CN106190993A - 禽流感疫苗和诊断抗原所用种毒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽医生物制品领域，用于制备禽流感疫苗和诊断抗原所需种毒。本发明应用反向遗传技术，以流感病毒冷适应株的内部六个基因(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)为基因组骨架，与禽流感病毒HA和NA基因一起，人工构建流感病毒，该病毒作为制备禽流感疫苗和诊断抗原所需种毒，具有更高的安全性，并保持效价高、匹配性强等优点，制备的弱毒疫苗或灭活疫苗安全可靠，免疫后能够产生较强免疫力，能够有效预防禽流感的流行和传播，降低本病造成的经济损失，降低对人类健康的威胁，具有重要的公共卫生意义，有着广阔的应用前景。

Description

禽流感疫苗和诊断抗原所用种毒的制备方法

技术领域

本发明涉及禽流感疫苗和诊断抗原所用种毒的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

禽流感(Avian influenza,AI)是由禽流感病毒引起的一种家禽和野禽的传染病。禽流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，可分为16个HA亚型和9个NA亚型。高致病性禽流感是由某些H5或H7亚型禽流感病毒引起的严重威胁禽类的烈性传染病。有些高致病性禽流感病毒还能引起人的感染、发病，甚至死亡。

2003年以来，H5N1亚型高致病性禽流感一直在包括中国在内的多个国家和地区流行，不但给养禽业造成了严重的经济损失，还严重威胁着人类的健康。除了不断加强和完善流感监测以外，疫苗仍然是防控AI的重要手段。2005年，我国开始实施针对禽流感的大规模强制性免疫政策，并取得了显著成效。随着病毒的不断变异，疫苗也从Re-1更新到Re-4和Re-5，到目前的Re-6和Re-7。所有这些疫苗都是通过PR8(A/PR/8/34)的六个内部基因和流行毒株的HA和NA两个外部基因重组而成。由于PR8病毒对哺乳动物的高亲和力，出于安全性考虑，所有PR8重组而来的这些疫苗只能制成灭活疫苗使用。灭活疫苗主要通过诱导抗体产生来保护机体免受病毒攻击，病毒在抗体免疫压力下变异速度会加快，使得病毒更难以预防和控制。本专利提供了一种新的禽流感疫苗和诊断抗原所用种毒的制备方法。种毒，作为疫苗生产的“种子”，是疫苗生产的关键所在。配套的诊断抗原是疫苗质量控制和疫苗使用效果评价的必要材料，而种毒是配套的血凝试验或血凝抑制试验诊断抗原生产的必要材料。

发明内容

本专利首次确定利用冷适应株流感病毒A/Ann Arbor/6/60(AAca)的六个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)和流行毒株的外部基因(HA和NA)，通过反向遗传操作技术，禽流感疫苗和诊断抗原所需种毒。反向遗传操作技术是指通过某个或某些人工构建的质粒，转染特定的细胞，产生所希望获得的病毒的一种技术。利用冷适应株流感病毒A/AnnArbor/6/60(AAca)和反向遗传技术制备禽流感疫苗和诊断抗原所需种毒具有更高的安全性，并保持效价高、匹配性强等优点，制备的弱毒疫苗或灭活疫苗安全可靠，免疫后能够产生较强免疫力，能够有效预防禽流感的流行和传播，降低本病造成的经济损失，降低对人类健康的威胁，具有重要的公共卫生意义，有着广阔的应用前景。

本专利首次确定用反向遗传技术制备禽流感疫苗过程中所需病毒骨架的六个内部基因序列。

具体实施方式

下面通过实施例，进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此。

实施例中所述的表达A/Ann Arbor/6/60(AAca)病毒六个内部基因的重组质粒由中国动物卫生与流行病学中心构建保存，293T细胞购自QbioGene公司；脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。

实施例1

重组H5亚型禽流感病毒(rH5/AAca)的构建方法，包括如下步骤：

1、人工合成与克隆A/Ann Arbor/6/60(AAca)六个内部基因

按照本发明指定的PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因序列(SEQ ID NO.1～NO.6)，采用人工合成的方法，将其***到双向表达载体(能同时转录产生病毒RNA和mRNA)中，制得pH-PB2、pH-PB1、pH-PA、pH-NP、pH-M、pH-NS质粒。

2、H5亚型禽流感病毒表面基因的克隆

扩增H5亚型禽流感病毒HA和NA表面基因，并对HA基因进行分子修饰，去除与H5亚型禽流感病毒致病力有关的HA蛋白裂解位点处的多个碱性氨基酸，使其获得低致病性禽流感病毒的分子特征(即将-PLRERRRKR-突变为-PQRETR-)，将其***到双向表达载体中，制得pH-mHA和质粒pH-NA。

3、重组H5亚型禽流感病毒的包装与鉴定

表达A/Ann Arbor/6/60(AAca)病毒的6个内部基因重组表达质粒，与表达H5亚型禽流感病毒HA和NA基因重组质粒，经脂质体Lipofectamine 2000共转染293T细胞。将转染细胞经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，每胚0.1mL，每个样品接种两个胚，置35℃培养至72h，收集尿囊液，用国际兽疫局(OIE)推荐的标准进行血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验鉴定病毒。HI阳性尿囊液，用鸡胚传代的第2代尿囊液提取RNA、RT-PCR扩增HA和NS基因片段进行测序。未经反转录的RNA用PCR扩增。RT-PCR扩增及测序结果表明，拯救的病毒为重组H5亚型禽流感病毒，未经反转录的RNA用PCR无扩增条带。获得重组病毒命名为rH5/AAca。

4、疫苗生产所需病毒的增殖方法

以无菌生理盐水1∶10000倍稀释rH5/AAca病毒，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.1mL/胚，收获培养72h后的存活鸡胚尿囊液，测定HA效价，病毒尿囊液HA效价为2⁹，且无菌检验合格。

5、疫苗生产所需的病毒灭活方法

将收获的尿囊液中加入***至终浓度0.2％，2-8℃灭活48h，每隔2h摇匀一次。灭活48h后，每个病毒样品接种10枚鸡胚，每胚0.1mL，孵化72h后测定HA效价，无血凝性的尿囊液再盲传一代。第二代仍无血凝性判为病毒完全灭活。结果病毒尿囊液鸡胚传代2次均无产生血凝性，灭活完全。

6、灭活疫苗的质量检测

按《兽医生物制品规程》的方法制备rH5/AAca株油乳剂灭活疫苗并进行疫苗的无菌试验、物理性状、安全性检测。各项指标符合《兽医生物制品规程》的规定。

7、疫苗的免疫效力试验

将50只21日龄SPF鸡随机分为5组，每组10只。第1-4组肌肉接种质量检测合格的rH5/AAca禽流感疫苗，免疫剂量分别为0.05、0.1、0.3、0.5mL/只，第5组为空白对照组，隔离饲养。免疫后2周和3周，采血测定H5亚型禽流感病毒抗体水平。免疫后3周用同源H5亚型高致病性禽流感病毒攻毒，判定疫苗的免疫保护效果(表1)。

H5亚型禽流感病毒灭活疫苗的不同免疫剂量对免疫效力的影响试验结果表明，所研制的疫苗免疫剂量为0.1mL/只就可使免疫鸡群在免疫后3周就可以获得对H5病毒的保护。从抗体产生水平来看，0.3mL/只免疫剂量组鸡的抗体水平明显高于0.1mL组，且0.3mL组抗体水平保持稳定上升。多重比较表明，0.3与0.5mL组抗体效价变化差异不显著(P>0.05)，说明同样条件下选用0.3mL/只剂量接种能达到理想的防疫效果。

表1重组H5亚型禽流感病毒油乳剂灭活疫苗的免疫效力试验

注：*分母表示试验鸡数，分子表示死亡的鸡只数。

8、H5亚型禽流感病毒作为诊断抗原的方法

H5亚型禽流感病毒的增殖方法同步骤4。H5亚型禽流感病毒的增殖方法同步骤4、灭活方法同步骤5。用此灭活病毒进行血凝抑制试验检测相匹配的疫苗免疫效果(HI抗体滴度)，如步骤7所示。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国动物卫生与流行病学中心

<120> 禽流感疫苗和诊断抗原所用种毒的制备方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2341

<212> DNA

<213> Influenza virus

<400> 1

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t 2341

<210> 2

<211> 2341

<212> DNA

<213> Influenza virus

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tgaacatcga aacagccacc cgtgttggaa agcagatagt ggagaggatt ctgaaggaag 240

aatccgatga ggcacttaaa atgaccatgg cctccgcacc tgcttcgcga tacctaactg 300

acatgactat tgaggaaatg tcaagggact ggttcatgct aatgcccaag cagaaagtgg 360

caggccctct ttgtatcaga atggaccagg caatcatgga taagaacatc atattgaaag 420

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gaaataagat ggctgattga agaagtgaga cacaaattga agataacaga gaatagtttt 780

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actttctcgt ttcagcttat ttaatgataa aaaacaccct tgtttctact 890

Claims (5)

1.用反向遗传技术和冷适应株流感病毒骨架，人工构建流感病毒，用作禽流感疫苗生产的种毒。

2.如权利要求1所述的种毒，其特征在于，所述的禽流感病毒PB2、PB1、PA、NP、M、NS基因序列与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6相似性（similarity）高于95%。

3.权利要求2所述的种毒，用于禽流感疫苗或配套的诊断抗原的生产。

4.权利要求2所述的种毒，用于H5亚型禽流感疫苗或配套的诊断试剂的生产。

5.权利要求2所述的种毒，用于H7亚型禽流感疫苗或配套的诊断试剂的生产。