CN106188307B - 一种融合蛋白、其制备方法及一种猪用口服疫苗或药物 - Google Patents

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Abstract

本发明首先提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为由布鲁氏菌外膜蛋白(OMP16)和猪流行性腹泻病毒S蛋白(PEDV‑S)中的全部或部分片段融合而得。本发明还提供一种猪用口服疫苗或药物，包括所述融合蛋白装入乳酸菌表达载体后，将乳酸菌表达载体转化到干酪乳杆菌标准菌株中并培养所述菌株而得。本发明提供的猪用口服疫苗能有效刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这适用于肠道中细菌，病毒、寄生虫等黏膜病原的清除，避免了常规注射疫苗引起的应激以及抗体无法到达病原所在部位的缺陷。且该疫苗采取活的乳酸菌载体***，避免了灭活苗在到达小肠黏膜之前被降解和失去作用的可能性。本发明提供的疫苗和药物能最有效的预防和治疗猪流行性腹泻病毒感染。

Description

一种融合蛋白、其制备方法及一种猪用口服疫苗或药物
技术领域
本发明涉及病毒防控领域，具体涉及一种融合蛋白、其制备方法及一种猪用口服疫苗。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的各年龄段猪腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高度致死为特征的一种高度接触性肠道传染病。本病在亚洲地区特别是我国养猪场的感染非常严重，其感染率明显高于另外的两个猪病毒性腹泻病原---猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PRV)。由于PED对仔猪的严重危害，国内、外学者相继研制了PEDV的疫苗，并应用于现在猪场PED的免疫预防。然而，在PEDV疫苗广泛应用的同时，PED仍然存在并经常发生，其免疫失败的原因，目前仍不明确。
抗原表位能够刺激机体产生抗体进而保护机体免受病原的侵害，抗原分子的抗原表位分类方法有多种，例如B细胞表位和T细胞表位，线性表位和构象表位，中和表位和非中和表位等。抗原表位基因和中和表位基因均为病毒基因工程疫苗的候选靶基因。PEDVS蛋白在介导感染宿主产生中和抗体的过程中发挥重要作用，近年来，国内外研究人员先后对PEDVS基因进行了的研究。2002年Chang等据PEDV S基因的中和表位序列，推测出了PEDVS基因的一个抗原表位区(499－638aa)，并命名为COE，随后也被用于基因工程疫苗的制备。但这样的疫苗的效果仍然有限。
因此，本领域技术人员需要在猪流行性腹泻领域做出更多努力，开发出免疫效果明显且稳定的PEDV疫苗。
发明内容
本发明首先提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为由布鲁氏菌外膜蛋白(OMP16)和猪流行性腹泻病毒S蛋白(PEDV-S)中的全部或部分片段融合而得。
本发明融合蛋白中的Omp16蛋白起到免疫增强剂的作用，特别是增强细胞免疫应答；PEDVS蛋白起到保护性免疫原的作用，以获取更好的免疫作用。
在一种具体的实施方式中，布鲁氏菌外膜蛋白片段和猪流行性腹泻病毒S蛋白片段间用接头连接起来；优选所述接头由甘氨酸和丝氨酸组成，且所述接头的序列为GGGGSGGGGSGGGGS，其中甘氨酸端与布鲁氏菌外膜蛋白片段连接，丝氨酸端与猪流行性腹泻病毒S蛋白片段连接。
在一种具体的实施方式中，所述融合蛋白是在包含猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸序列的片段前用接头连接了包含布鲁氏菌外膜蛋白Omp16蛋白26-168位氨基酸的片段。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.2所示序列，或所述融合蛋白基因的核苷酸序列包含如SEQ ID No.1所示序列。
在一种具体的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列包括不间断地截取Omp16蛋白26-168位氨基酸链中60％以上氨基酸数形成的肽段一，且所述融合蛋白的氨基酸序列包括不间断地截取猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸链中60％以上氨基酸数形成的肽段二，肽段一和肽段二间以接头连接形成所述融合蛋白的氨基酸序列；所述融合蛋白基因的核苷酸序列为前述融合蛋白的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
在一种具体的实施方式中，所述融合蛋白中包括由肽段A产生一处或多处突变而形成的肽段B，所述肽段A为不间断地截取猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸链中60％～100％氨基酸数形成的肽段，且所述多处突变所涉及的总突变氨基酸数目为肽段A总氨基酸数的10％以内；而融合蛋白基因的核苷酸序列中包括与肽段B相应的核苷酸序列。
本发明还提供一种上述融合蛋白的制备方法，包括将所述融合蛋白的基因克隆至原核表达载体并转化到原核表达宿主菌上，再经纯化得到融合蛋白。
在一种具体的实施方式中，所述原核表达载体为pET28a，所述原核表达宿主菌为BL21(DE3)。
本发明的另一目的是克服现有PEDV疫苗免疫效果不稳定的缺陷，提供一种新的猪用口服疫苗。因此，本发明还提供一种猪用口服疫苗或药物，包括如上任意一项所述融合蛋白装入乳酸菌表达载体后，将乳酸菌表达载体转化到干酪乳杆菌标准菌株中并培养所述菌株而得到所述猪用口服疫苗或药物；优选所述乳酸菌表达载体为pVE5523，所述干酪乳杆菌标准菌株为ATCC393。本发明提供的上述猪用口服疫苗为一种重组干酪乳杆菌基因工程亚单位口服乳酸菌疫苗，特别是一种安全有效、能在肠道黏膜定居的猪流行性腹泻基因工程亚单位口服疫苗。
在一种具体的实施方式中，本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种OMP16-PEDVS融合蛋白，是在布鲁氏菌Omp16蛋白26-168位氨基酸序列后用Linker蛋白(GGGGSGGGGSGGGGS)连接了猪流行性腹泻病毒S蛋白的493-708位氨基酸，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
二、编码上述的OMP16-PEDVS融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
三、上述的OMP16-PEDVS融合蛋白基因5’端添加Sal I限制性内切酶位点，3’端添加Eco RV限制性内切酶位点，将上述的基因亚克隆至pVE5523乳酸菌分泌表达载体中，同时转化ATCC393干酪乳杆菌，获得重组OMP16-PEDVS干酪乳杆菌。
四、上述的OMP16-PEDVS融合蛋白基因5’端添加Nco I限制性内切酶位点，3’端添加Xho I限制性内切酶位点，将上述的基因亚克隆至pET28a(+)原核表达载体中，同时转化BL21(DE3)大肠杆菌，进行IPTG诱导蛋白的表达和纯化。另外，设计引物扩增PEDVS493-708基因，5’端添加Nco I限制性内切酶位点，3’端添加Xho I限制性内切酶位点，将上述的基因亚克隆至pET28a(+)原核表达载体中，同时转化BL21(DE3)大肠杆菌，进行IPTG诱导蛋白的表达和纯化。
五、上述三中的重组OMP16-PEDVS干酪乳杆菌进行培养，制备猪流行性腹泻口服疫苗。
在一种具体的实施方式中，本发明涉及制备一种布鲁氏菌外膜蛋白(outermembrane protein 16，OMP16)和猪流行性腹泻病毒S蛋白(spike glycoprotein，棘突糖蛋白)的融合蛋白的乳酸菌基因工程疫苗。本发明中，将布鲁氏菌外膜蛋白(OMP1626-168)和猪流行性腹泻病毒S蛋白肽段(S493-708)用Linker(GGGGSGGGGSGGGGS)接头连接起来，即ATG-Omp1626-168-Linker-PEDVS493-708-HHHHHH-TGA基因(命名为Omp16-PEDV)，其中ATG和TGA是核苷酸，H是组氨酸。之后将融合蛋白Omp16-PEDV装到pVE5523乳酸菌表达载体的Sal I和EcoRV酶切位点(命名为pVE5523-Omp16-PEDVS)，并将该乳酸菌表达载体电转化到干酪乳杆菌标准菌株ATCC393中即得到本发明所述的猪用口服疫苗。将携带pVE5523-Omp16-PEDVS质粒的干酪乳杆菌标准菌株ATCC393(命名为Omp16-PEDVS/ATCC393)对小鼠进行口服免疫，检测发现细胞免疫应答和体液免疫表达水平都很高。说明本发明提供了一种很好的预防猪流行性腹泻用口服疫苗，为下一步乳酸菌口服疫苗的临床使用和治疗猪流行性腹泻性疾病奠定了坚实地基础。
本发明的具体技术方案如下：
合成Omp1626-168-PEDVS493-708(Omp16-PEDV)基因，将基因克隆到pVE5523的Sal I和Eco RV多克隆位点，并将其转化到乳酸菌ATCC393中。
本发明提供的猪用口服疫苗的有益效果：可以口服，能有效刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这适用于肠道中细菌，病毒、寄生虫等黏膜病原的清除，避免了常规注射疫苗引起的应激以及抗体无法到达病原所在部位的缺陷。该疫苗采取活的乳酸菌载体***，避免了灭活苗在到达小肠黏膜之前被降解和失去作用的可能性。本发明中Omp16蛋白起到免疫佐剂的作用，PEDVS起到抗原的作用，ATCC393乳酸菌作为载体，能最有效的保护猪流行性腹泻病毒的感染导致的疾病。
附图说明
图1为OMP16-PEDVS融合蛋白结构图；
图2为合成的pUC57-OMP16-PEDVS质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1为pUC57-OMP16-PEDVS双酶切结果，1134bp对应的片段为OMP16-PEDVS，上面的片段为pUC57载体片段；M为DNA Marker DL8000；
图3为重组质粒pVE5523-OMP16-PEDVS质粒双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1为pVE5523-OMP16-PEDVS双酶切结果，1134bp对应的片段为OMP16-PEDVS，上面的片段为pVE5523载体片段；M为DNA Marker DL8000；
图4为重组质粒pET28a-OMP16-PEDVS质粒双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。其中，1为pET28a-OMP16-PEDVS双酶切结果，1134bp对应的片段为OMP16-PEDVS，上面的片段为pET28a载体片段；2为pET28a-PEDVS双酶切结果，660bp对应的片段为PEDVS，上面的片段为pET28a载体片段；M为DNA Marker DL8000；
图5为重组OMP16-PEDVS以及PEDVS蛋白表达及纯化结果。图A为OMP16-PEDVS，1为IPTG诱导的pET-28a-OMP16-PEDVS沉淀；2为IPTG诱导后的pET-28a-OMP16-PEDVS上清；3为蛋白质Marker，4和5为蛋白纯化结果。图B为PEDVS，M为蛋白质Marker；1为未诱导的BL21(DE3)菌；2为诱导的带pET-28a的BL21(DE3)菌；3为未诱导的pET-28a-PEDVS重组菌；4为IPTG诱导后的pET-28a-PEDVS重组菌；5为蛋白纯化结果。
图6为免疫后小鼠血清中IgG亚类(IgG1、IgG2a和IgG2b)的分析结果，图中F’代表弗氏完全佐剂。
图7为免疫后小鼠脾脏细胞中IFN-γ(γ干扰素，纵坐标单位为pg/106个细胞)、IL-10(白细胞介素10，纵坐标单位为pg/ml)和IL-4(白细胞介素4，纵坐标单位为pg/ml)的分泌水平。
具体实施实例
本发明通过以下具体实施例并结合附图说明，但本发明的保护范围不仅限于下述实施例和附图。
本发明首先提供一种融合蛋白，所述融合蛋白为由布鲁氏菌外膜蛋白(OMP16)和猪流行性腹泻病毒S蛋白(PEDV-S)中的全部或部分片段融合而得。
在一种具体的实施方式中，布鲁氏菌外膜蛋白片段和猪流行性腹泻病毒S蛋白片段间用接头连接起来；优选所述接头由甘氨酸和丝氨酸组成，且所述接头的序列为GGGGSGGGGSGGGGS，其中甘氨酸端与布鲁氏菌外膜蛋白片段连接，丝氨酸端与猪流行性腹泻病毒S蛋白片段连接。
在一种具体的实施方式中，所述融合蛋白是在包含猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸序列的片段前用接头连接了包含布鲁氏菌外膜蛋白Omp16蛋白26-168位氨基酸的片段。优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列包含如SEQ ID No.2所示序列，或所述融合蛋白基因的核苷酸序列包含如SEQ ID No.1所示序列。
在一种具体的实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列包括不间断地截取Omp16蛋白26-168位氨基酸链中60％以上氨基酸数形成的肽段一，且所述融合蛋白的氨基酸序列包括不间断地截取猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸链中60％以上氨基酸数形成的肽段二，肽段一和肽段二间以接头连接形成所述融合蛋白的氨基酸序列；所述融合蛋白基因的核苷酸序列为前述融合蛋白的氨基酸序列对应的核苷酸序列。
本领域技术人员可知的，Omp16蛋白中一共有超过300个氨基酸，取包含26-168位氨基酸(例如取整条Omp16蛋白或例如取第20～300位氨基酸)这143个氨基酸的方案是必然可行的，而且包含26-168位氨基酸的氨基酸链越长效果可能会越好，这些方案的效果可能会优于只取26-168位氨基酸的方案。同样地，取包含猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸这215个氨基酸的方案是必然可行的，而且包含493-708位氨基酸的氨基酸链越长效果可能会越好，这些方案的效果可能会优于只取493-708位氨基酸的方案。
此外，融合蛋白中即使不包含Omp16蛋白的第26-168位这143个氨基酸的全部，而只是不间断地截取其中一段氨基酸序列，这样的方案也是可行的，只是效果可能会比取融合蛋白中包含Omp16蛋白的第26-168位这143个氨基酸的效果略差些。具体地，至少要不间断地截取Omp16蛋白26-168位氨基酸链中60％以上氨基酸数形成的肽段一，同样的，需要不间断地截取猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸链中60％以上氨基酸数形成的肽段二。例如取Omp16蛋白的第80～160位氨基酸为肽段一和取猪流行性腹泻病毒S蛋白520-688位氨基酸为肽段二，二者用接头连接起来即得所述融合蛋白。
此外，如果含猪流行性腹泻病毒的猪体内的猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸中的任意一个或多个产生了氨基酸突变，则相应的疫苗中融合蛋白的该处氨基酸序列也同样需要做相应的突变，这样才会产生很好的免疫效果。因此，在一种具体的实施方式中，所述融合蛋白中包括由肽段A产生一处或多处突变而形成的肽段B，所述肽段A为不间断地截取猪流行性腹泻病毒S蛋白493-708位氨基酸链中60％～100％氨基酸数形成的肽段，且所述多处突变所涉及的总突变氨基酸数目为肽段A总氨基酸数的10％以内；而融合蛋白基因的核苷酸序列中包括与肽段B相应的核苷酸序列。
本发明还提供一种上述融合蛋白的制备方法，包括将所述融合蛋白的基因克隆至原核表达载体并转化到原核表达宿主菌上，再经纯化得到融合蛋白。
在一种具体的实施方式中，所述原核表达载体为pET28a，所述原核表达宿主菌为BL21(DE3)。
本发明还提供一种猪用口服疫苗或药物，包括如上任意一项所述融合蛋白装入乳酸菌表达载体后，将乳酸菌表达载体转化到干酪乳杆菌标准菌株中并培养所述菌株而得到所述猪用口服疫苗或药物；优选所述乳酸菌表达载体为pVE5523，所述干酪乳杆菌标准菌株为ATCC393。
乳酸杆菌(Lacticacid bacteria)是一群杆状或球状的革兰氏阳性菌，与动物关系最密切，它是动物肠道和***中占优势的菌群之一。乳酸杆菌己知的生理功能主要表现为：阻止病原菌对肠道的入侵和定植，抑制病原菌，抗感染，维持肠道的微生态平衡，预防和抑制肿瘤的发生，增强机体免疫力。pVE5523载体是一种能携带功能基因并能在乳酸杆菌中进行蛋白分泌表达的载体。因此，给猪口服携带pVE5523-Omp16-PEDVS质粒的乳酸杆菌，能充分调动肠道的黏膜免疫应答水平，不失为一种方便、有效的预防PEDV感染的最有效疫苗。
本发明还提供所述猪用口服疫苗或药物在预防和治疗猪流行性腹泻中的应用。本发明中，将所述OMP16-PEDVS乳酸菌制成疫苗时其效果优于将其制成药物的效果。
实施例1
本实施例说明重组Omp16-PEDVS/ATCC393乳酸乳杆菌(实施例3中使用的口服疫苗)的制备方法，包括以下步骤：
1、合成OMP16-PEDVS基因，并在5’端加上Sal I限制性内切酶位点，以及3’加上EcoRV限制性内切酶位点，合成的基因克隆在pUC57载体上，命名为pUC57-Omp16-PEDVS(其融合蛋白的序列见序列SEQ.No.2)，pUC57-Omp16-PEDVS质粒的Sal I和Eco RV双酶切鉴定结果如图2所示。
2、pVE5523-Omp16-PEDVS质粒转化ATCC393乳酸乳杆菌
将测序正确的pUC57-Omp16-PEDVS的质粒以及pVE5523表达载体质粒进行Sal I和Eco RV双酶切，胶回收目的片段和pVE5523载体片段，用T4Ligase(T4DNA连接酶)进行连接，连接产物转化Top10大肠杆菌。之后挑取阳性克隆，摇菌后，提取质粒进行双酶切鉴定(如图3)，确保基因***了载体中，将正确的克隆命名为pVE5523-Omp16-PEDVS。
将pVE5523-Omp16-PEDVS质粒和ATCC393乳酸乳杆菌感受态(实验室保存)轻柔混匀后，冰上放置5min，将其转入直径1mm的预冷电转化杯中，迅速电击，电击参数为电压2.5kV，电击时间5ms，电击后加入800μl冰预冷的SGM17培养基，混匀，将菌液转移至1.5ml离心管中，冰上放置10min，28℃厌氧培养2h，取适量菌液涂布于含有5μg/ml红霉素的GM17琼脂培养基上，28℃厌氧培养2-3天，于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/ml红霉素的GM17液体培养基中，28℃厌氧培养48h后，从ATCC393中提出质粒，对重组质粒进行酶切鉴定和序列测定分析。将正确的克隆命名为重组Omp16-PEDVS/ATCC393乳酸乳杆菌。
3、重组菌保存试验
将重组Omp16-PEDVS/ATCC393乳酸乳杆菌200μl接种于含有5μg/ml红霉素的150mlGM17液体培养基中。28℃厌氧培养至OD600＝1.2，与150ml含4％蔗糖和10％脱脂乳混合物混合均匀，分装成1.5ml/管，冻干条件为(降温1h到-45℃，然后抽真空2.5h，温度达到-40℃；自然升温1h，到-10℃；在此温度下保温8h，升温1h到0℃，保温1h；升温1h到30℃保温6h。)；冻干菌储存条件分别为4℃，-20℃，-80℃，冻干菌分别经过保存15天，30天，60天，90天后进行菌体复苏并计数，结果活菌数均大于108CFU/ml，重组菌保存试验的结果见表1。
表1
表1的结果说明本发明所述乳酸菌口服疫苗具有良好的保存性能，即使在4℃的条件下，30天内细胞活力的下降也是很小的，保存手段合适时，该疫苗可以保存很长一段时间。
实施例2
本实施例说明重组Omp16-PEDVS和PEDVS原核表达蛋白(实施例3中使用的两种注射疫苗)的制备方法，包括以下步骤：
1、pET28a-OMP16-PEDVS表达载体的构建
以pVE5523-OMP16-PEDVS基因为模板，设计扩增OMP16-PEDVS的上游引物F1(见序列SEQ.No.3)和下游引物R1(见序列SEQ.No.4)，并在5’端加上Nco I限制性内切酶位点，以及3’加上Xho I限制性内切酶位点，将基因亚克隆在pET28a(+)原核表达载体上，命名为pET28a-OMP16-PEDVS。结果如图4中1所示，并将正确的质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌。
2、pET28a-PEDVS表达载体的构建
以pVE5523-OMP16-PEDVS基因为模板，设计扩增PEDVS的上游引物F2(见序列SEQ.No.5)和下游引物R2(见序列SEQ.No.6)，并在5’端加上Nco I限制性内切酶位点，以及3’加上Xho I限制性内切酶位点，将基因亚克隆在pET28a(+)原核表达载体上，命名为pET28a-PEDVS。结果如图4中2所示，并将正确的质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌。
3、蛋白的表达和纯化
将携带pET28a-OMP16-PEDVS和pET28a-PEDVS质粒的BL21(DE3)大肠杆菌分别接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基(Luria-Bertani液体培养基)中。重组细菌培养物生长至A600值为0.6-0.8，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度1mM/L，继续振荡培养4-5h测定诱导菌的A600值。然后，用Promega公司的MagneHisTM蛋白纯化试剂盒进行纯化，纯化后蛋白通过SDS-PAGE来进行纯度验证。结果如图5所示，图5为重组OMP16-PEDVS(图A)以及PEDVS蛋白(图B)表达及纯化结果。通过与蛋白质分子量Marker和诱导0h相比对，纯化后的泳道和诱导后的泳道分别出现蛋白质分子大小为40KD(OMP16-PEDVS)和23KD(PEDVS)的目的蛋白，说明目的蛋白得到了表达和纯化。
实施例3
本实施例说明OMP16-PEDVS乳酸菌(实施例1制备的口服疫苗)、OMP16-PEDVS蛋白和PEDVS蛋白(实施例2制备的两种注射疫苗)免疫效果对比。
1、动物免疫
取健康的雌性的SPF级(无特定病原体动物)C57/B6小鼠50只，分成OMP16-PEDVS乳酸菌、OMP16-PEDVS蛋白组、OMP16-PEDVS蛋白+弗氏佐剂组(OMP16-PEDVS+F’)、PEDVS蛋白组和对照组。本领域技术人员可知，弗氏完全佐剂一般在注射疫苗中起到免疫效果增强的作用。蛋白免疫使用的浓度为1mg/ml，添加弗氏完全佐剂组以蛋白：弗氏完全佐剂为1：1的比例进行乳化，每只200μl小鼠腿部肌肉注射免疫；首次免疫后14d，腿部肌肉注射加强免疫一次。
2、抗体水平
用间接ELISA检测分离的血清样本中IgG亚类(IgG1、IgG2a和IgG2b)。
包被抗原均以10μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃2h，然后用PBST(PBS+吐温)洗涤。每孔加100μL 5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μL TMB显色液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)，室温显色10min后每孔加入50μL 2M的硫酸终止反应，测OD450nm吸光值。分析结果。当样品OD450值≥(阴性血清的OD450值+3倍标准方差)时即为阳性。
将各实验组抗原以1μg/孔包被好酶联免疫吸附板后，将二免14d血清按1:100比例稀释作为一抗，以HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b以1:2000稀释后作为二抗，采用间接ELISA方法检测抗体水平，酶标仪OD450下读取数值，图6显示的结果表明OMP16-PEDVS乳酸菌、OMP16-PEDVS蛋白和OMP16-PEDVS+F’组抗体效价相当，显著高于PEDVS组和对照组。
3、细胞因子检测
用Elispot方法检测INF-γ含量，检测结果见图7A。用ELISA方法检测IL-10和IL-4含量，检测结果见图7B和7C。按细胞因子检测试剂盒的操作步骤进行。
应用ELISPOT方法测定各实验免疫组和对照组小鼠的淋巴细胞IFN-γ分泌水平，见图7A。所得结果表明：OMP16-PEDVS乳酸菌组、OMP16-PEDVS蛋白组和OMP16-PEDVS+F’组小鼠脾淋巴细胞上清液中INF-γ分泌量分别与PEDV组相比差异较显著(P＜0.05)，OMP16-PEDVS乳酸菌组、OMP16-PEDVS蛋白组和OMP16-PEDVS+F’组两两相比差异不显著(P>0.05)。
应用ELISA方法测定各组小鼠脾脏细胞上清液中IL-4和IL-10分泌水平。所得结果表明：OMP16-PEDVS乳酸菌组、OMP16-PEDVS蛋白组和OMP16-PEDVS+F’组小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-4(图7-C)和IL-10(图7-B)分泌量分别与PEDV组相比差异较显著(P＜0.05)，OMP16-PEDVS乳酸菌组、OMP16-PEDVS蛋白组和OMP16-PEDVS+F’组两两相比差异不显著(P>0.05)。
以上结果表明，本发明提供的重组蛋白OMP16-PEDVS组的免疫效果显著优于PEDVS组的免疫效果。另外，OMP16-PEDVS乳酸菌组的免疫效果和OMP16-PEDVS蛋白组及OMP16-PEDVS+F’组相当，说明OMP16-PEDVS乳酸菌口服使用能达到OMP16-PEDVS疫苗的效果，间接表明OMP16具有免疫佐剂的作用。以上对于疫苗的有效性，已经在理论上确认了是可行的，下一步需要进行实验室攻毒试验以及临床试验的验证。
相比于两种效果也不错的注射疫苗来说，OMP16-PEDVS乳酸菌是口服疫苗。口服疫苗中的融合蛋白并非由蛋白质纯化方式而得，而是通过乳酸菌的繁殖得到。因这两种注射疫苗都涉及融合蛋白的纯化，因而疫苗的制备成本高(添加弗氏完全佐剂的注射疫苗比单独用融合蛋白的注射疫苗的成本更高)；而口服疫苗的融合蛋白存在于乳酸菌中，因而不涉及融合蛋白的纯化，因而疫苗的制备成本低。且口服疫苗同样具有很好的效果，口服疫苗也方便使用。因此，本发明开发了一种效果明显且稳定的预防猪流行性腹泻用口服疫苗。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或所述融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种如权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，将所述融合蛋白的基因克隆至原核表达载体并转化到原核表达宿主菌上，再经纯化得到融合蛋白。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述原核表达载体为pET28a，所述原核表达宿主菌为BL21(DE3)。
4.一种猪用口服疫苗或药物，其特征在于，将如权利要求1所述融合蛋白的基因装入乳酸菌表达载体后，将乳酸菌表达载体转化到干酪乳杆菌标准菌株中并培养所述菌株而得到所述猪用口服疫苗或药物；所述乳酸菌表达载体为pVE5523，所述干酪乳杆菌标准菌株为ATCC393。
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