存期。
5、肿瘤重量测定
肿瘤体积未达到3000mm3的小鼠，在D28对小鼠进行腹腔麻醉，解剖并剥离其肿瘤组织，测定其重量。肿瘤重量反映了小鼠体内肿瘤的增殖情况。用电子天平测量小鼠体重，小数点后保留一位有效数字。经测定得知，CAR-T细胞治疗之后肿瘤重量基本不增加，而T细胞治疗组治疗之后肿瘤重量增加，PBS组也显著增加，即实验I组与空白组和阴性对照组治疗效果有显著性差异。
上述结果可以看出，本发明提供的CAR-T细胞可以显著抑制模型动物中的肿瘤生长，具备抗肿瘤的功能。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，是将包含CAR的病毒感染CD3阳性T细胞得到所述CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CD3阳性T细胞采用以下方式制备：
从脐带血中制得脐带血单核细胞，然后从所述脐带血单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述从脐带血中制得脐带血单核细胞的步骤具体为：
所述脐带血按体积比1:0.8-1.2加入DPBS或者生理盐水，得到稀释的脐带血细胞；
所述稀释的脐带血细胞与淋巴细胞分离液混合，离心，吸取离心后的白膜层细胞；
得到的白膜层细胞与无血清细胞培养基混合后离心，沉淀即为所述脐带血单核细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，从所述脐带血单核细胞中富集得到CD3阳性T细胞采用偶联CD3/CD28抗体的磁珠进行。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备得到的CD3阳性T细胞还包括进一步培养的步骤；
所述培养采用的培养基为Lonza x-vivo 15培养基。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备得到的CAR-T细胞。
7.含有权利要求6所述的CAR-T细胞的组合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含辅料。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述辅料为药用的稀释剂或赋形剂。
10.权利要求6所述的CAR-T细胞在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
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