CN106222169A - 长链非编码rna apoc1p1-3基因及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及长链非编码RNA(LncRNA)APOC1P1-3基因及其在乳腺癌中的用途，经实验证实，所述的LncRNA-APOC1P1-3抑制乳腺癌细胞凋亡，促进乳腺癌细胞增殖，在乳腺癌标本和乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MB-231中APOC1P1-3显著升高，并且通过抑制凋亡相关蛋白Bid、Bax及Cleaved caspase3而抑制乳腺癌细胞的早期凋亡，促进乳腺癌生长。本发明为乳腺癌诊疗靶点提供了新的基因资源，进一步，所述的长链非编码RNA(LncRNA)APOC1P1-3基因可用于制备治疗乳腺癌的药物中。

Description

长链非编码RNA APOC1P1-3基因及其用途

技术领域

本发明属生物医学技术领域，涉及长链非编码RNA APOC1P1-3基因及其用途，具体涉及APOC1P1-3基因及其在制备治疗乳腺癌药物中的用途。

背景技术

据报道，乳腺癌已是女性最常见的恶性肿瘤之一，尤其近年来，我国乳腺癌发病率具有上升趋势，其发病率已位于女性恶性肿瘤之首，而且乳腺癌的致死率已经达到了女性恶性肿瘤死亡人数的14％，严重威胁女性健康和生命(Eccles，S.A.，et al.Criticalresearch gaps and translational priorities for the successful prevention andtreatment of breast cancer.Breast Cancer Res，2013.15(5):p.R92)。虽然手术、化疗、内分泌干预治疗乃至中医治疗在乳腺癌的治疗上已经比较完善，但是仍有很多患者因在治疗期间产生耐药，复发转移而导致死亡。业内共识，早期诊断和防治复发转移是控制乳腺癌死亡发生的关键因素，而目前对乳腺癌的发病机制研究尚未阐述完善，还不能有效地做出早期诊断。因此，进一步探索乳腺癌发生发展的精确分子机制，为乳腺癌早期诊断和治疗提供新的靶点具有重要意义。

长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度在200nt～100kb的RNA分子。哺乳动物基因组序列中4％-9％的序列产生的转录本是lncRNA(Wilusz，J.E.，H.Sunwoo and D.L.Spector，Long noncoding RNAs:functional surprises fromthe RNA world.Genes Dev，2009.23(13)：p.1494-504)，而人类基因组大概可以产生7000～23000条lncRNA(Ponting，C.P.，P.L.Oliver and W.Reik，Evolution and functions oflong noncoding RNAs.Cell，2009.136(4):p.629-41)。这些序列不编码蛋白或者编码很短的多肽，曾一度被认为是基因组转录的“噪音”。近年研究表明，lncRNA由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ(Iacoangeli，A.，et al.，BC200 RNA in invasive and preinvasive breastcancer.Carcinogenesis，2004.25(11):p.2125-33)转录而来，可分布于胞浆或胞核，通过碱基完全或者不完全配对而与DNA或RNA结合，亦可通过形成某些类似“模体”的高级结构与蛋白结合，或作为脚手架介导蛋白与核酸的相互作用(Hung，T.and H.Y.Chang，Longnoncoding RNA in genome regulation:prospects and mechanisms.RNA Biol，2010.7(5):p.582-5)从而参与基因组印记、染色体修饰、转录激活、转录后调控、蛋白功能调节等多种重要的信号转导过程，广泛参与机体的生理和病理过程。

多种长链非编码RNA在肿瘤中的作用已经得到了广泛的证实。人类组织正常表达MALATI(Metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1)，而在非小细胞肺癌、乳腺癌、***癌、肝癌等肿瘤中均发现其表达上调，MALAT1的表达异常预示着非小细胞肺癌的高转移潜能和较差的预后。有研究发现一种肿瘤中可有多种长链非编码RNA表达异常，而一种长链非编码RNA也可在多种肿瘤中上调或下调；也有长链非编码RNA与特定肿瘤关系密切，如PCGEM1(Prostate Special Gene 1)，DD3(Differential Display Code 3)and PCNCR1(Prostate Cancer Non-coding RNA 1)只与***癌有关(Chung，S.，et al.，Association of a novel long non-coding RNA in 8q24 with prostate cancersusceptibility.Cancer Sci，2011.102(1):p.245-52)，HULC(Highly Upregulated inLiver Cancer)在肝癌的原发灶及结直肠癌肝转移灶中表达升高，但是在结直肠癌的原发灶和其他转移灶中表达却未见异常(Matouk，I.J.，et al.，Highly upregulated in livercancer noncoding RNA is overexpressed in hepatic colorectal metastasis.Eur JGastroenterol Hepatol，2009.21(6):p.688-92.Panzitt，K.，et al.，Characterizationof HULC，a novel gene with striking up-regulation in hepatocellular carcinoma，as noncoding RNA.Gastroenterology 2007.132(1):p.330-42.)，说明HULC特定地表达在肝脏肿瘤中。这些特异性表达的lncRNA可以作为肿瘤诊断的标志和预后判断的因子，更具有临床意义的是它们是潜在的药物靶点，为肿瘤的治疗提供了新的思路。

近年在乳腺癌、肝细胞癌、***癌、肺癌、白血病等恶性肿瘤研究中均发现lncRNA的表达发生变化，强烈地提示了lncRNA在恶性肿瘤的发生发展中不可忽视的作用，显示了其潜在的、重要临床价值。但LncRNA相对于广为人知的小分子RNA而言，其研究进展相当缓慢，其数量、种类、结构、功能都不十分明确，尤其在乳腺癌中发现的lncRNA及其调控机制还所知甚少。LncRNA-APOC1P1-3的病理作用迄今尚未见报道，基于现有技术的现状，本申请的发明人拟通过LncRNA-APOC1P1-3其在乳腺癌高表达并与乳腺癌细胞凋亡有关的研究，进一步为乳腺癌的诊断和治疗提供新的靶点，这对提高乳腺癌的诊治水平具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供长链非编码RNA：APOC1P1-3基因及其在对乳腺癌细胞的调控作用以及在制备治疗乳腺癌药物中的用途。

基于现有技术的研究，已知APOC1P1基因定位在人类第19号染色体，位于载脂蛋白C-I和载脂蛋白C-IV长之间，长度为631bp。此基因编码出三个RNA转录本，且都属于LincRNA家族，本申请公开了其中的第三个转录本——LincRNA-APOC1P1-3，即为本发明所首次提出的LncRNA。在本发明之前，尚无任何关于APOC1P1-3基因在人类乳腺癌中的表达及作用的报道，也无在其他疾病中的报道。

本发明在乳腺癌中筛选出表达差异显著的lncRNA-APOC1P1-3基因；并且经分层聚类分析结果显示，该差异表达的lncRNAs能将癌组织和癌旁组织进行正确的分类(如图1所示)，说明lncRNA在乳腺癌组织中存在特征性的表达。本发明的一个实施例中，利用5例人乳腺癌组织标本及配对的癌旁标本，通过Human LncRNA Microarray v2.0芯片进行杂交，对乳腺癌组织与对应的癌旁组织中lncRNA的表达谱差异进行筛选首次在乳腺癌中筛选出的差异表达的lncRNA，即APOC1P1-3基因。

本发明中，使用Quantitative Real-time PCR的方法验证芯片结果的可靠性；利用28对新鲜冰冻的人乳腺癌组织标本、对应的癌旁组织标本和乳腺癌上皮细胞及乳腺癌细胞株进行验证。如图2所示，荧光定量PCR的结果显示，相对于癌旁组织，LncRNA-APOC1P1-3在乳腺癌组织中的表达绝对量及相对量均明显上调(*P<0.05vs para-tumoral)，这些差异与芯片筛选出的结果一致；结果还显示，乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、MDA-MB-231细胞的lncRNA APOC1P1表达水平均显著高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A(n＝3,*P<0.05vs MCF-10A)。

本发明提供了APOC1P1-3基因对乳腺癌细胞的调控作用以及在制备治疗乳腺癌药物中的用途。

本发明通过实验证实，所述APOC1P1-3基因抑制乳腺癌细胞的早期凋亡，促进乳腺癌的生长，其调控机制与凋亡蛋白Bid、Bax和Cleaved caspase3有关。

本发明提供了APOC1P1-3基因的siRNA(序列见表2)，siRNA转染体外培养的MDA-MB-231细胞，通过荧光定量PCR检测siRNA干扰效率，如图4所示，siRNA-196可以显著降低APOC1P1-3在MDA-MB-231细胞中的表达(n＝3,*P<0.05vs Blank)。

本发明使用CCK-8试剂盒检测不同处理组之间的细胞活性，连续检测0h、24h、48h和72h，结果显示，培养48h后，siRNA-196组的细胞活性显著降低(n＝3,*P<0.05vs Blank)(如图5所示)；

本发明进行了干扰MDA-MB-231细胞的APOC1P1-3表达实验，用AnnexinⅤ、FITC联合染色，然后利用流式细胞仪检测该细胞凋亡的变化，结果显示，siRNA-196组早期凋亡的细胞数目明显高于空白组和阴性对照组并且有显著的统计学意义(n＝3,*P<0.05vsBlank)，(如图6所示)。

本发明进一步通过Western Blot检测凋亡通路中相关蛋白的变化，结果如图7所示：siRNA-196干扰APOC1P1-3的表达后，凋亡相关蛋白Bid和Bax表达上调，Pro-caspase3表达减少而Cleaved caspase3表达增加(n＝3,P>0.05vs Blank)。

表2 siRNA序列

本发明提供了一种稳定过表达APOC1P1-3的质粒。

首先将目的基因全长克隆到载体pcDNA3.1+的BamHI和XhoI位点间，通过转染到MCF-7细胞中使基因APOC1P1-3过表达。为了验证克隆载体是否正确地***目的基因，挑取阳性克隆扩增后提取质粒测序。测序结果显示，APOC1P1-3基因正确克隆到pcDNA3.1+。

表3 APOC1P1-3基因全长碱基组成(测序结果黑色标注)：

CAACCAAGCCCTCCAGCAAGGATTCAGGTTGGTGCCCCTCCGGCCTCGCCATGAGGCTCTTCCTGTCGCTCCCGGTCCTGGTGGTGGTTCTGTCGATCGTCTTGGAAGGCCCAGCCCCAGCCTAGGGGGCTCCAGAAGTCTCCAACCCCTTTGATGGCCTGGAGGAGTTAGGAAAGACCCTGGAGGACTACACTCGGGAATTCATCAACCGCATCACACAGAGTGAACTTCCTGCCAAGATGTGGGATTGGTTTTCAGAGACATTTCGGAAAGTGAAGGAGAAACTCAAGACTGACTCATGAGGACCTGAAGGGTGACATCCCAGGAGGGGCCTCTGAAATTTCCAACACCCCAGCGCCTGTACTGAGGACGCCCTCCATGTGTGTCCAATGTGGTCACACGCCCAGGTGTGACCAATAAAAATCCTATGGAAAATTCTCTCTGGCCAGGCATGGTGGCTGACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCGGGCGGATCACAAGGTCAGGAGATTGAGCCCATCCTGGCTAACACGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAAATAGCCAAGCGTGGTGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAGCTATTCGGGAGGCTGAGGC；

本发明在相对低表达APOC1P1-3的乳腺癌细胞系MCF-7细胞中，采取质粒转染的方法使APOC1P1-3过表达，48h后提起细胞总RNA检测APOC1P1-3表达情况，结果如图8所示：在过表达APOC1P1-3组中(质粒NR_028414组)，APOC1P1-3的表达水平明显增高，P<0.05；最后在对照质粒和带有靶基因的质粒转染MCF-7细胞24h后，细胞1:10倍稀释传代；24h后换成含有G418的培养基进行筛选；筛选14天后可见克隆长出，将克隆消化稀释后挑取单克隆进行扩增，实时PCR鉴定稳定筛选的克隆。过表达靶基因的6个克隆APOC1P1-3表达水平显著高于对照组(如图9所示，n＝3,*P<0.05vs mock)。

附图说明

图1：乳腺癌组织中差异表达的lncRNAs(Hierarchical Clustering，ScatterPlot，Box Plot)。

图2：lncRNA APOC1P1-3在乳腺癌组织中的表达水平，n＝28，*P<0.05vs para-tumoral。

图3：lncRNA APOC1P1-3在乳腺癌细胞株中的表达水平，n＝3，*P<0.05vs MCF-10A。图4：RT-PCR检测APOC1P1-3干扰前后的表达水平，n＝3，*P<0.05vs Blank。SiRNA-196能有效抑制APOC1P1-3在MDA-MB-231细胞中的表达。

图5：CCK-8检测细胞活性。MDA-MB-231细胞种于96孔板并转染siRNA，三天后用CCK-8检测细胞的活力，发现SiRNA-196处理后细胞活力显著降低。

图6：各组早期凋亡细胞数目。用AnnexinⅤ、FITC联合染色检测凋亡细胞数目，scrambled siRNA组与siRNA-196组的细胞数目差异显著，后者细胞凋亡明显增多，n＝3，*P<0.05vs Blank。

图7：Western Blot检测凋亡相关蛋白，n＝3，*P<0.05vs Blank。

图8：质粒瞬时转染过表达APOC1P1-3。用MCF-7细胞进行转染来过表达目的基因APOC1P1-3，结果发现过表达质粒的基因表达量明显增高，n＝3，*P<0.05vs mock。

图9：质粒稳定转染过表达APOC1P1-3。MCF-7细胞转染质粒来过表达目的基因APOC1P1-3，在过表达的6个克隆里，基因表达量显著增高，n＝3，*P<0.05vs mock。

图10 GAPDH的溶解曲线。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1、APOC1P1-3基因的芯片筛选和芯片结果验证

(1)提取组织标本总RNA，并用纯化提取的RNA；合成、标记双链cDNA；最后标记的双链cDNA纯化后杂交于Arraystar公司的Human 8x60K LncRNA expression arrayinformation芯片；杂交漂洗之后由Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)扫描仪进行扫描分析；原始数据分析由Agilent Feature Extraction Software软件完成。差异基因的筛选使用配对随机方差模型的方法，差异基因的标准为癌组织中变化表达1.5倍以上及P值≤0.05。芯片结果的原始数据尚未上传。分层聚类分析使用数据是基于筛选得到的差异表达编码蛋白的RNA及非编码RNA的原始表达值，工具使用Standford大学的Cluster_Treeview software软件完成。共表达网络根据校正过的基因表达信号完成。利用R统计环境计算每一对基因间的Pearson相关系数，根据Pearson相关系数的大小筛选出PCC≥0.7结果作为相互关系对并用于构建共表达网络。

(2)RNA提取

1)冰上取0.5g组织置于1.5ml EP管中，加入1.0ml Trizol，剪碎后研磨(60Hz，30s，三次)；2)取出EP管置于冰上，加入氯仿200μl/管，上下颠倒混匀15s。静置8min后，离心(4℃，12000rpm，15min)；3)离心后，小心吸取上层无色液体于新的EP管中；4)加入等体积的异丙醇，轻柔混匀，室温孵育10min(也可放入-20℃过夜)，离心(4℃，12000rpm，15min)。5)弃上清，沉淀加入75％乙醇(DEPC水：无水乙醇＝1:3)1ml，轻弹管壁使RNA小球漂浮，室温静置5min后离心(4℃，7500rpm，5min)；6)枪头小心吸取上清并丢弃，管内沉淀室温静置至完全干燥；7)加入适量DEPC水溶解，轻柔混匀后于-80℃冰箱保存；8)提取的总RNA鉴定：NanoDrop2000分光光度计检测230nm、260nm和280nm处吸光度，并计算RNA浓度；9)RNA完整性鉴定：利用普通琼脂糖凝胶(TAE配制)电泳快速检测RNA的完整性。1μl RNA与5μl 6x上样缓冲液充分混匀，加入1％琼脂糖凝胶上样孔，150V、15min快速电泳，紫外观察条带是否完整，天能凝胶成像***拍照分析；完整的RNA呈现出清晰的三个条带：28s、18s与5s。28s和18s核糖体RNA的条带亮而浓，上面一条带(28s)的密度大约是下面一条带(18s)的2倍；5sRNA条带更小稍微扩散，主要由低分子量的RNA(tRNA和5sRNA)组成；

(3)逆转录(RT)(使用Fermentas RevertAIdTM First Strand cDNA SynthesisKit)

1)在冰上加入：

模板RNA(总RNA) 2μg

Random Primer(0.5μg/μl) 1μl

Nuclease-free Water to 12μl

轻轻混匀，离心3-5sec。

2)65℃孵育5min，迅速冰上冷却；

3)加入下列成分：

轻轻混匀，短暂离心；

4)42℃孵育60min；

5)70℃10min终止反应，冰上冷却。保存于-20℃；

(4)荧光定量实时PCR(Quantitative Real-time PCR)

1)PCR反应体系(20μl)：逆转录后的cDNA用消毒去离子水稀释至浓度为(25ng/μl)Real-time PCR反应体系如下，每一样品采用2复孔；

在每个循环退火与延伸时读取荧光强度；

3)PCR反应结束后作融解曲线以确定产物的特异性

融解曲线的循环参数：自退火温度起每5sec升高0.5℃，直至95℃；

特异性反应产物表现为溶解曲线单峰(以GAPDH为例)

4)Real-time PCR数据分析

Real-time PCR数据以荧光强度△Rn与循环数表示。***△Rn用以下公式表示：△Rn＝(Rn+)－(Rn-)，其中Rn+指产物在任意时间的荧光强度，Rn-指***基底荧光强度(大约在第6至15循环时的荧光强度)。阈值一般设定为log△Rn对循环数函数的中间值，Ct值指当某个样品的△Rn值与该阈值交点处的循环数。该实验采用相对定量，目的基因cDNA相对于内参GAPDH增加的倍数用下面的公式表示：变化倍数＝2-△△Ct，其中△△Ct＝(Ct目的－Ct GAPDH)Time x－(Ct目的－Ct GAPDH)Time 0.Time x指任意时间点而Time 0则指对照组。用标准曲线来检测用2-△△Ct方法表示的相对定量和基因绝对量的平行关系；

5)引物设计如表4所示：

表4引物序列

实施例2、siRNA转染

⑴转染前一天，按表4将3.0x10⁵个MDA-MB-231细胞接种于6孔板上，含10％NBS和抗生素的L-15培养基中正常培养；⑵转染前将培养液更换成无血清无抗生素的培养基；⑶在250μlOpti-MEM培养基中加入100pmol siRNA，柔和混匀；⑷在250μlOpti-MEM培养基中加入10.0μl2000，轻柔混匀，室温孵育5min；⑸将稀释好的siRNA和2000混合，轻柔混匀，室温孵育20min；⑹将520μl siRNA/2000复合物添加到已更换培养基的培养板中，来回轻柔摇晃细胞板；⑺将细胞板放回培养箱中，6h后更换含血清和抗生素的正常培养基培养，24h-48h后进行相关检测。

表5不同细胞培养板转染时细胞密度

细胞培养用品	细胞密度	24h后的汇合度
			96孔板	1.5x104-5.0x104	70％-90％
24孔板	8.0x104-2.0x105	70％-90％
			12孔板	1.6x105-4.0x106	70％-90％
6孔板	3.0x105-8.0x106	70％-90％
			35mm培养皿	3.0x105-8.0x106	70％-90％
60mm培养皿	1.0x106-2.5x106	70％-90％

表6不同细胞培养板转染所需试剂剂量

实施例3、CCK-8检测细胞增殖

原理：该试剂盒中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被线粒体中的脱氢酶还原为具有高浓度水溶性的黄色甲燃料。生成的甲物的数量与活细胞的数量成正比，即对于同种细胞，颜色的深浅和细胞数目在一定范围内呈线性关系，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析；

按步骤：⑴细胞悬液制备，使浓度为1x104cells/ml；⑵将100μl细胞悬液接种于96孔板中(每个组设置7个复孔)，至于细胞培养箱中培养(96孔板边缘孔用PBS填充)；⑶24h后按3.2.2步骤转染siRNA；⑷转染6h更换培养基时在其中一个96孔板中加入CCK-8(CCK-8：DMEM＝10μl:90μl)，37℃培养箱孵育1h；⑸酶标仪检测细胞在450nm波长处的吸光值；⑹每隔24h测定一板细胞，根据测定结果绘制细胞活性曲线。

实施例4、AnnexinⅤ、FITC Apoptosis Detection Kit检测细胞凋亡

⑴按照3.2.2转染siRNA 48h后，收集细胞(先将上清收集于15ml离心管，再将贴壁的细胞消化后收集于对应的离心管)，2000rpm 5min离心；⑵用1ml预冷的PBS重悬细胞，漂洗2000rpm 5min离心弃上清，重复两次；⑶加入1x Annexin ⅤBinding Solution，制成终浓度为1x106cells/ml的细胞悬液；⑷去100μl步骤⑶中的细胞悬液，加入到新的离心管中；⑸向细胞悬液中加入5μl AnnexinⅤ、FITC结合物，混匀后再加入5μl PI Solution；⑹室温下避光孵育15min；⑺加入400μl 1x AnnexinⅤBinding Solution，轻柔混匀、冰上静置；⑻2h内流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

实施例5、过表达APOC1P1-3

构建一条APOC1P1-3全长表达的pcDNA3.1质粒载体、与APOC1P1-3基因全长反向互补的antisense质粒载体及一条对照载体(由吉玛生物制药有限公司完成)。得到质粒后将质粒稀释至终浓度为0.2ng/μl。

质粒特点(如下图)：①CMV和T7启动子；②基因全长***在BamHI和XhoI位点之间；③氨苄青霉素(AMP)抗性基因，载体可以在含有氨苄青霉素的LB培养基中大量扩增；④新霉素抗性基因(Neo)，含有Neo基因的载体转染细胞后，可以再G418压力下筛选得到稳定表达APOC1P1-3的细胞，可以进行长期基因过表达实验研究。

(1)质粒转化感受态细菌DH-5α：1)预先准备好3.1.10和3.1.11的培养基和水浴锅，将DH-5α置于冰上，使其缓慢融化；2)加入10μl质粒DNA(即2ng)于50μl DH-5α中，轻摇静置于冰上30min-45min；3)取出后立即放入42℃水浴90s热休克细菌，然后冰上静置2min；4)加入400μl LB培养基(无AMP)混匀，37℃摇床摇45min；5)将细菌涂板，晾干后倒置放于37℃恒温箱中培养12h-16h；6)挑取克隆于3ml LB培养基(含AMP)中轻摇，吹散后置于37℃摇床240rmp摇12h-16h使细菌扩增；7)取步骤6)扩增的菌液加入100ml LB培养基中(含AMP)继续于37℃摇床240rmp摇12h-16h。

(2)质粒抽提：1)柱平衡：向吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5ml的平衡液BL，10000rmp 2min离心，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(用平衡液处理过的柱子应当天使用)。2)取100ml步骤3.2.8培养的菌液，室温10000rpm 3min离心收集细菌。注意：菌液较多时，可多次离心并将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌体量以能够充***解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率尽量。吸除上清，为确保上清全部吸取，用吸水纸吸去瓶壁上的水滴。3)向留有菌体沉淀的离心管中加入10ml溶液P1(使用前将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：请务必彻底混悬，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。4)向离心管中加入10ml溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，室温放置5min。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。5)向离心管中加入10ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右，10000rpm 10min离心，使白色沉淀离至管底(可适当增加离心时间)，将全部溶液小心倒入过滤器CS1中(请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器)，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中。注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤。如果菌体过多(>100ml)，推荐延长离心时间至20min-30min。6)向滤液中加入0.35倍滤液体积的异丙醇(加入异丙醇过多容易导致RNA污染)和1/2倍异丙醇体积的5M NaCl，上下颠倒充分混匀转移到CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)。注意：若此处无沉淀出现为正常现象。过滤后滤液会损失，根据损失的不同体积的异丙醇。吸附柱CP5的最大容积为15ml，所以需要多次过柱。7)10000rpm 30min 4℃离心，轻轻倒掉上清液，将吸附柱重新放回收集管中。注意：每次过柱均按此条件操作。8)向吸附柱中加入10ml漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，10000rpm 2min离心，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。重复此步骤一次。9)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温10000rpm 2min离心，弃掉收集管中的废液。10)将吸附柱重新放回收集管中，10000rpm5min离心将吸附柱中残留的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验。为了确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱CP5开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。11)将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1ml-2ml去离子水洗脱，室温放置5min后10000rpm 2min离心。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mlEP管，-20℃保存。注意：洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.5-8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是依据质粒的拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于1ml，体积过小影响回收效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。12)质粒DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染等试验。如果溶解时不使用缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值。

(3)质粒测序(桑尼生物科技有限公司)

抽提的质粒由上海桑尼科技有限公司测序，检测构建质粒的正确性。

测序所用的引物

基因名称 引物名称 引物序列5’—3’

APOC1P1-3 sense Forward GGTCCTGGTGGTGGTTCTGTC

APOC1P1-3 antisense Forward CACATTGGACACACATGGAG

(4)筛选稳定转染细胞：

1)瞬时细胞转染MCF-7细胞15x104接种于24孔板，24h后细胞汇合度达到95％。具体转染步骤同3.2.2siRNA转染。转染后6h无需更换培养基，但是更换培养基不会影响转染效率。转染48h后提取细胞总RNA检测瞬时过表达效率。2)G418杀伤曲线：①G418配制：称取1g G418溶于1ml 3.1.12配制的HEPES溶液中，加蒸馏水至10ml，过滤分装4℃保存。②将MCF-7细胞稀释至1000cells/ml，每孔100μl加入至含有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000μg/ml，培养14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，筛选时用此浓度，维持时使用筛选浓度的一半。3)稳定转染克隆筛选：①按照3.2.12步骤⑴方法于24孔板转染24h后，细胞1:10倍数稀释传代到六孔板中培养；②24h后更换成含有G418(800μg/ml，由杀伤曲线确定)的培养基，每3天更换一次培养基，当有大量细胞死亡时，可以使用维持浓度；③筛选14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大；④挑单克隆：制备细胞悬液，用培养基尽量稀释细胞，在显微镜下用白色的枪头挑取单个细胞移至96孔板中并在96孔板中加入100μl培养基，待逐渐增大后转入48孔板中增殖；4)单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取细胞总RNA，RT-PCR检测目的基因表达情况。

Claims (9)

1.长链非编码RNA APOC1P1-3基因在制备治疗乳腺癌药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA APOC1P1-3基因为APOC1P1基因的第三个转录本，属于LincRNA家族，在乳腺癌中存在特征性表达，且表达量升高。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA APOC1P1-3基因还包括APOC1P1-3基因全长碱基组成，如表3所示。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，其中，所述的APOC1P1-3抑制乳腺癌细胞的早期凋亡，用siRNA-196干扰APOC1P1-3的表达后，凋亡相关蛋白Bid和Bax表达上调，Pro-caspase3表达减少而Cleaved caspase3表达增加。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA APOC1P1-3基因在乳腺癌组织及乳腺癌细胞MCF-7、T47D、MDA-MB-231中特征性表达，且表达量升高。

6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，其中所述siRNA-196干扰APOC1P1-3的表达，所述APOC1P1-3的小干扰RNA的序列如表2所示。

7.一种稳定过表达APOC1P1-3的质粒，其特征在于，使用载体pcDNA3.1+的BamHI和XhoI位点间，通过转染到MCF-7细胞中使APOC1P1-3基因过表达。

8.如权利要求7所述的稳定过表达APOC1P1-3的质粒，其特征在于，其G418杀伤曲线确定筛选时浓度为800μg/ml。

9.一种长链非编码RNA APOC1P1-3基因的荧光定量PCR引物，其特征在于，其序列如表4所示。