CN106220319A - 含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，将烘干后的海藻磨成粉末，海藻粉末按照一定的比例加入水中，装入发酵罐后，在一定温度，一定时间下灭菌；种子液制备：筛选得到一株能够降解褐藻酸的发酵菌株YIC～ALG3嗜糖芽孢杆菌，接种至液体培养基培养一定时间；将种子液按照一定质量比加入发酵罐中，在一定条件下发酵，发酵后，调整发酵条件，保存一定时间后，再次调整发酵条件并补充种子液，调整三次后得到嗜糖芽孢杆菌，将嗜糖芽孢杆菌与农业用有机物混匀后造粒，即得含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥。本发明发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。

Description

含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法
技术领域
本发明涉及一种生物有机肥的生产方法。
背景技术
海藻肥料以天然海藻为原料，经过特殊生化工艺处理，提取并保留海藻天然活性成分，精炼浓缩而形成的一种新型有机肥料。海藻肥料具有提高作物产量和品质，抵抗病虫害及不良环境以及改良土壤保持水土的功效，其应用于农业生产有巨大的市场需求和良好的发展前景。但是，要保障海藻肥料的质量，就必须把握好海藻原料和提取工艺两个关键环节。
首先，海藻肥料质量的优劣取决于所用的原料。目前，海藻肥生产企业所用的原料主要以褐藻为主，包括泡叶藻、昆布、海带、马尾藻等。其他藻类如墨角藻、浒苔、石莼、卡帕藻等也有少数企业在用。国外海藻肥企业绝大多数使用褐藻为原料，其中尤以泡叶藻应用最为广泛如Seasol、Maxicrop等知名品牌，实际作用效果也表明泡叶藻是优质的海藻原料。但是，我国沿海没有泡叶藻分布，国内企业采用的原料种类繁杂，品质参差不一，造成海藻肥产品质量良莠不齐，甚至有些厂家打着“海藻肥”的幌子，直接勾兑褐藻酸，黄腐酸、氮磷钾等冒充海藻肥，影响了海藻肥质量，扰乱了海藻肥市场。
其次，决定海藻肥质量的第二个因素是提取工艺。不同的提取工艺对海藻肥活性成分的种类和含量影响巨大。目前，海藻活性成分的提取方法主要有化学法、物理法以及生物法。化学法主要是利用酸、碱及有机溶剂处理海藻细胞，使细胞消解或内源物质增溶，该方法操作简单，容易实现，也是国内外绝大多数海藻肥生产企业采用的方法。但是，化学试剂对海藻细胞内的活性物质成分的破坏是相当大的，并且残留的有机试剂对环境也是潜在的危害。物理法的原理是控制压力，温度等物理环境条件，利用机械力使海藻细胞破碎，内容物释放。该方法虽然工艺清洁、环境友好，但是对于仪器设备的要求严苛，反应条件变化剧烈，成本较高，难以实现大规模生产。生物法包括酶法降解和微生物发酵两种方法，其主要原理是破坏海藻细胞壁结构并降解大分子物质为植物容易吸收利用的小分子物质，该方法反应温和，产物多元化，整个生产过程安全环保无污染，是理想的海藻肥生产方法。
利用微生物发酵法生产海藻肥料的研究相对较少，仅有的几例研究是选用多种微生物对海藻原料进行类似堆肥发酵或好氧发酵处理，存在发酵过程可控性差，发酵周期长，目标产 物不明确等问题，难以满足工业化生产要求的统一，稳定，可控的标准，产品的质量难以保障。
针对农业用微生物的评价指标主要包括菌剂的纯度和单位质量中的菌剂数量。因此，作为现有技术的菌剂制备方法一般是：在微生物适宜生存的温度和pH条件下进行一次发酵工艺，相当于温室培养。
由于目前土壤板结酸化严重，外界气温变化无常，温室培养的微生物菌剂直接投放到土壤中，因不能适应恶劣的土壤环境造成大量死亡，即使有少量存活因无法形成种群效应，也无法发挥微生物菌剂的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，第一、采用性能优良的用于降解褐藻酸的嗜糖芽孢杆菌降解海藻，并模拟土壤自然生态环境，使发酵后的嗜糖芽孢杆菌在投入土壤后，能很快适应环境，确保存活率；第二、提供利用所述嗜糖芽孢杆菌制备嗜糖芽孢杆菌和含有嗜糖芽孢杆菌的海藻生物有机肥的方法，该方法发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于按照以下步骤进行：
将农业用有机物和嗜糖芽孢杆菌菌剂按照质量比40～99∶1～60混匀后造粒，得到含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥；
其中农业用有机物是氨化腐植酸、糠醛渣和蘑菇渣中的一种或任意比例的两种以上；
其中嗜糖芽孢杆菌菌剂按照以下步骤制备而成：
1)、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；
2)、制备产品A：海藻粉末与水按照质量比1～10∶100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将嗜糖芽孢杆菌接种至液体培养基培养20～30小时；
嗜糖芽孢杆菌与培养基之间的体积比为1～10∶100；
3)、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10∶100；
4)、制备产品C：在温度为20℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天，得到产品C；
5)、制备产品D：调整产品C的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品D；
6)、制备产品E：调整产品D的温度至20℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1～10∶100，保存3h～72h，得到产品E；
7)、制备产品F：调整产品E的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品F；
8)、制备产品G：调整产品F的温度至20℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1～10∶100，保存3h～72h，得到产品G；
9)、制备嗜糖芽孢杆菌菌剂：将产品G风干后得到嗜糖芽孢杆菌菌剂。
所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份、琼脂20份和蒸馏水1000份的混合物。
步骤2)所述海藻粉末和水的质量比为4∶100；灭菌温度115℃，灭菌时间25min；制备种子液时，嗜糖芽孢杆菌接种至液体培养基中，培养22小时，得到种子液，嗜糖芽孢杆菌和培养基的体积比例为5∶100；步骤5)和步骤7)中，温度为5℃，保存时间为12h。
步骤4)、步骤6)和步骤8)中，温度为25℃，pH为6.5～7.0；步骤4)发酵时间为8天；步骤6)和步骤8)保存时间为12h；步骤6)中发酵种子液与产品D的质量比以及步骤8)中发酵种子液与产品F的质量比均为5∶100。
步骤5)、步骤6)步骤7)和步骤8)中，调整温度均为每小时调整3℃。
所述海藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，其保藏号为CGMCC No.12155。
发明具有以下有益技术效果：
本发明通过筛选得到一株海洋来源的嗜糖芽孢杆菌，该菌株具有降解褐藻酸的能力，一方面能够降解褐藻酸生成小分子量的褐藻寡糖等易于植物吸收利用的营养成分；另一方面破坏海藻细胞壁结构促使海藻体内更多营养物质得以释放。利用该菌株发酵处理铜藻、鼠尾藻等马尾藻属海藻原料，发酵一定天数后在发酵液中可检测到分子量在4000Da以下、聚合度为2-20的褐藻寡糖，以此发酵液作为海藻肥母液，直接或者复配N、P、K，微量元素，氨基酸，有机质等有效成分用于农作物生长。肥效实验表明，利用该方法获得发酵液能够明显促进植物根系生长，改良土壤微环境，提高作物产量。
本发明还具有以下特点：
1、采用本发明得到的海洋来源的嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3对海藻发酵，发酵过程稳定可控，发酵周期短，产物功效显著，适于规模化生产。
2、本发明得到的嗜糖芽孢杆菌具有水溶性好，易于植物吸收利用，同时作为一种重要的信号分子，能够参与植物的生长调节和诱导抗病过程促进植物的生长，提高植物对不良环境及病虫害的抵抗力。
3、本发明通过缓慢的温度调节，使嗜糖芽孢杆菌适应温度的变化，避免温度变化过快，嗜糖芽孢杆菌不能适应而大量死亡。
4、本发明得到的嗜糖芽孢杆菌在具有海藻提取物特征外，还具有较强的环境适应性，在投入到酸化的土壤中及温度变化无常的环境中，能很快适应环境存活，发挥微生物菌剂的作用。
附图说明
图1是显微观察YIC～Alg3菌株的革兰氏染色及聚集成团现象图。
图2是基于16SrDNA序列构建的YIC～Alg3菌株***发育树示意图。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步说明本发明。
实施例1
将洗净烘干后的新鲜鼠尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比2∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌35min，得到产品A；并制备种子液：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养20小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为2∶100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为1∶100，得到产品B；在温度为20℃，pH5.5～6.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为7天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时20℃的温度变化调整温度至5℃，保存24h，得到产品D；以每小时20℃的温度变化调整产品D的温度至20℃，pH至5.5～6.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1∶100，保存24h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时20℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存24h，得到产品F；
以每小时20℃的温度变化调整产品F的温度至20℃，pH至5.5～6.0，然后补充种子液，补 充的种子液与产品F的质量比为1∶100，保存24h，得到产品G；将产品G风干后得到嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3；将农业用有机物和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3按照质量比95∶5混匀后造粒，得到含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥。
实施例2
将洗净烘干后的新鲜铜藻和新鲜马尾藻按照质量比1∶1复配，磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比4∶100装入发酵罐中，在115℃条件下灭菌25min，得到产品A；并制备种子液：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养22小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为5∶100，得到产品B；在温度为25℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为8天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至25℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为5∶100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存12h，得到产品F；
以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至25℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为5∶100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3；将农业用有机物和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3按照质量比95∶5混匀后造粒，得到含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥。
实施例3
将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比6∶100装入发酵罐中，在125℃条件下灭菌35min，得到产品A；并制备种子液：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养24小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为8∶100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为4∶100，得到产品B；在温度为30℃，pH7～7.5的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为9天，得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时1℃的温度变化调整温度至5℃，保存18h，得到产品D；以每小时8℃的温度变化调整产品D的温度至30℃，pH至7～ 7.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为4∶100，保存18h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时1℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存18h，得到产品F；
以每小时8℃的温度变化调整产品F的温度至30℃，pH至7.0～7.5，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为4∶100，保存18h，得到产品G；将产品G风干后得到嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3；将农业用有机物和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3按照质量比95∶5混匀后造粒，得到含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥。
实施例4
将洗净烘干后的新鲜马尾藻磨成50～60目粉末；
海藻粉末与水按照质量比9∶100装入发酵罐中，在140℃条件下灭菌15min，得到产品A；并制备种子液：将嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3接种至液体培养基培养20小时；所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155；所述液体培养基为：海藻酸钠5g、硫酸铵5g、硫酸镁1g、磷酸氢二钾2g、硫酸亚铁0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的混合物，pH7.2～7.4；嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3和培养基的体积比例为5∶100。将种子液加入到产品A中，其中种子液与产品A的质量比为8∶100，得到产品B；在温度为35℃，pH6.5～7.0的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为9天得到产品C；调整产品C的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度至5℃，保存12h，得到产品D；以每小时3℃的温度变化调整产品D的温度至35℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为8∶100，保存12h，得到产品E；调整产品E的pH至5.0～6.0，并以每小时3℃的温度变化调整温度温度至5℃，保存12h，得到产品F；
以每小时3℃的温度变化调整产品F的温度至35℃，pH至6.5～7.0，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为8∶100，保存12h，得到产品G；将产品G风干后得到嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3；将农业用有机物和嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3按照质量比95∶5混匀后造粒，得到含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥。
实施例1至4中，所述农业用有机物是糠醛渣。
1材料与方法：
1.1试验地点：五洲丰农业科技有限公司试验基地，中性棕壤，中高肥力。
1.2番茄品种：烟粉2号。
1.3供试肥料：海藻生物有机肥：嗜糖芽孢杆菌≥2亿/克，有机质≥60％，N+P2O5+K2O≥6％，由五洲丰农业科技有限公司提供；普通有机肥：有机质≥60％，N+P2O5+K2O≥6％，由五洲丰农业科技有限公司提供；15-15-15三元复合肥：N≥15％，P2O5≥15％，K2O≥15％，由五洲丰农业科技有限公司提供。
1.4试验设计：试验设6个处理：
处理1(CK1)：普通有机肥；
处理2(CK2)：加入未调整温度和pH的嗜糖芽孢杆菌的海藻生物有机肥；
处理3(T1)：实施例1所述海藻生物有机肥；
处理4(T2)：实施例2所述海藻生物有机肥；
处理5(T3)：实施例3所述海藻生物有机肥；
处理6(T4)：实施例4所述海藻生物有机肥。
每个处理3次重复，随机区组排列，小区面积15m2，定植75株，设保护行。小区单收分别计算产量。
1.5施肥方法：
各处理1亩施300kg生物有机肥和100kg15-15-15三元复合肥作基肥，其他管理同常规。
2结果与分析
2.1番茄不同施肥处理肥料效应分析
由表1可以看出，各海藻生物有机肥与普通有机肥处理相比，均有不同程度的增产。其中实施例2处理增产幅度最大，亩增产1169.0kg、增幅16.3％；几个实施例与加入未调整温度和pH的嗜糖芽孢杆菌的海藻生物有机肥的处理相比也有不同程度的增产效果。总体来说，几个处理的产量顺序为T2＞T3＞T4＞T1＞CK2＞CK1。
表1海藻生物机肥对番茄产量的影响
2.2不同施肥处理土壤中嗜糖芽孢杆菌的活性分析
表2不同处理土壤中嗜糖芽孢杆菌数量
105CFU/g
如表2所示，施入添加嗜糖芽孢杆菌的海藻生物有机肥后，耕层土壤中都有不同数量的嗜糖芽孢杆菌存活，并且存活数量与番茄产量呈正相关关系。其中实施例2处理土壤中嗜糖芽孢杆菌数量最多，达到10.6*105CFU/g，其后T3、T4、T1、CK2依次递减。
本发明所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的保藏号为CGMCC No.12155，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年03月02日，拉丁文分类命名：Bacillus halosaccharovorans。
所述嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3的生物特性如下：
YIC～Alg3菌株在褐藻酸唯一碳源平板上生长48h后，菌落不规则，淡黄色，中间不透明，边缘半透明，表面褶皱。显微镜观察菌株为杆状，在末端或近末端可产生芽孢，革兰氏阳性，能运动，生长后期菌体易聚集成团(图1)。生长温度范围20～45℃，PH范围6～9，NaCl浓度范围0～15％，菌株最适生长温度37℃，最适生长pH 7.5。触酶，氧化酶，VP试验阳性，能够利用葡萄糖，甘露糖，甘露醇，果糖，乳糖，半乳糖，淀粉；不能利用山梨醇，纤维素，。菌株16SrDNA序列见附件1，***发育树如图2所示。根据其生理生化特征，16SrDNA序列及***发育树信息，将该菌株鉴定为嗜糖芽孢杆菌Bacillus halosaccharovorans。
注：+表示可以利用，～表示不能利用。

Claims (7)

1.一种含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于按照以下步骤进行：
将农业用有机物和嗜糖芽孢杆菌菌剂按照质量比40～99:1～60混匀后造粒，得到含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥；
其中农业用有机物是氨化腐植酸、糠醛渣和蘑菇渣中的一种或任意比例的两种以上；
其中嗜糖芽孢杆菌菌剂按照以下步骤制备而成：
1）、制备海藻粉末：将烘干后的海藻磨成粉末；
2）、制备产品A：海藻粉末与水按照质量比1～10:100装入发酵罐中，在100～150℃条件下灭菌15～35min，得到产品A；
并制备种子液：将嗜糖芽孢杆菌接种至液体培养基培养20～30小时；
嗜糖芽孢杆菌与培养基之间的体积比为1～10:100；
3）、制备产品B：将种子液加入到产品A中得到产品B，其中种子液与产品A的质量比为1～10:100；
4）、制备产品C：在温度为20℃～40℃，pH5～9的条件下对产品B进行发酵，发酵时间为6～10天，得到产品C；
5）、制备产品D：调整产品C的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品D；
6）、制备产品E:调整产品D的温度至20℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品D的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品E；
7）、制备产品F：调整产品E的pH至5.0～6.0，温度至3～10℃，保存3h～72h，得到产品F；
8）、制备产品G：调整产品F的温度至20℃～40℃，pH至5～9，然后补充种子液，补充的种子液与产品F的质量比为1～10:100，保存3h～72h，得到产品G；
9）、制备嗜糖芽孢杆菌菌剂：将产品G风干后得到嗜糖芽孢杆菌菌剂。
2.如权利要求1所述的含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于：所述液体培养基的pH7.2～7.4，并按照以下质量比配成：海藻酸钠5份、硫酸铵5份、硫酸镁1份、磷酸氢二钾2份、硫酸亚铁0.01份、琼脂20份和蒸馏水1000份的混合物。
3.如权利要求1所述的含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于：步骤2）所述海藻粉末和水的质量比为4:100；灭菌温度115℃，灭菌时间25min；制备种子液时，嗜糖芽孢杆菌接种至液体培养基中，培养22小时，得到种子液，嗜糖芽孢杆菌和培养基的体积比例为5:100；步骤5）和步骤7）中，温度为5℃，保存时间为12h。
4.如权利要求1所述的含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于：步骤4）、步骤6）和步骤8）中，温度为25℃，pH为6.5～7.0；步骤4）发酵时间为8天；步骤6）和步骤8）保存时间为12h；步骤6）中发酵种子液与产品D的质量比以及步骤8）中发酵种子液与产品F的质量比均为5:100。
5.如权利要求1所述的含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于：步骤5）、步骤6）步骤7）和步骤8）中，调整温度均为每小时调整3℃。
6.如权利要求1所述的含有嗜糖芽孢杆菌菌剂的生物有机肥的生产方法，其特征在于：所述海藻是指鼠尾藻，铜藻和马尾藻中的一种或任意比例的两种以上。
7.如权利要求1所述的含有嗜糖芽孢杆菌和氨基酸的水溶肥的生产方法，其特征在于：所述嗜糖芽孢杆菌是嗜糖芽孢杆菌YIC～Alg3，其保藏号为CGMCC No.12155。
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