CN106191214B

CN106191214B - 一种多色荧光熔解曲线pcr检测方法

Info

Publication number: CN106191214B
Application number: CN201510215155.1A
Authority: CN
Inventors: 杜正平; 熊槐
Original assignee: Igenesis Biotechnology Guangzhou Co ltd
Current assignee: Bio Tech (guangzhou) Co Ltd
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN106191214A

Abstract

本发明涉及多聚酶链反应（PCR）技术领域，特别是涉及一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，该检测方法采用能够与待测靶标基因特异性杂交的条形码探针和能够与条形码探针特异性结合的荧光检测探针，对待测样品中的多个靶标基因同时进行检测，通过在DNA扩增过程中，生成与每一个待测靶标基因对应的特异条形码序列，再由条形码序列经过DNA扩增形成标记了不同荧光基团和淬灭基团的特异性的不同长度的DNA产物，并通过最终的多色荧光熔解曲线分析，从而实现基于熔解曲线分析的PCR多重检测。

Description

一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法

技术领域

本发明涉及多聚酶链反应（PCR），特别是涉及一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法。

背景技术

多聚酶链反应（PCR）是一种利用耐热DNA聚合酶在体外进行基因扩增的技术，在基因克隆/疾病诊断/法医鉴定等多个领域被广泛应用。普通PCR技术需要在扩增之后，对产物进行电泳分析，分析过程繁琐费时。随着TaqMan^TM水解探针的发明，以及双链DNA荧光染料的使用，PCR产物可以通过实时荧光的方法进行分析检测，这种新的PCR技术被称为实时荧光定量PCR。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR具有明显的优势，实时荧光定量PCR技术的DNA扩增与结果检测同时进行，省去了反应后的电泳分析，同时降低了污染的可能性。

现有技术中，应用TaqMan^TM水解探针的实时荧光定量PCR的原理是：在上游引物的下游增加一条识别靶标序列的TaqMan^TM水解探针，探针的5’和3’端分别标记发光基团和淬灭基团，淬灭基团通过荧光共振能量转移（ fluorescence resonance energy transfer，FRET）吸收发光基团的荧光能量，淬灭发光基团的荧光信号，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶与上游引物一起从5’端往3’端延伸，延伸至TaqMan^TM水解探针处时，DNA聚合酶的5’外切核酸酶发挥作用，从5’端开始水解探针，发光基团和淬灭基团发生分离，发光基团被激发并发射荧光。通过在同一反应体系中，设置多条标记不同波长的荧光基团的TaqMan^TM水解探针，可实现多重PCR检测。但是，基于TaqMan^TM水解探针的实时荧光定量PCR检测方法的缺陷在于：一种颜色的荧光基团只能标记一条TaqMan^TM水解探针，检测一个待测基因，因此，其多重检测能力有限。

现有技术中，应用双链DNA荧光染料的实时荧光定量PCR的原理是：双链DNA荧光染料在未嵌入DNA之前，不能被激发，一旦嵌入双链DNA中，就可以被激发并发射特定波长的荧光，在染料过量的情况下，检测到的荧光信号的强弱与反应物中双链DNA的量呈正比，因此可以通过仪器记录荧光信号的强弱来实时检测PCR产物中DNA的浓度。在该技术的基础之上，还发展出了熔解曲线分析法（Melting Curve analysis），熔解曲线分析法是利用不同DNA序列具有不同Tm值（DNA的双螺旋结构降解一半时的温度）的特征，在PCR反应之后，通过逐渐提高反应物的温度，使具有不同Tm值的双链DNA依次变性成为单链DNA，但是，由于荧光染料不能与单链DNA结合被激发，因此，在双链DNA特定Tm值对应的温度下，荧光强度大幅度减弱，熔解曲线分析法利用这一原理可以对PCR产物中不同长度DNA或相同长度不同序列DNA进行分析。

随着对多重PCR检测需求的提高，需要新技术对原有的技术进行升级。但是，由于荧光基团本身发射的不是单一波长的荧光，且PCR仪对不同荧光基团发射的荧光区分度有限，因此，现有的PCR仪只能检测4~6种荧光基团发射的荧光信号，这也使得应用TaqMan^TM水解探针法的实时荧光定量PCR的多重检测能力受到限制。而应用双链DNA荧光染料的实时荧光定量PCR，由于染料不具备特异序列的识别能力，因此，同一反应体系中只能使用一种双链DNA荧光染料。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术中的不足之处而提供一种成本低、多重检测能力更强的多色荧光熔解曲线PCR检测方法及采用该方法检测待测基因的试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

提供一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，包括以下步骤：

a、根据待测靶标基因的特异性序列合成一对序列；

b、合成条形码探针，条形码探针的3’端为待测靶标基因位于两条引物之间的探针序列，5’端为标记淬灭基团的具有一定长度的条形码序列；

c、合成荧光检测探针，荧光检测探针为一条具有茎环结构的序列，其3’端为与所述条形码序列特异性结合的条形码识别序列，5’端序列与3’端序列互补配对，中间为任意一段与待测靶标基因不相关且与条形码序列不相关的序列，3’端和5’端分别标记发光基团和淬灭基团；

d、PCR扩增：

1）每一轮PCR反应中，经过92-97℃变性步骤之后，在50-65℃退火步骤，探针序列与待测靶标基因识别，上游引物和下游引物与待测靶标基因识别；

2）在58-75℃延伸步骤中，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物开始延伸，具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解探针序列，使条形码探针的条形码序列被释放；

3）进入下一轮PCR反应中，在92-97℃变性步骤中，荧光检测探针的茎环结构打开，50-65℃退火步骤中，上一轮PCR循环中释放的条形码序列与荧光检测探针的条形码识别序列特异性结合；

4）进入58-75℃延伸步骤，上一轮PCR循环中的条形码序列以荧光检测探针为模板合成双链DNA产物；

e、多色荧光熔解曲线检测分析PCR产物：

在PCR反应结束之后，以荧光检测探针为模板合成的双链DNA产物，随着温度的升高开始解链，发光基团与淬灭基团与DNA链一起发生分离，发光基团发出的不同波长的荧光被PCR仪检测，根据多色荧光融解曲线分析PCR产物。

熔解曲线分析法是利用不同DNA序列具有不同Tm值的特征，在PCR反应之后，通过逐渐提高反应物的温度，使具有不同Tm值的双链DNA依次变性成为单链DNA，根据这一原理可以对PCR产物中不同长度DNA或相同长度不同序列DNA进行分析。

上述技术方案中，条形码探针3’端的探针序列完全与待测靶标基因互补配对，不完全互补配对的条形码探针不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解释放条形码序列。

上述技术方案中，所述荧光探针体系包括多个条形码探针和多个荧光检测探针，每个荧光检测探针的茎环结构的序列长度不同，从而使得不同的荧光检测探针具有不同的Tm值，在PCR扩增后形成标记了不同荧光基团和淬灭基团的特异性的不同长度的DNA产物，并通过最终的多色荧光熔解曲线分析，在多个荧光通道产生不同Tm值DNA产物特异熔解曲线峰，从而实现基于熔解曲线分析的PCR多重检测。

上述技术方案中，淬灭基团的种类为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种，荧光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一种。

本发明还提供采用多色荧光熔解曲线PCR检测方法检测待测基因的试剂盒，所述试剂盒包括：

a、条形码探针，其3’端为待测靶标基因位于两条引物之间的探针序列，5’端为标记淬灭基团的具有一定长度的条形码序列；

b、具有茎环结构的荧光检测探针，其3’端为与所述条形码序列特异性结合的条形码识别序列，5’端序列与3’端序列互补配对，中间为任意一段与待测靶标基因不相关且与条形码序列不相关的序列，3’端和5’端分别标记发光基团和淬灭基团；

c、耐热DNA聚合酶；

d、根据待测基因合成的一对引物；

e、dATP、dTTP、dCTP及dGTP；

f、PCR缓冲液。

上述技术方案中，所述耐热DNA聚合酶为具有5’-3’外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶。

上述技术方案中，所述PCR缓冲液为含镁离子、Triton X-100、硫酸铵、氯化钾、Tris-HCl的混合溶液。

本发明的有益效果：

本发明的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，采用能够与待测靶标基因特异性杂交的条形码探针和能够与条形码探针特异性结合的荧光检测探针，对待测样品中的多个靶标基因同时进行检测时，通过在DNA扩增过程中，生成与每一个待测靶标基因对应的特异条形码序列，再由条形码序列经过DNA扩增形成标记了不同荧光基团和淬灭基团的特异性的不同长度的DNA产物，利用PCR仪检测到的每一种波长的荧光都可以区分多个不同Tm值的融解曲线峰，并通过最终的多色荧光熔解曲线分析，在多个荧光通道产生不同Tm值DNA产物特异熔解曲线峰来判读是否检出目标基因，从而实现基于熔解曲线分析的PCR多重检测。与现有技术相比，本发明的检测方法的多重检测能力更强，能够同时检测出更多的目的基因，而且成本较低，该方法用于检测待测基因的试剂盒，适用于在各个医疗、科研等领域的推广应用。

附图说明

利用附图对本发明做进一步说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。

图1是本发明的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法的原理示意图。

图2是本发明的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法的实施例的FAM荧光基团的荧光熔解曲线图。

图3是本发明的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法的实施例的HEX荧光基团的荧光熔解曲线图。

附图标记：

1——条形码探针、11——探针序列、12——条形码序列；

2——荧光检测探针、21——条形码识别序列；

R——荧光基团；

Q——淬灭基团；

Pol——具有5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶。

具体实施方式

结合以下实施例及附图对本发明作进一步说明。

本实施例通过多重检测金黄色葡萄球菌FemA基因、单增李斯特氏菌Hly基因、志贺氏菌IpaH基因以及沙门氏菌InvA基因，对本发明的检测方法进行说明。

1、待测靶标基因特异性引物序列和探针序列的设计：

1）从GeneBank中调出金黄色葡萄球菌常见株的FemA基因序列十三条：DQ352463，DQ352462，DQ352461，DQ352460，DQ352459，DQ352458，DQ352457，DQ352456，DQ352467，DQ352466，DQ352465，DQ352464，DQ352455，应用ClustalW软件进行序列比对，选取高度保守的区段作为靶标进行引物设计，然后将该序列输入GeneBank，进行BLAST比对，确定该序列与除金黄色葡萄球菌外的其它物种基因同源性低，之后再应用ABI primer Express 3.0软件设计引物序列和探针序列，保证引物的Tm值为55±3℃，探针序列的Tm值为60-63℃，扩增产物长度为80-300 bp，最后对引物序列及探针序列进行BLAST比对，确保引物及探针的特异性。引物序列及探针序列如下：

上游引物序列：5’-gccatacagtcatttcacgca（SEQ ID NO: 1）；

下游引物序列：5’-acagcagtaagtaagcaagctg（SEQ ID NO: 2）；

探针序列：5’-aactgttggccactatgagttaa；

2）从GeneBank中调出单增李斯特菌常见株的Hly基因序列五条：MLU25452，JF712527，JF712528，JF712529，JQ015301，参照FemA基因引物及探针设计方法设计引物及探针。引物及探针序列如下：

上游引物序列：5’-gtgccgccaagaaaaggtta（SEQ ID NO: 3）；

下游引物序列：5’-tttcacgagagcacctggat（SEQ ID NO: 4）；

探针序列：5’-ccaagttgtgaatgcaatttcgagcc（SEQ ID NO: 5）；

3）从GeneBank中调出志贺氏菌不同株的IpaH基因序列，其中福氏志贺氏菌不同株IpaH基因序列四条：M76445，DQ448042，DQ448040，FJ227542；痢疾志贺氏菌不同株IpaH基因一条：DQ132807；鲍氏志贺氏菌不同株IpaH基因一条：AKNA01000029；宋内志贺氏菌不同株IpaH基因六条：DQ448041，DQ448039，KP116110，KP116109，KP116108，JQ638640，参照FemA基因引物及探针设计方法设计引物及探针。引物及探针序列如下：

上游引物序列：5’-aggacattgcccgggataaa（SEQ ID NO: 6）；

下游引物序列：5’-gacacgccatagaaacgcat（SEQ ID NO: 7）；

探针序列：5’-agagaaacttcagctctccactgcc（SEQ ID NO: 8）；

4）从GeneBank中调出常见沙门氏菌不同株的InvA基因序列九条：DQ644630，DQ644631，DQ644632，DQ644633，M90846，DQ644629，DQ644625，DQ644627，DQ644628，参照FemA基因引物及探针设计方法设计引物及探针。引物及探针序列如下：

上游引物序列：5’-caacgtttcctgcggtactg（SEQ ID NO: 9）；

下游引物序列：5’-taacgaattgcccgaacgtg（SEQ ID NO: 10）；

探针序列：5’-ccacgctctttcgtctggcattatc（SEQ ID NO: 11）。

2、条形码探针的设计：

设计四条长度为26 nt 的核苷酸序列，将其命名为“条形码序列”，然后分别在这四个条形码序列的3’端连接上述步骤1中设计的与待测靶标基因特异结合的探针序列，从而设计好四个条形码探针并分别编号为1、2、3、4；这四个条形码探针的3’端的探针序列分别能够识别金黄色葡萄球菌FemA基因、单增李斯特氏菌Hly基因、志贺氏菌IpaH基因和沙门氏菌InvA基因，其5’端标记淬灭基团，淬灭基团的种类为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种。

分别与待测基因金黄色葡萄球菌FemA基因对应的编号1的条形码探针序列、与单增李斯特氏菌Hly基因对应的编号2的条形码探针序列、与志贺氏菌IpaH基因对应的编号3的条形码探针序列以及与沙门氏菌InvA基因对应的编号4的条形码探针序列分别如下：

1：5’-淬灭基团-AGAGTCATGACTGTATGAGAGCACTC-aactgttggccactatgagttaa（SEQID NO: 12）；

2：5’-淬灭基团-AGAATACAGACAGACATGTCTGACAC-ccaagttgtgaatgcaatttcgagcc（SEQ ID NO: 13）；

3：5’-淬灭基团-AGTAGATCTGCATCTATAGAGTCGTC-agagaaacttcagctctccactgcc（SEQ ID NO: 14）；

4：5’-淬灭基团-AGGATTACACTCACTGACATCTCCAC-ccacgctctttcgtctggcattatc（SEQ ID NO: 15）。

、荧光检测探针的设计：

以上述步骤2中设计的条形码序列的5’端的11 nt 核苷酸序列作为对应的荧光检测探针的5’端，以条形码序列的反向重复序列作为3’端，中间为一段具有茎环结构且长度不等的核苷酸序列，使得不同的荧光检测探针具有不同的Tm值。荧光检测探针的5’端标记淬灭基团，淬灭基团的种类为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种；荧光检测探针的5’端标记荧光基团，荧光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一种。

（1）与FemA基因对应的荧光检测探针序列（SEQ ID NO: 16）：

5’-淬灭基团-AGAGTCATGAC-ctgcacgct-GAGTGCTCTCATACAGTCATGACTCT-FAM；

（2）与Hly基因对应的荧光检测探针序列（SEQ ID NO: 17）：

5’-淬灭基团-AGAATACAGAC-ctgtgcactcgcacgcggctaac-GTGTCAGACATGTCTGTCTGTATTCT-FAM；

（3）与IpaH基因对应的荧光检测探针序列（SEQ ID NO: 18）：

5’-淬灭基团-AGTAGATCTGC-ctgcacgct-GACGACTCTATAGATGCAGATCTACT-HEX；

（4）与InvA基因对应的荧光检测探针序列（SEQ ID NO: 19）：

5’-淬灭基团-AGGATTACACT-ctgtgcactcgcacgcggctaac-GTGGAGATGTCAGTGAGTGTAATCCT-HEX。

4、样品的准备及处理：

分别取过夜培养的金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌200μl至离心管中，混匀后用生理盐水10倍梯度稀释，稀释10000倍；取1 ml稀释后的菌液至1.5ml离心管中，14000g离心1分钟，弃上清，加入100μl DNA 提取液（ 10mM Tris-HCl （pH 7.5）、1% Triton X-100、2% Chelex-100、0.1mM EDTA），充分混匀后，95℃加热裂解15分钟，20000g离心2分钟，提取所得DNA溶液-20℃储存备用。

5、PCR扩增及熔解曲线分析：

PCR反应液含：1-3 mmol/l MgSO4，20~60 mmol/l (NH4)₂SO₄，5~40 mmol/l KCl，10~30 mmol/l Tris-HCl（pH8.1~8.8），0.01~0.1% Triton X-100（v/v），0.1~0.4 mmol/ldNTPs，单条引物2.5~15 μmol/l，具有5’-3’外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶0.01~0.2U/μl，UNG酶0.01~0.05U/μl，条形码探针2.5~5μmol/l，荧光检测探针2.5~5μmol/l，反应液总体积20~50 μl，每人份加入核酸模版1~10μl，或加入1~10μl无菌水作为空白对照。

本检测在Bio-Rad公司的CFX 96仪器中进行，反应程序是：

（1）50℃ 5min——95℃ 10min；

（2）95℃ 15s——54℃ 15s——72℃ 20s，50循环；

（3）95℃ 1min——35℃ 1min——60℃~95℃，其中60℃~95℃以0.4℃/5s的升温速度进行熔解曲线分析，并采集FAM及HEX荧光信号。

6、结果判读：

上述步骤“1，2，3”中，分别与金黄色葡萄球菌和单增李斯特氏菌对应的荧光检测探针标记了FAM荧光基团，分别与志贺氏菌、沙门氏菌对应的荧光检测探针标记了HEX荧光基团，熔解曲线如图2和图3所示，由于四条荧光检测探针的长度不同，对应的Tm值特征不同，空白对照无熔解曲线检测信号，根据相应的荧光通道下特异熔解曲线峰的出现情况判断是否检出四种待检微生物。四种待测微生物对应的荧光基团及Tm值关系如表1所示：

表1. 四种待测微生物对应的荧光基团及Tm值关系

如图2和图3所示，本发明的方法对待测样品中的金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、志贺氏菌、沙门氏菌的特异性基因进行了多重检测，可通过在多个荧光通道下的熔解曲线峰来判读是否检出目标基因，从而判断是否检出目标菌。本发明采用的荧光检测探针只需要标记两种荧光基团就可以同时检测四种目的基因，相比TaqMan^TM水解探针法的多重检测能力更强，而且成本较低。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110> Steve Jia Chang Yu；埃捷思生物科技有限公司；奥健生物科技（广州）有限公司

<120> 一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法

<160> 19

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 1

gccatacagt catttcacgc a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 2

acagcagtaa gtaagcaagc tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 3

gtgccgccaa gaaaaggtta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 4

tttcacgaga gcacctggat 20

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 5

ccaagttgtg aatgcaattt cgagcc 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 6

aggacattgc ccgggataaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 7

gacacgccat agaaacgcat 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 8

agagaaactt cagctctcca ctgcc 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 9

caacgtttcc tgcggtactg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 10

taacgaattg cccgaacgtg 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 11

ccacgctctt tcgtctggca ttatc 25

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 12

agagtcatga ctgtatgaga gcactcaact gttggccact atgagttaa 49

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 13

agaatacaga cagacatgtc tgacacccaa gttgtgaatg caatttcgag cc 52

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 14

agtagatctg catctataga gtcgtcagag aaacttcagc tctccactgc c 51

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 15

aggattacac tcactgacat ctccacccac gctctttcgt ctggcattat c 51

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 16

agagtcatga cctgcacgct gagtgctctc atacagtcat gactct 46

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 17

agaatacaga cctgtgcact cgcacgcggc taacgtgtca gacatgtctg tctgtattct 60

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 18

agtagatctg cctgcacgct gacgactcta tagatgcaga tctact 46

<210> 19

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO: 19

aggattacac tctgtgcact cgcacgcggc taacgtggag atgtcagtga gtgtaatcct 60

Claims

1.一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

a、根据待测靶标基因的特异性序列合成一对引物；

d、PCR扩增：

1）每一轮PCR反应中，经过变性步骤之后，在退火步骤，探针序列与待测靶标基因识别，上游引物和下游引物与待测靶标基因识别；

2）在延伸步骤中，在DNA聚合酶作用下，上游引物和下游引物开始延伸，具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解探针序列，使条形码探针的条形码序列被释放；

3）进入下一轮PCR反应中，在变性步骤中，荧光检测探针的茎环结构打开，退火步骤中，上一轮PCR循环中释放的条形码序列与荧光检测探针的条形码识别序列特异性结合；

4）进入延伸步骤，条形码序列以荧光检测探针为模板合成双链DNA产物；

e、多色荧光熔解曲线检测分析PCR产物：

在PCR反应结束之后，以荧光检测探针为模板合成的双链DNA产物，随着温度的升高开始解链，发光基团与淬灭基团与DNA链一起发生分离，发光基团发出的不同波长的荧光被荧光PCR仪检测，根据多色荧光融解曲线分析PCR产物。

2.根据权利要求1所述的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：条形码探针3’端的探针序列完全与待测靶标基因互补配对，不完全互补配对的条形码探针不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶水解释放条形码序列。

3.根据权利要求1所述的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：所述荧光探针体系包括多个条形码探针和多个荧光检测探针，每个荧光检测探针的茎环结构的序列长度不同。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种多色荧光熔解曲线PCR检测方法，其特征在于：所述淬灭基团为Dabcyl、BHQ-1、QYS-7、BHQ-2中的任意一种，所述荧光基团为Pacific Blue、Oregon Green、Bodipy FL-X、FAM、TET、Bodipy R6G-X、JOE、HEX、Cy3、Rhodamine Red-X、TAMRA、Cy3.5、Texas Red-X、ROX中的任意一种。

5.采用权利要求 1至4任意一项所述的多色荧光熔解曲线PCR检测方法检测待测基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

c、耐热DNA聚合酶；

d、根据待测基因合成的一对引物；

e、dATP、dTTP、dCTP及dGTP；

f、PCR缓冲液。

6.根据权利要求5所述的采用多色荧光熔解曲线PCR检测方法检测待测基因的试剂盒，其特征在于：所述耐热DNA聚合酶为具有5’-3’外切核酸酶活性的耐热DNA聚合酶。

7.根据权利要求5所述的采用多色荧光熔解曲线PCR检测方法的检测待测基因的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液为含镁离子、Triton X-100、硫酸铵、氯化钾、Tris-HCl的混合溶液。