CN106222159B - 一种抗衰老共固定化酶及其制备方法 - Google Patents

一种抗衰老共固定化酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，所述过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为8:1～15:1。抗衰老共固定化酶的制备方法，包括以下制备步骤：将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，向混合酶液中加入壳聚糖微球制成混合液；混合液搅拌吸附；加入质量浓度百分数为戊二醛溶液进行交联反应；放置平衡至室温；最后，加入β‑D‑葡萄糖，电磁搅拌后静置，备用。本发明通过过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶协同作用可清除体表在紫外线等外界条件作用下由氧经过二价电子还原产生的过氧化氢，达到延缓衰老的目的。

Description

一种抗衰老共固定化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种共固化酶及其制备方法，具体涉及一种抗衰老共固定化酶及其制备方法。
背景技术
人体内自由基主要分为内源性和外源性自由基。内源性自由基主要来自于机体自身的代谢活动，其中以有氧代谢为主。当体内自由基的产生和清除失衡以后，体内过多的自由基会引发一系列的自由基反应，从而引发脂质过氧化等反应。人有氧生命活动中产生了人体内第一个自由基：超氧阴离子自由基(O2-·)。超氧化物歧化酶能清除超氧阴离子自由基(O2-·)产生过氧化氢，而过氧化氢能穿透细胞膜，这是超氧阴离子自由基(O2-·)所不及的。当过氧化氢进入细胞以后会通过芬顿反应生成氧化性更强的羟基自由基(·OH)。羟基自由基(·OH)是体内活性最强的自由基，能通过抽氢反应、分子重排、双键共轭化、与氧结合，抽氢反应形成脂质过氧化物和脂质自由基(L·)，并通过这种循环形成脂质过氧化的链增长反应，导致脂质分子的不断消耗和脂质过氧化物的大量产生。脂质过氧化作用于细胞膜、核酸、蛋白质和酶类，导致不可逆的损伤，并将这些物质变成氧化物或过氧化物而失去固有的作用，这些作用的不断积累，促使机体衰老。因此，超氧阴离子自由基(O2-·)对细胞的损伤是由歧化反应形成的过氧化氢所介导的。同时，随着年龄的增长，大量过氧化氢在头发中的积累会阻碍头发中黑色素的形成，导致头发由内向外逐渐变白。
外源性自由基主要是来自炒菜的油烟、辐射、吸烟、酗酒、日光暴晒等，人的皮肤每天处于空气、污染、辐射、紫外线等环境中，会在空气中形成大量的自由基，正常情况下这些自由基产生后很快就会消失，但当其与空气中的颗粒集合后，会形成稳定的自由基，对人体皮肤甚至机体造成侵蚀。表现为皮肤暗黄，无光泽，松弛无弹性，甚至发生色素沉积，出现斑点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是经常被电脑辐射或紫外线照射、以及酗酒或熬夜的人群，会出现皮肤粗糙、色素沉积的现象，目的在于提供一种抗衰老共固定酶及其制备方法，通过过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶协同作用可清除体表在紫外线等外界条件作用下由氧经过二价电子还原产生的过氧化氢，达到延缓衰老的目的。
本发明通过下述技术方案实现：
一种抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，所述过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为8:1～15:1。
优选地，所述过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力配比为9:1～12:1。
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液进行搅拌吸附；
d、在完成c步骤后加入戊二醛溶液进行交联反应；
e、静置，平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入β-D-葡萄糖，电磁搅拌后，静置，备用；
其中，a步骤中，所述过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为8:1～15:1或9:1～12:1。
优选地，所述a步骤中，磷酸盐缓冲液的pH为3～8，浓度为0.1～0.5mol/L；所述c步骤中，混合液在20～50℃，pH为5～7的条件下，搅拌吸附40～55min；所述d步骤中，加入戊二醛溶液的质量浓度百分数为1.5～3.5％。
优选地，所述过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g。
优选地，所述a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):2(g)～5(mL):4(g)。
将本发明的抗衰老共固化酶作用于体表，可形成致密的抗氧化保护层，有利于清除体表在紫外线等外界条件作用下由氧经过二价电子还原产生的过氧化氢，避免自由基产生和清除失衡，引发自由基链式反应加速人体皮肤的衰老；同时，可通过葡萄糖氧化酶分解共固化酶中的β-D-葡萄糖来清除体表过量的氧及过氧化氢酶分解过氧化氢产生的过量氧，并使体表含氧量达到动态平衡，保持肌肤弹性和白皙；葡萄糖氧化酶分解β-D-葡萄糖时产生葡萄糖酸，葡萄糖酸具有螫合铜离子特性，能帮助抑制了酪胺酸酶的活性，预防黑色素生成，预防老年斑的出现。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明是一种抗衰老共固定化酶及其制备方法，通过过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶协同作用可清除体表在紫外线等外界条件作用下由氧经过价二价电子还原产生的过氧化氢，葡萄糖氧化酶分解共固化酶中的β-D-葡萄糖来清除体表过量的氧及过氧化氢酶分解过氧化氢产生的过量氧，并使体表含氧量达到动态平衡，保持肌肤弹性和白皙，达到抗衰老的目的。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为8:1。
包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比为8:1溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，其中，磷酸盐缓冲液的pH为3，浓度为0.1mol/L；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入3g壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液在20℃，pH为5的条件下，搅拌吸附40min；
d、在完成c步骤后加入质量浓度百分数为1.5％的戊二醛溶液，在5℃的温度条件下交联反应2.5h；
e、放置平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入0.8gβ-D-葡萄糖，电磁搅拌30min后静置，备用。
其中，过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述固体葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g；a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):2(g)。
实施例2
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为9:1。
包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比为9:1溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，其中，磷酸盐缓冲液的pH为5，浓度为0.3mol/L；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入3g壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液在30℃，pH为6.5的条件下，搅拌吸附45min；
d、在完成c步骤后加入质量浓度百分数为2.5％的戊二醛溶液，在5℃的温度条件下交联反应2.5h；
e、放置平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入0.8gβ-D-葡萄糖，电磁搅拌30min后静置，备用。
其中，过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述固体葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g；a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):3(g)。
实施例3
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为10:1。
包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比为10:1溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，其中，磷酸盐缓冲液的pH为5，浓度为0.3mol/L；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入3g壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液在30℃，pH为6.5的条件下，搅拌吸附45min；
d、在完成c步骤后加入质量浓度百分数为2.5％的戊二醛溶液，在5℃的温度条件下交联反应2.5h；
e、放置平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入0.8gβ-D-葡萄糖，电磁搅拌30min后静置，备用。
其中，过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述固体葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g；a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):3(g)。
实施例4
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为12:1。
包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比为12:1溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，其中，磷酸盐缓冲液的pH为5，浓度为0.5mol/L；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入3g壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液在30℃，pH为6.5的条件下，搅拌吸附45min；
d、在完成c步骤后加入质量浓度百分数为2.5％的戊二醛溶液，在5℃的温度条件下交联反应2.5h；
e、放置平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入0.8gβ-D-葡萄糖，电磁搅拌30min后静置，备用。
其中，过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述固体葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g；a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):3(g)。
实施例5
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为14:1。
包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比为14:1溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，其中，磷酸盐缓冲液的pH为5，浓度为0.5mol/L；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入3g壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液在30℃，pH为6.5的条件下，搅拌吸附45min；
d、在完成c步骤后加入质量浓度百分数为2.5％的戊二醛溶液，在5℃的温度条件下交联反应2.5h；
e、放置平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入0.8gβ-D-葡萄糖，电磁搅拌30min后静置，备用。
其中，过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述固体葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g；a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):3(g)。
实施例6
一种抗衰老共固定化酶的制备方法，抗衰老共固定化酶，包括过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为15:1。
包括以下制备步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比为15:1溶解于的磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液，其中，磷酸盐缓冲液的pH为8，浓度为0.5mol/L；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入3g壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液在50℃，pH为7的条件下，搅拌吸附55min；
d、在完成c步骤后加入质量浓度百分数为3.5％的戊二醛溶液，在5℃的温度条件下交联反应2.5h；
e、放置平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入0.8gβ-D-葡萄糖，电磁搅拌30min后静置，备用。
其中，过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述固体葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g；a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5(mL):4(g)。
一、性能测试：
将样品对24人进行皮肤涂抹方式观察(其中男16人，女8人，且年龄均为28～30岁)，其中程序员6人，建筑工人6人，文职类6人，销售类6人，分为A、B、C三个组进行对比实验，每组程序员，建筑工人，文职类，销售类各两人。其使用方式为每天早上起床洗脸后和晚上睡前涂抹。建筑工人由于长期暴晒和体力劳动居多，皮肤粗糙，肤色暗黄；程序员和文职类主要是长时间对着电脑辐射；销售类主要为饮酒应酬较多。其中抽烟人数达12人。采用实施例配比和制备方案获得的共固定酶分别用于三组人员，试用时间为两周。通过菲斯凯尔皮肤综合指数测量仪对三组人员试用前和适用后进行测试，其中：
水分测量范围：0～99.9％；理想范围：40～60％；
油分测量范围：5～50％，其数值包含在水分内；理想范围：15～23％；
弹性系数：0～1；理想范围：0.45～0.55。
测试结果数据均为本组成员的平均值。
二、测试结果：
表1 A组皮肤质量测试结果
实施例 水分(％) 油分(％) 弹性
试用前 20 8 0.67
1 25 10 0.61
2 31 13 0.58
3 43 16 0.52
4 40 15 0.54
5 37 13 0.55
6 33 13 0.57
表2 B组皮肤质量测试结果
实施例 水分(％) 油分(％) 弹性
试用前 31 12 0.61
1 37 14 0.59
2 42 17 0.54
3 56 21 0.49
4 53 19 0.50
5 50 16 0.53
6 47 17 0.57
表3 C组皮肤质量测试结果
实施例 水分(％) 油分(％) 弹性
试用前 29 11 0.60
1 39 15 0.57
2 47 19 0.54
3 53 22 0.50
4 52 20 0.52
5 50 17 0.53
6 46 17 0.56
通过表1～3的性能测试结果显示，A、B、和C三组人员在适用前均表现为皮肤暗黄，无光泽，干燥粗糙无弹性，有少量色素沉积，出现斑点。通过调整过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的配比，当过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比最佳配比为10：1，使过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的达到最适催化条件和催化效率，发挥良好了抗衰老效果。低于或高于此配比，均不能达到预期效果。壳聚糖微球通过改变给酶途径可显著提高联合酶效应，控制释放、增加靶向性、增强稳定性、减少刺激等。抗衰老共固化酶作用于体表，可形成致密的抗氧化保护层：过氧化氢酶有利于清除体表在紫外线等外界条件作用下由氧经过二价电子还原产生的过氧化氢，避免自由基产生和清除失衡，引发自由基链式反应加速人体皮肤的衰老；同时，通过葡萄糖氧化酶分解共固化酶中的β-D-葡萄糖来清除体表过量的氧及过氧化氢酶分解过氧化氢产生的过量氧，并使体表含氧量达到动态平衡。通过调节氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力配比，充分发挥二者的协同作用，使过氧化氢酶催化分解过氧化氢的速率与葡萄糖氧化酶催化氧化β-D-葡萄糖的速率达到循环状态的动态平衡，达到抗衰老的目的。同时，葡萄糖氧化酶分解β-D-葡萄糖时产生葡萄糖酸，葡萄糖酸具有螫合铜离子特性，能帮助抑制了酪胺酸酶的活性，预防黑色素生成，预防老年斑的出现。因此使得皮肤质量测试结果表现为：皮肤粗糙程度得到改善，皮肤更具有光泽和弹性，表现的细腻光滑，色素沉积明显减轻。
本发明一种抗衰老共固化酶主要适用于经常被电脑辐射和紫外线照射、酗酒或熬夜的人群，对皮肤干燥、粗糙、纤维组织没有韧性以及色素沉积的人群也有良好的调节作用，其配合到化妆品使用，将会有更好的效果。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种共固定化酶在制备抗皮肤衰老的化妆品中的应用，其特征在于，共固定化酶的制备方法包括以下步骤：
a、将过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶按活力比溶解于磷酸盐缓冲液中制成过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液；
b、向步骤a中制备的混合酶液中加入壳聚糖微球制成混合液；
c、将b步骤制备的混合液进行搅拌吸附；
d、在完成c步骤后加入戊二醛溶液进行交联反应；
e、静置，平衡至室温；
f、在完成e步骤之后加入β-D-葡萄糖，电磁搅拌后，静置，备用；
其中，a步骤中，所述过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的活力比为10：1；
所述a步骤中，磷酸盐缓冲液的pH为3～8，浓度为0.1～0.5mol/L；所述c步骤中，混合液在20～50℃，pH为5～7的条件下，搅拌吸附40～55min；所述d步骤中，加入戊二醛溶液的质量浓度百分数为1.5～3.5％；
所述a步骤配制的过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶混合酶液的体积：b步骤中壳聚糖微球的质量为5mL:2g～5mL:4g；
所述过氧化氢酶的比活力为50000U/mL，pH为6.0；所述葡萄糖氧化酶的比活力为10000U/g。
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Optimal study of Co-immobilized GOD/CAT on Cross-linked Chitosan Microsphere containing L-Lysine;Xiaohua Zhou et al.;《Advanced Materials Research》;20110512;第236-238卷;926-929 *

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CN106222159A (zh) 2016-12-14

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