CN106191045B - 用于多重核酸测序的Index和引物 - Google Patents

用于多重核酸测序的Index和引物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于多重核酸测序的Index和构建16SrRNA多重核酸测序文库的PCR引物。本发明提供的Index充分考虑到索引标签之间的序列差异程度、碱基识别率以及测序反应对不同Index序列的数据产出偏好性，将其包含于测序或建库引物后，混合测序反应得到的测序数据平衡性相对较好。本发明提供的PCR引物非常适用于土壤样品，特异性强，目的扩增条带清晰、无弥散现象，使得土壤样品中细菌多样性研究更加高效便捷准确。本发明提供的PCR引物中含有本发明提供的Index，获得的扩增产物中含有两个Index标签，将该Index用于混合样品测序，能够实现对不同测序文库的区分。

Description

用于多重核酸测序的Index和引物
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于多重核酸测序的Index和构建16SrRNA多重核酸测序文库的PCR引物。
背景技术
微生物多样性，尤其是细菌多样性微和农业、医学、食品以及工业生产等诸多领域有密切联系。随着分子生物学技术的不断发展，微生物多样性研究方法也逐渐完善和成熟。在微生物进化过程中，核糖体RNA(尤其是细菌的16SrRNA或真菌的18S rRNA)，具有一定的进化保守性，保守区序列为所有同类微生物所共有，在保守序列之间存在由于进化造成的物种之间序列差异的可变区域，因此被认为是最适合***分类的基因之一。通过对这些序列可变区域的测定和比对，能够探究并揭示土壤中微生物物种和群落结构的多样性。随着基因测序技术的发展，高通量测序技术也被引入微生物多样性的研究技术中。
在高通量测序技术中，为了节约测序成本或研究需要，通常会将不同样品混合测序，称为多重测序(Multiplexedsequencing)技术，即在构建测序文库时，借助PCR引物，用不同的索引标签(Index)标记不同样品后，将不同样品混合起来上机测序，测序结束后通过识别Index来区分同一条泳道(Lane)中的不同样品数据。多重测序技术极大程度的降低了测序成本，节约测序资源，并且给生物学研究提供的便利手段。例如，在进行细菌等微生物多样性研究时，通常需要对数百个样品的多样性进行分析，若没有多重测序技术，科研成本和时间成本将大大增加。
一方面，实际测序反应对不同的Index序列具有一定的数据产出偏好性，造成检测***片段时光强参数的波动，影响输出的数据质量和平衡性，即Index序列一定程度影响混合样品的测序数据的准确性，并非任何核苷酸序列都适合用作Index。因此，提供更多的可用Index序列对多重测序技术领域非常重要。
另一方面，发明人在进行微生物多样性研究时发现：目前常规的用于细菌样品多样性研究的16S rRNA扩增引物(如Illunima公司提供的16S rRNA扩增引物)虽然能够对肠道样品获得相对较好的扩增效果；但当用于复杂性较强、杂质较多的土壤样品时，扩增产物特异性不高，电泳显示扩增条带弥散严重，这将严重影响后续测序和分析结果的准确性。
综上所述，提供一组测序数据平衡性相对更好的Index序列以及一组适用于构建土壤样品中细菌16SrRNA多重测序文库的PCR引物，能够使得土壤细菌多样性研究工作更加高效便捷。
发明内容
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明中的术语“Index”指索引标签，具体指一段用于区分不同测序样品的核苷酸序列；术语“PCR”指聚合酶链式反应；术语“连接子”指任意一段和待测序的核苷酸序列之间不存在超过连续5个碱基以上的特异性配对的核苷酸序列。
本发明同时考虑索引标签对PCR引物的扩增效率和数据产出的偏好性的影响，提供了一组用于标记待测序核酸样品的索引标签，所述的一组索引标签包含以下34个Index中的2个或多个；所述的34个Index的核苷酸序列如下表所示：
本发明还提供了上述Index用于测序文库的构建和/或用于测序的用途：将所述的Index包含在用于扩增待测序序列的PCR引物中，从而构成相对应的Index-PCR引物，通过PCR方法将上述Index引入待测序序列中；所述的Index-PCR引物用可以用作PCR的3’端引物或5’端引物，或同时用作3’端引物和5’端引物。
其中，在所述的Index-PCR引物中，所述的Index通过或者不通过连接子与用于扩增待测序序列的PCR引物的5’端或3’端相连。
其中，所述的待测序序列优选为细菌16SrRNA序列。
由于土壤中除了细菌之外，还含有大量真菌、动物、植物等的遗传物质，在利用16SrRNA测序进行细菌多样性研究时，土壤样品相较于肠道等其他类型的样品往往具有更高的复杂性。现有的构建测序文库的16SrRNA扩增引物用于肠道样品时，能够保证一定的特异性；然而用于土壤样品时，由于其复杂性，往往无法获得理想的扩增产物，获得的扩增产物特异性差，电泳条带弥散严重。
本发明的另一个目的是提供了一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物。所述的一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物包括正向引物组和反向引物组；所述的正向引物组中的任意一条引物和反向引物组中的任意一条引物两两配对组成引物对，通过PCR反应用于扩增样品中的16S rRNA；获得的扩增产物的上游和下游各含有一个Index，这两个Index作为该样品的特异性标记，用于和其他待测序样品进行区分。获得的扩增产物连接测序接头后，可混合上机测序；所述的正向引物组和反向引物组中不能含有包含相同Index的引物。
所述的正向引物组由以下引物中的一条或多条组成：
引物F1：包含本发明所述的Index1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
引物F2：包含本发明所述的Index2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
引物F3：包含本发明所述的Index3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
引物F4：包含本发明所述的Index4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
引物F5：包含本发明所述的Index5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
引物F6：包含本发明所述的Index6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；
引物F7：包含本发明所述的Index7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
引物F8：包含本发明所述的Index8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
引物F9：包含本发明所述的Index9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
引物F10：包含本发明所述的Index10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
引物F11：包含本发明所述的Index11，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
引物F12：包含本发明所述的Index12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
引物F13：包含本发明所述的Index13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
引物F14：包含本发明所述的Index14，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
引物F15：包含本发明所述的Index15，其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示；
引物F16：包含本发明所述的Index16，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；
引物F17：包含本发明所述的Index17，其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示；
引物F18：包含本发明所述的Index18，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；
引物F19：包含本发明所述的Index19，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；
引物F20：包含本发明所述的Index20，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示；
引物F21：包含本发明所述的Index21，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
引物F22：包含本发明所述的Index22，其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；
引物F23：包含本发明所述的Index23，其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；
引物F24：包含本发明所述的Index24，其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；
引物F25：包含本发明所述的Index25，其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；
引物F26：包含本发明所述的Index26，其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；
引物F27：包含本发明所述的Index27，其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
引物F28：包含本发明所述的Index28，其核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示；
引物F29：包含本发明所述的Index29，其核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示；
引物F30：包含本发明所述的Index30，其核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示；
引物F31：包含本发明所述的Index31，其核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示；
引物F32：包含本发明所述的Index32，其核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示；
引物F33：包含本发明所述的Index33，其核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示；
引物F34：包含本发明所述的Index34，其核苷酸序列如SEQ ID NO：34所示。
所述的反向引物组由以下引物中的一条或多条组成：
引物R1：包含本发明所述的Index1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示；
引物R2：包含本发明所述的Index2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：36所示；
引物R3：包含本发明所述的Index3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：37所示；
引物R4：包含本发明所述的Index4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：38所示；
引物R5：包含本发明所述的Index5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：39所示；
引物R6：包含本发明所述的Index6，其核苷酸序列如SEQ ID NO：40所示；
引物R7：包含本发明所述的Index7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示；
引物R8：包含本发明所述的Index8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：42所示；
引物R9：包含本发明所述的Index9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：43所示；
引物R10：包含本发明所述的Index10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：44所示；
引物R11：包含本发明所述的Index11，其核苷酸序列如SEQ ID NO：45所示；
引物R12：包含本发明所述的Index12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：46所示；
引物R13：包含本发明所述的Index13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：47所示；
引物R14：包含本发明所述的Index14，其核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示；
引物R15：包含本发明所述的Index15，其核苷酸序列如SEQ ID NO：49所示；
引物R16：包含本发明所述的Index16，其核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示；
引物R17：包含本发明所述的Index17，其核苷酸序列如SEQ ID NO：51所示；
引物R18：包含本发明所述的Index18，其核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示；
引物R19：包含本发明所述的Index19，其核苷酸序列如SEQ ID NO：53所示；
引物R20：包含本发明所述的Index20，其核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示；
引物R21：包含本发明所述的Index21，其核苷酸序列如SEQ ID NO：55所示；
引物R22：包含本发明所述的Index22，其核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示；
引物R23：包含本发明所述的Index23，其核苷酸序列如SEQ ID NO：57所示；
引物R24：包含本发明所述的Index24，其核苷酸序列如SEQ ID NO：58所示；
引物R25：包含本发明所述的Index25，其核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示；
引物R26：包含本发明所述的Index26，其核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示；
引物R27：包含本发明所述的Index27，其核苷酸序列如SEQ ID NO：61所示；
引物R28：包含本发明所述的Index28，其核苷酸序列如SEQ ID NO：62所示；
引物R29：包含本发明所述的Index29，其核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示；
引物R30：包含本发明所述的Index30，其核苷酸序列如SEQ ID NO：64所示；
引物R31：包含本发明所述的Index31，其核苷酸序列如SEQ ID NO：65所示；
引物R32：包含本发明所述的Index32，其核苷酸序列如SEQ ID NO：66所示；
引物R33：包含本发明所述的Index33，其核苷酸序列如SEQ ID NO：67所示；
引物R34：包含本发明所述的Index34，其核苷酸序列如SEQ ID NO：68所示。
本发明还提供的了一种细菌16SrRNA多重测序文库构建试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含本发明所述的一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物。
上述一种细菌16SrRNA多重测序文库构建试剂盒还可以包含基因组DNA提取试剂、DNA聚合酶、16SrRNA测序接头添加试剂。
本发明还提供了上述一种细菌16SrRNA多重测序文库构建试剂盒在细菌多样性检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)、本发明提供的Index充分考虑到索引标签之间的序列差异程度、碱基识别率以及测序反应对不同Index序列的数据产出偏好性。本发明提供的Index的序列避免了序列之间出现3或3个以上连续的相同碱基的出现，极大程度的降低了其序列合成或测序过程中可能出现的错误率；标签包含入建库或测序引物中后，尽可能地避免了出现发夹结构或与测序引物及其反向互补序列相同的现象；将其包含于测序或建库引物后，混合测序反应得到的测序数据平衡性相对较好。
(2)、本发明提供的用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物在常规16SrRNA扩增引物的基础上添加了本发明提供的Index，以及长度为28-36个碱基的接头序列，并意外发现由此构成的PCR引物除了能够对肠道等样品获得特异性较高的16SrRNA扩增产物之外，还非常适用于土壤样品，在扩增土壤样品中的16SrRNA时，特异性强，目的扩增条带清晰、无弥散现象，极大程度地保证了后续测序反应和研究结果的准确性，使得土壤样品中细菌多样性研究更加高效便捷准确。
(3)、本发明提供的用于构建16S rRNA测序文库的PCR引物，通过正向引物组合反向引物组中的引物引入本发明提供的Index，获得的扩增产物中含有两个Index标签，将该Index用于混合样品测序，实现对不同测序文库的区分。
附图说明
图1为实验例1步骤(2)中的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为对比例1中的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
本发明中的术语“ddH2O”指双蒸水。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
DNA Kit购自Omega公司；KOD-Plus-Neo购自TOYOBO公司；引物合成委托生工生物工程股份有限公司进行；100个不同来源的土壤样品由中科院北京基因组研究所提供。
实施例1一组用于构建16SrRNA多重测序文库的PCR引物
由20条引物组成，
其中正向引物组由以下10条引物组成：
本发明所述的引物F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
本发明所述的引物F2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
本发明所述的引物F4，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
本发明所述的引物F5，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
本发明所述的引物F7，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
本发明所述的引物F8，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
本发明所述的引物F9，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
本发明所述的引物F10，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
本发明所述的引物F12，其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
本发明所述的引物F13，其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示；
其中反向引物组由以下10条引物组成：
本发明所述的引物R14，其核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示；
本发明所述的引物R15，其核苷酸序列如SEQ ID NO：49所示；
本发明所述的引物R16，其核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示；
本发明所述的引物R18，其核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示；
本发明所述的引物R19，其核苷酸序列如SEQ ID NO：53所示；
本发明所述的引物R20，其核苷酸序列如SEQ ID NO：54所示；
本发明所述的引物R22，其核苷酸序列如SEQ ID NO：56所示；
本发明所述的引物R23，其核苷酸序列如SEQ ID NO：57所示；
本发明所述的引物R25，其核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示；
本发明所述的引物R26，其核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示。
实验例1细菌多样性检测应用
构建100个不同来源的土壤样品的细菌16SrRNA多重测序文库
(1)、样品基因组DNA的提取：
用Soil DNA Kit提取土壤样品中的基因组DNA，提取步骤参见产品说明书。
(2)、PCR扩增16S rRNA：
以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用本发明实施例1中提供的PCR引物扩增样品中的16S rRNA，其中正向引物组和反向引物组中的引物两两配对，获得100个不同引物对，用于100个不同样品的PCR扩增。
PCR反应体系如下表所示：
成分 含量
基因组DNA(10ng/μL) 2μL
引物(10μM) 各0.75μL
MgSO<sub>4</sub>(25mM) 3μL
dNTPs(2mM) 5μL
10×KOD-Plus-Neo Buffer 5μL
KOD-Plus-Neo 1μL
ddH<sub>2</sub>O 32.5μL
共计 50μL
PCR程序如下表所示：
对获得的100个扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度0.8％，电泳结果显示采用本发明提供的引物获得的16SrRNA扩增产物条带清晰，无弥散现象。由于样品数量较多，在此展示1-24号样品的电泳结果，如图1所示，目的条带清晰，无弥散现象；第25-100号样品的电泳结果和1-24号相同或相似。
(3)、添加测序接头：
分别以步骤(2)获得的100个扩增产物作为模板，利用以下引物对进行PCR扩增，以下引物中含有Illumina MiSeq测序平台的测序接头。
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTG-3’：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC-3’。
PCR反应体系如下表所示：
成分 含量
步骤(2)的扩增产物(1ng/μL) 2μL
引物(10μM) 各0.75μL
MgSO<sub>4</sub>(25mM) 3μL
dNTPs(2mM) 5μL
10×KOD-Plus-Neo Buffer 5μL
KOD-Plus-Neo 1μL
ddH<sub>2</sub>O 32.5μL
共计 50μL
PCR程序如下表所示：
使用Agencourt AMPure XP磁珠纯化步骤(3)获得的100个扩增产物，纯化后的100个扩增产物混合后即为100个不同来源的土壤样品的细菌16SrRNA多重测序文库。
对比例1
以下引物对1和引物对2分别为常规16SrRNA扩增引物和Illunima公司提供的16SrRNA测序文库构建引物。
引物对1：
5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’
5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’
引物对2：
5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’；
5’-GTCTCGTGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’。
利用上述两个引物对本发明实验例1中使用的100个不同来源的土壤样品中的随机50个土壤样品中的16SrRNA进行扩增。
样品基因组DNA的提取方法同本发明实验例1步骤(1)，PCR体系和PCR程序同本发明实验例1步骤(2)。
将获得的2份50个不同扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度和电泳条件同实验例1步骤(2)。电泳结果显示：采用引物对1和引物对2获得的16SrRNA扩增产物目的条带不清晰，弥散严重。由于样品数量较多，在此展示对比例1中引物对1对1-24号样品的扩增产物电泳结果，如图2所示，扩增产物目的条带不清晰，弥散严重；本对比例中其余样品的电泳结果与图2相同或相似。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一组用于构建土壤样品中细菌16SrRNA多重测序文库的PCR引物，其特征在于：所述的一组PCR引物包括正向引物组和反向引物组；
所述的正向引物组由以下引物中的一条或多条组成：
引物Fl：其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列，其中含有Index1：TGTACGCT；
引物F2：其核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的序列，其中含有Index2：GACTAGTC；
引物F4：其核苷酸序列为SEQ ID NO:4所示的序列，其中含有Index4：ACTAGATG；
引物F5：其核苷酸序列为SEQ ID NO:5所示的序列，其中含有Index5：GATGTACA；
引物F6：其核苷酸序列为SEQ ID NO:6所示的序列，其中含有Index6：GATCATGC；
引物F7：其核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列，其中含有Index7：CATGTCTA；
引物F8：其核苷酸序列为SEQ ID NO:8所示的序列，其中含有Index8：TATGTCAC；
引物F9：其核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示的序列，其中含有Index9：TCTAGCAT；
引物F10：其核苷酸序列为SEQ ID NO:10所示的序列，其中含有Index10：GATCACTA；
引物F12：其核苷酸序列为SEQ ID NO:12所示的序列，其中含有Index12：TCTACAGA；
引物F13：其核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示的序列，其中含有Index13：TACAGCGT；
所述的反向引物组由以下引物中的一条或多条组成：
引物R14：其核苷酸序列为SEQ ID NO:48所示的序列，其中含有Index14：GTGACTAT；
引物R15：其核苷酸序列为SEQ ID NO:49所示的序列，其中含有Index15：TGCTACAT；
引物R16：其核苷酸序列为SEQ ID NO:50所示的序列，其中含有Index16：TGATCTAC；
引物R18：其核苷酸序列为SEQ ID NO:52所示的序列，其中含有Index18：TCGTGATA；
引物R19：其核苷酸序列为SEQ ID NO:53所示的序列，其中含有Index19：ACTGCATA；
引物R20：其核苷酸序列为SEQ ID NO:54所示的序列，其中含有Index20：ATAGTGCT；
引物R22：其核苷酸序列为SEQ ID NO:56所示的序列，其中含有Index22：ACTCATGA；
引物R23：其核苷酸序列为SEQ ID NO:57所示的序列，其中含有Index23：GTACATGA；
引物R25：其核苷酸序列为SEQ ID NO:59所示的序列，其中含有Index25：CACGTGAT；
引物R26：其核苷酸序列为SEQ ID NO:60所示的序列，其中含有Index26：CATCGAGT。
2.如权利要求1所述的一组PCR引物，其特征在于：所述的PCR引物在使用时：所述的正向引物组中的任意一条引物和反向引物组中的任意一条引物两两配对组成引物对，通过PCR反应用于扩增样品中的16S rRNA；获得的扩增产物的上游和下游各含有一个Index，这两个Index作为该样品的特异性标记，用于和其他待测序样品进行区分。
3.权利要求1和2任意一项所述的一组用于构建土壤样品中细菌16SrRNA多重测序文库的PCR引物在细菌多样性检测中的应用。
4.权利要求1和2任意一项所述的一组用于构建土壤样品中细菌16SrRNA多重测序文库的PCR引物在制备细菌多样性检测试剂盒中的应用。
5.一种细菌16SrRNA多重测序文库构建试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1和2任意一项所述的一组用于构建土壤样品中细菌16SrRNA多重测序文库的PCR引物。
6.权利要求5所述的一种细菌16SrRNA多重测序文库构建试剂盒在土壤样品细菌多样性检测中的应用。
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