CN106198473B - 比率型三维金属增强荧光Pb2+生物传感器的构建 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种比率型三维金属增强荧光纸芯片的制备及其纸芯片设备在Pb²⁺检测中的应用。通过蜡打印技术制备纸芯片的亲水工作区和疏水区，进而在工作区域生长十面体银，经过层层修饰，测定两种荧光信号的荧光强度，通过两种荧光强度比率的变化与Pb²⁺浓度关系曲线，实现Pb²⁺的便携、可靠、高灵敏的检测。

Description

比率型三维金属增强荧光Pb2+生物传感器的构建

技术领域

本发明涉及易携带、操作简单、花费低、灵敏度高及测定结果可信度高的Pb²⁺分析检测技术领域，更具体的说是一种比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的制备。

背景技术

Pb²⁺存在各种资源中（如食品，血液，饮用水，工业废水等等），被称为最有害的重金属离子之一，它不仅引起了一系列环境污染的问题，而且对人类身体健康也构成了严重的威胁，尤其是儿童。例如，长期暴露在富含Pb²⁺环境中，会使人类的中枢神经和泌尿***造成严重的损坏，并且还会通过食物链及饮用水造成智力发展的损坏。更为严重的是Pb²⁺不能够被生物分解，微量的Pb²⁺可能会对人类身体健康造成可怕的危害。因此，高灵敏的检测重金属离子尤为重要。为了达到这个目的，很多的重金属离子检测方法被建立起来，如原子吸收光谱、色谱法、比率型荧光检测方法、电化学发光方法、分子印迹法、光电化学法及荧光方法等。在上述方法中，荧光检测法因其操作简单、灵敏度高、专一等优点受到广泛的关注。但在单一的荧光团的荧光检测方法中，因会受到待测液环境仪器因素以及荧光团自身浓度等影响，将直接导致容易使检测结果产生假阳性，检测结果的准确度有待进一步提高。

比率型荧光检测方法，是指含有两个荧光团，通过测量两个荧光团的荧光强度，利用二者的比值作为信号参量，从而来测定检测物的分析方法。荧光的比值信号不受光源强度和仪器灵敏度的影响。因此，比率型荧光探针可以提高方法的选择性、灵敏度和动态响应范围，从而有效提高了检测结果的准确度。

微流控纸基分析设备，因其低花费、易携带、制备过程简单，而且易于实现小型化检测，被广泛应用在医学、生物样品、环境诊断等领域。比率型荧光检测方法与纸芯片的结合，完美的将纸芯片的低花费、易携带、制备过程简单的优点与比率型荧光检测方法的灵敏度高、专一、测定结果可信度高等优点结合起来，有望解决偏远地区水资源中重金属离子的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种易携带、操作简单、花费低、灵敏度高及测定结果可信度高的比率型三维金属增强荧光纸芯片，以实现Pb²⁺的快速、高灵敏度检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过一种长有十面体银的纸芯片及比率型三维金属增强荧光方法来实现的，其特征是包括以下步骤：

（1）设计如附图1所示比率型三维金属增强荧光纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；

（2）通过蜡打印机将步骤（1）中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片于60-150 ºC下加热，直到蜡融化并浸透整个纸，形成疏水层；

（3）在步骤（2）中得到的纸芯片的亲水工作区域生长十面体银；

（4）将石墨烯量子点功能化的催化链，定义为DNA₁，固定在步骤（3）所得纸芯片的亲水区域，随后用缓冲溶液进行冲洗；

（5）将染料和二氧化铈功能化的Pb²⁺识别基质链，定义为17DS，滴加到步骤（4）所得纸芯片的亲水区域，最后用缓冲溶液进行冲洗；

（6）将不同浓度的Pb²⁺加入到步骤（5）所得纸芯片的亲水区域，随后放入荧光设备中，分别测定在不同浓度的Pb²⁺下石墨烯量子点和染料的荧光强度；

（7）绘制两种荧光强度比率的变化与Pb²⁺浓度关系曲线，完成Pb²⁺的测定。

本发明所述在步骤（2）中得到的纸芯片的亲水工作区域生长十面体银的步骤为：

将1.5 mL 50 mM 柠檬酸钠，1.5 mL 6% 聚乙烯吡咯烷酮，0.15 mL 10 mM精氨酸及0.6 mL 10 mM硝酸银加入到6 mL二次水中，随后在搅拌下加入0.24 mL 0.1 M新鲜制备的硼氢化钠，制得银种子；取20 µL 的银种子滴加到工作区域，在室温下放置45 min，反复滴加三次；将滴加完银种子的纸芯片放在3 W的蓝灯下曝光10 h。

本发明步骤（4）中所述的DNA₁特定的碱基序列以及其5’端修饰上巯基，其3’端修饰上石墨烯量子点。

本发明步骤（5）中所述17DS特定的碱基序列以及其5’端修饰上二氧化铈，其3’端修饰上染料。

本发明所述的染料为：羟基香豆素，藻红蛋白，酞菁荧光探针Cy3，酞菁荧光探针Cy5，酞菁荧光探针Cy7，罗丹明，异硫氰酸酯，罗红霉素，羧基荧光素。

本发明所述比率型Pb²⁺荧光测定步骤，将纸芯片放入荧光皿中，分别测定在不同浓度的Pb²⁺下石墨烯量子点和染料的荧光强度，绘制两种荧光强度比率的变化与Pb²⁺浓度关系曲线，实现Pb²⁺的精确测定。

本发明的有益效果

（1）比率型金属增强荧光方法，测定结果可信度高。

（2）比率型金属增强荧光方法和纸芯片联用，具有便携式、高灵敏、所需费用低、制作简单等特点，有望在资源有限的偏远地区实现Pb²⁺的便携式检测。

（3）纸上生长十面体银，增大了比表面积及有效减少纸的背景荧光，最重要的是使荧光信号放大了几倍，大大提高了Pb²⁺检测的灵敏度。

附图说明

图1：纸芯片的疏水蜡批量打印图案。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面通过实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1

比率型三维金属增强荧光生物传感器在Pb²⁺检测中的应用：

（1）设计比率型三维金属增强荧光纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；

（2）通过蜡打印机将步骤1.1中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片于60-150 ºC下加热，直到蜡融化并浸透整个纸，形成疏水层；

（3）在步骤（2）中得到的纸芯片的亲水工作区域生长十面体银：将1.5 mL 50 mM柠檬酸钠，1.5 mL 6% 聚乙烯吡咯烷酮，0.15 mL 10 mM精氨酸及0.6 mL 10 mM硝酸银加入到6 mL二次水中，随后在搅拌下加入0.24 mL 0.1 M新鲜制备的硼氢化钠，制得银种子；取20 µL 的银种子滴加到工作区域，在室温下放置45 min，反复滴加三次；将滴加完银种子的纸芯片放在3 W的蓝灯下曝光10 h；

（4）将石墨烯量子点功能化的催化链，定义为DNA₁，固定在步骤（3）所得纸芯片的亲水区域，随后用缓冲溶液进行冲洗；

（5）将染料和二氧化铈功能化的Pb²⁺识别基质链，定义为17DS，滴加到步骤（4）所得纸芯片的亲水区域，最后用缓冲溶液进行冲洗；

（6）将不同浓度的Pb²⁺加入到步骤（5）所得纸芯片的亲水区域，随后放入荧光设备中，分别测定在不同浓度的Pb²⁺下石墨烯量子点和染料的荧光强度；

（7）绘制两种荧光强度比率的变化与Pb²⁺浓度关系曲线，完成Pb²⁺的测定。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南大学

<120> 比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tttttttttt ttttttttca tctcttctcc gagccggtcg aaatagtgag t 51

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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Claims (6)

1.比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1.1设计比率型三维金属增强荧光纸芯片的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；

1.2通过蜡打印机将步骤1.1中设计的纸芯片打印上疏水图案，随后将得到的纸芯片于60-150 ºC下加热，直到蜡融化并浸透整个纸，形成疏水层；

1.3在步骤1.2中得到的纸芯片的亲水工作区域生长十面体银；

1.4 将石墨烯量子点功能化的催化链，定义为DNA₁，固定在步骤1.3所得纸芯片的亲水区域，随后用缓冲溶液进行冲洗；

1.5 将染料和二氧化铈功能化的Pb²⁺识别基质链，定义为17DS，滴加到步骤1.4所得纸芯片的亲水区域，最后用缓冲溶液进行冲洗；

1.6 将不同浓度的Pb²⁺加入到步骤1.5所得纸芯片的亲水区域，随后放入荧光设备中，分别测定在不同浓度的Pb²⁺下石墨烯量子点和染料的荧光强度；

1.7绘制两种荧光强度比率的变化与Pb²⁺浓度关系曲线，完成Pb²⁺的测定。

2.根据权利要求1所述的比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建方法，其特征在于，在步骤1.2中得到的纸芯片的亲水工作区域生长十面体银，具体步骤如下：

将1.5 mL 50 mM 柠檬酸钠，1.5 mL 6% 聚乙烯吡咯烷酮，0.15 mL 10 mM精氨酸及0.6mL 10 mM硝酸银加入到6 mL二次水中，随后在搅拌下加入0.24 mL 0.1 M新鲜制备的硼氢化钠，制得银种子；取20 µL 的银种子滴加到工作区域，在室温下放置45 min，反复滴加三次；将滴加完银种子的纸芯片放在3 W的蓝灯下曝光10 h。

3.根据权利要求1所述的比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤1.4中所述DNA₁的 碱基序列以及其5’端修饰上巯基，其3’端修饰上石墨烯量子点。

4.根据权利要求 1 所述的比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤1.5中所述17DS的 碱基序列以及其5’端修饰上二氧化铈，其3’端修饰上染料。

5.根据权利要求 1 所述的比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤1.5中所述的染料为：羟基香豆素或藻红蛋白或酞菁荧光探针Cy3或酞菁荧光探针Cy5或酞菁荧光探针Cy7或罗丹明或异硫氰酸酯或罗红霉素或羧基荧光素。

6.根据权利要求1所述比率型三维金属增强荧光Pb²⁺生物传感器的构建方法，其特征在于，比率型Pb²⁺荧光测定步骤，将纸芯片放入荧光皿中，分别测定在不同浓度的Pb²⁺下石墨烯量子点和染料的荧光强度，绘制两种荧光强度比率的变化与Pb²⁺浓度关系曲线，实现Pb²⁺的精确测定。