CN106188281B - 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用 - Google Patents
抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗诺如病毒GII.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用。实验结果表明,所述单克隆抗体具有极高的对诺如病毒GII.4的中和活性,而且该抗体不存在与GI.1病毒样颗粒的交叉反应,能够特异性识别GII.4病毒样颗粒。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及抗诺如病毒GII.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用。
背景技术
诺如病毒(NoVs)是导致急性肠胃炎的散发病例和大暴发的主要的病原体之一,而且,诺如病毒可以感染所有年龄段的人。尽管,诺如病毒感染后引起的症状一般比较温和,有自限性,病程持续1-3天左右,但是在小孩、老人以及免疫功能不全的人中仍可引起较为严重的症状,甚至引起死亡。根据VP1衣壳蛋白的氨基酸序列,诺如病毒可以分为6个基因组(G1-GVI),但只有GI,GII和GIV可以感染人类。人诺如病毒的感染主要由诺如病毒GII所引起,而大的暴发流行多由诺如病毒GII.4导致。GII.4病毒株的变异体所导致的诺如病毒的感染在全球的肠胃炎病例中占了大约55%-85%,而且那些病情比较严重需要住院治疗甚至导致死亡的病例也大多由诺如病毒GII.4引起。
诺如病毒在发达国家和发展中国家均有流行,给各国带来了严重的经济损失,儿童、老人的健康造成了很大的威胁。到目前为止,没有上市的预防性疫苗和特效的治疗性药物。诺如病毒缺少细胞培养模型,也没有小动物模型,这给疫苗和抗病毒药物的研究带来了很大的阻碍。
因此,本领域技术人员致力于开发具有良好临床应用前景的抗诺如病毒药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗诺如病毒GII.4鼠源单克隆抗体的制备和应用。
本发明的第一方面,提供了一种抗体的重链可变区,所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO:8所示的CDR1,
SEQ ID NO:9所示的CDR2,和
SEQ ID NO:10所示的CDR3;
优选地,所述重链可变区具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面,提供了一种抗体的重链,所述的重链具有如本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在另一优选例中,所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。
本发明的第三方面,提供了一种抗体的轻链可变区,所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR:
SEQ ID NO:14所示的CDR1',
SEQ ID NO:15所示的CDR2',和
SEQ ID NO:16所示的CDR3';
优选地,所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面,提供了一种抗体的轻链,所述的轻链具有如本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在另一优选例中,所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
本发明的第五方面,提供了一种抗体,所述抗体具有:
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区;和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区;
或者,所述抗体具有:
如本发明第二方面所述的重链;和/或如本发明第四方面所述的轻链。
本发明的第六方面,提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白具有:
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体;以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
本发明的第七方面,提供了一种多核苷酸,它编码选自下组的多肽:
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体;或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中,所述多核苷酸的序列具有如SEQ ID NO.:2和/或SEQ ID NO.:4所示的多核苷酸序列。
本发明的第八方面,提供了一种载体,它含有本发明本发明第七方面所述的多核苷酸。
本发明的第九方面,提供了一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明七方面所述的多核苷酸。
本发明的第十方面,提供了一种试剂盒,所述试剂盒中包括:
本发明第五方面所述的抗体。
在另一优选例中,所述试剂盒为酶联免疫检测试剂盒。
本发明的第十一方面,提供了一种免疫偶联物,该免疫偶联物含有:
(a)本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白;和
(b)选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
本发明的第十二方面,提供了一种药物组合物,所述组合物包含本发明第五方面所述的抗体、本发明第六方面所述的重组蛋白、或本发明第十一方面所述的免疫偶联物;以及
药学上可以接受的载体。
本发明的第十三方面,提供了一种重组多肽的制备方法,该方法包含:
(a)在适合表达的条件下,培养本发明第九方面所述的宿主细胞;
(b)从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化的抗GII.4单抗。5种纯化的抗体分别经含有还原剂的上样缓冲液处理后上样到12%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,并以考马斯亮蓝染色显示蛋白条带。M,蛋白分子量标准;1,D11单抗;2,G9单抗;3,2D8单抗;4,7D8单抗;5,8E1单抗
图2显示了酶联免疫吸附实验(Elisa)鉴定单抗与不同抗原的结合能力。在Elisa板上每孔分别包被100ngGII.4(A)或者GI.1(B)病毒样颗粒,每孔分别加不同浓度的纯化的单抗在37℃孵育2小时,接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。图中每个点显示了三个重复样品测定的OD450nm平均值和标准差。
图3显示了Westernblot分析。GII.4病毒样颗粒经处理后,在12%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,接着转印到PVDF膜上,用纯化的单抗进行杂交。M,蛋白分子量标准;1,D11单抗;2,G9单抗;3,2D8单抗;4,7D8单抗;5,8E1单抗;6,鼠抗GII.4病毒样颗粒克隆抗体。
图4显示了夹心Elisa检测GI.1和GII.4病毒样颗粒。在Elisa板上每孔分别包被50ul 1:5000稀释的兔抗GII.4(A)或者兔抗GI.1(B),每孔分别加不同浓度的GII.4病毒样颗粒(A)和GI.1病毒样颗粒(B)在37℃孵育2小时,接着每孔加入10ng的纯化的单抗,最后用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。
图5显示了替代中和试验检测纯化后单抗抑制GII.4病毒样颗粒与PGMIII作用的活性。在Elisa板上每孔包被50ul 10ug/ml PGMII,将不同浓度的单抗与0.5ug/ml GII.4病毒样颗粒在室温孵育1小时后加入Elisa板中,接着加入兔抗GII.4,最后用HRP标记的抗兔二抗进行孵育。抗乙肝表面抗原(HBsAg)单抗被用来做无关对照。
图6显示了基因重组表达的单克隆抗体的鉴定。在Elisa板上每孔分别包被100ngGII.4病毒样颗粒,每孔分别加不同浓度的纯化的单抗在37℃孵育2小时,接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育。未转染质粒的细胞的培养上清作为空白对照。图中柱状图显示了三个重复样品测定的OD450nm平均值和标准差。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一种抗诺如病毒GII.4鼠源单克隆抗体,实验结果表明,所述单克隆抗体具有极高的对诺如病毒GII.4的中和活性,而且该抗体不存在与GI.1病毒样颗粒的交叉反应,能够特异性识别GII.4病毒。本发明还提供了上述单克隆抗体的用途。
具体地,本研究以GII.4病毒样颗粒作为免疫原制备了能特异性识别GII.4的单克隆抗体8E1。Elisa和替代中和实验等方法说明该抗体可以用来灵敏检测和分析GII.4,更重要的是其还具有强大的中和活性。
在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料,本文在此处例举优选的方法和材料。
诺如病毒GII.4
诺如病毒GII.4属于诺如病毒属GII型,是引起诺如病毒暴发流行的主要病原体。诺如病毒在发达国家和发展中国家均有流行,给各国带来了严重的经济损失,儿童、老人的健康造成了很大的威胁。到目前为止,没有上市的预防性疫苗和特效的治疗性药物。
本发明利用重组GII.4病毒样颗粒作为免疫原制备了GII.4单克隆抗体。本发明制备的抗体不仅可以用作实验室检测用工具,而且是制备治疗性人源化单抗的可靠候选者和开发诊断方法的有用试剂。
本发明中使用诺如病毒GII.4 VP1制备了病毒样颗粒,其氨基酸序列为:
MASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIVVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDPTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGVLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTDHDFEANQNTKFTPVGVIQDGSTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTPNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRAL(SEQ ID NO.:1,GenBank ID:KC631827.1),309位丝氨酸(Ser)突变为天冬酰胺(Asn)。
本发明中使用诺如病毒GI.1VP1制备了病毒样颗粒,其氨基酸序列为:
MASKDATSSVDGASGAGQLVPEVNASDPLAMDPVAGSSTAVATAGQVNPIDPWIINNFVQAPQGEFTISPNNTPGDVLFDLSLGPHLNPFLLHLSQMYNGWVGNMRVRIMLAGNAFTAGKIIVSCIPPGFGSHNLTIAQATLFPHVIADVRTLDPIEVPLEDVRNVLFHNNDRNQQTMRLVCMLYTPLRTGGGTGDSFVVAGRVMTCPSPDFNFLFLVPPTVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVGTTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQFGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDLWKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHLASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPINGVFVFVSWVSRFYQLKPVGTASSARGRLGLRR(SEQ ID NO.:20,NP_056821.2)
抗体
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列,免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白:IgA,IgD,IgE,IgG和IgM,其中一些还可进一步分成亚类(同种型),如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用,术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体,即该群体中包含的单个抗体是相同的,除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且,与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同,各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外,单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的,不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性,是从基本均一的抗体群中获得的,这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗GII.4病毒单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗GII.4病毒单克隆抗体可变区链的单克隆抗体,以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地,本发明包括具有含超变区(互补决定区,CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
如本领域技术人员所知,免疫偶联物及融合表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗GII.4病毒单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗GII.4病毒单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段,如Fab或(Fab')2片段;抗体重链;抗体轻链。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
CDR1,其氨基酸序列为GYSFTDYYMH(SEQ ID NO:8),其编码核苷酸序列为,GGTTACTCATTCACTGACTACTACATGCAC(SEQ ID NO.:11);
CDR2,其氨基酸序列为YIDPFNGDTGYNQKFKV(SEQ ID NO.:9),其编码核苷酸序列为,TATATTGATCCTTTCAATGGTGATACTGGCTACAACCAGAAATTCAAGGTC(SEQ ID NO.:12);
CDR3,其氨基酸序列为DDWGSPFSY(SEQ ID NO.:10),其编码核苷酸序列为,GATGACTGGGGATCCCCGTTTTCTTAC(SEQ ID NO.:13)。
在另一优选例中,所述重链可变区的氨基酸序列为:
EIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGDTGYNQKFKVRATLTVDESSTTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARDDWGSPFSYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.:6)。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区,所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
在另一优选例中,所述抗体的重链氨基酸序列为:
MGWSWIFLFLLSGTAGVHSEIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGDTGYNQKFKVRATLTVDESSTTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARDDWGSPFSYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENCKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK(SEQ ID NO.:3)
如本文所用,术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中,根据本发明的抗体的轻链可变区,具有选自下组的互补决定区CDR:
CDR1',其氨基酸序列为RASHDIGSNLD(SEQ ID NO:14),其编码核苷酸序列为,CGGGCAAGTCATGACATTGGTAGTAACTTAGAC(SEQ ID NO.:17);
CDR2',其氨基酸序列为ATSTLDS(SEQ ID NO:15),其编码核苷酸序列为,GCCACATCCACTTTAGATTCT(SEQ ID NO.:18)
CDR3',其氨基酸序列为LQYASSPRT(SEQ ID NO:16),其编码核苷酸序列为,CTACAATATGCTAGTTCTCCTCGGACG(SEQ ID NO.:19)
在另一优选例中,所述的轻链可变区的氨基酸序列为:
DIQMTQSPSSLSASLGESVSLTCRASHDIGSNLDWLQQEPDGTIKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYASSPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.:7)。
在本发明的一个优选的实施方式中,所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区,所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在另一优选例中,所述抗体的轻链氨基酸序列为:
MRAAAQIFGFLLLLFPGTRCDIQMTQSPSSLSASLGESVSLTCRASHDIGSNLDWLQQEPDGTIKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYASSPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC(SEQ ID NO.:5)
在本发明中,术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用,都指特异性结合抗GII.4病毒的抗体,例如具有重链(如SEQ ID NO.:3的氨基酸序列)和/或轻链(如SEQ ID NO.:5的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中,所述的抗体为抗抗GII.4病毒的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体,它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地,所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地,本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
一般,抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述,称为可变区域(CDR),将该段间隔成4个框架区域(FR),4个FR的氨基酸序列相对比较保守,不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构,通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近,重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣,因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此,本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子,只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90%以上(较佳地95%以上,最佳地98%以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物,例如聚乙二醇)融合所形成的多肽,或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导,这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有抗GII.4病毒结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):一个或多个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽,如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外,本发明还包括了本发明抗体的片段。通常,该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸,较佳地至少约50个连续氨基酸,更佳地至少约80个连续氨基酸,最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中,“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:2、或4所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列,但与SEQ ID NO.:3、5、6、7、8、9、10、14、15、16所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1% Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:12和/或SEQ ID NO.:22所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属;鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞;真菌细胞如酵母;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用,也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合GII.4病毒样颗粒,因而可用于预防和治疗诺如病毒(NoVs)是导致急性肠胃炎。此外,还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时,是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明针对抗GII.4病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株;优选的,本发明提供了高效价的针对抗GII.4病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在获得生产本发明的抗GII.4病毒单克隆抗体的杂交瘤之后,本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外,本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区),然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如,本发明抗原,可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体,可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256;495,1975;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976;Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976;Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞,包括骨髓瘤细胞株,例如鼠类的骨髓瘤细胞株,包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection,洛克维尔,马里兰,美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications),51-63页(Marcel Dekker,Inc.,纽约,1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生,如,通过体外结合分析例如,酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后,可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned),并通过标准方法生长(Goding,单克隆抗体(MonoclonalAntibodies):原则和实践(Principles and Practice),Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括,例如,DMEM或RPMI-1640培养基。此外,杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离,这些纯化工艺为例如,蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种针对GII.4病毒的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液,经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中,单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内,10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水,经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
标记的免疫球蛋白(抗体)
在本发明的一个优选例中,所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地,所述的标记物选自下组:胶体金标记物、辣根过氧化物酶标记、有色标记物或荧光标记物。
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中,抗GII.4病毒的单克隆抗体用胶体金标记,得到胶体金标记的单克隆抗体。
本发明的抗GII.4病毒单克隆抗体具有很好的特异性,很高的效价。
检测板及其材料
本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料,采用常规的检测板制备方法制成。
本发明检测GII.4病毒的免疫检测板,包括测试条和支撑测试条的支撑板,如可采用PVC聚脂胶板等;所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成,搭接部位可以采用常规的方法,如胶带等固定连接;其中:层析材料预包被胶体金标记或有色标记的抗GII.4病毒单克隆抗体或多克隆抗体,优选被胶体金标记的抗GII.4病毒单克隆抗体,硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线;
在一个优选的方案中:层析材料上预包被胶体金标记的抗GII.4病毒单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的抗GII.4病毒单克隆抗体溶液进行预包被的,包被量为50μl/cm2;优选的浓度为0.5或1.5mg/ml,50μl/cm2;
检测方法与结果判定
平放检测板,将试样滴在滤样纸上,试样约120μl,3~5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。
阴性:质控区、检测区均出现明显的色带,示为阴性;
阳性:只在质控区出现明显色带,而在检测区无色带,示为阳性;
无效:质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带,表明检测方法错误或检测板变质或失效,应重新换取检测板检测。
方法和样本
本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测诺如病毒的方法。该方法步骤大致如下:获得细胞和/或组织样本;将样本溶解在介质中;检测在所述溶解的样本中GII.4病毒的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本,正如在液基细胞检测法中所使用的。
试剂盒
本发明还提供了一种指含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明进一步设计用于检测GII.4病毒水平的检测试剂盒,该试剂盒包括识别抗GII.4病毒的抗体,用于溶解样本的裂解介质,检测所需的通用试剂和缓冲液,如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明进一步设计开发用于对来自溶液样本的GII.4病毒感染相关情况诊断评估的试剂盒,该试剂盒可以检测存在于样本溶液中的GII.4病毒,其中保存样本的细胞保存液可以是诸如液基细胞检测法中的细胞保存液。
本发明的抗GII.4病毒单克隆抗体具有高亲和力、高特异性等优点,可广泛应用在制备GII.4病毒的检测领域,如检测试剂或检测设备的制备领域等,在特异性、灵敏度和检测率等方面较之传统的检测方法或检测试剂具有显著的优势。
本发明的主要优点在于:
(1)本发明的单克隆抗体8E1能够特异性的识别诺如病毒样颗粒;
(2)本发明的单克隆抗体8E1能够特异性的结合诺如病毒GII.4,与诺如病毒GI.1无交叉反应,从而实现对诺如病毒GI.1和诺如病毒GII.4的鉴定。
(3)本发明的单克隆抗体8E1对诺如病毒具有强大的中和活性。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
材料和方法
1抗原制备及小鼠免疫
利用杆状病毒-昆虫表达***,通过表达诺如病毒GII.4 VP1制备了病毒样颗粒[1]。将10ug的病毒样颗粒(50ul体积)与等体积的铝佐剂(500ug)混合后腹腔免疫6周雌性Balb/c小鼠,在0周、2周、4周各免疫一次。在第6周时,采取小鼠血清检测中和滴度。第7周时,中和滴度最高的一只小鼠通过尾静脉加强免疫15ugGII.4病毒样颗粒。3天后,取小鼠脾脏用于制备杂交瘤细胞。
2杂交瘤细胞株的制备和筛选
小鼠尾静脉加强免疫3天后,取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0通过PEG1500融合,制备杂交瘤细胞。9天之后,通过酶联免疫吸附试验筛选特异性分泌针对GII.4病毒样颗粒的抗体。简言之,GII.4病毒样颗粒包被96孔板,每孔100ng,4℃包被过夜,用含有5%脱脂牛奶的PBST封闭,每孔加50ul杂交瘤培养液在37℃孵育2小时,接着用HRP标记的二抗(sigma)孵育1小时,最后进行显色反应,读取OD450的吸光值。
3腹水制备和抗体纯化
雌性Balb/c小鼠腹腔注射500ul液体石蜡油,两周后,每只小鼠腹腔注射30万个杂交瘤细胞。7天后,12号针头收集腹水,10,000rpm离心10min,去除上层油脂和下层沉淀,取澄清的腹水进行抗体纯化。根据说明书,利用HiTrap HiTrapTM Protein G亲和柱(GEhealth care)纯化腹水获得抗体。
4酶联免疫吸附实验鉴定单克隆抗体
用每孔100ngGI.1或GII.4病毒样颗粒4℃过夜包被96孔Elisa板,鉴定单抗的结合能力。Elisa板经含5%脱脂牛奶的PBST在37℃封闭1个小时后,按每孔50ul将不同浓度(5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml和0.625ug/ml)加入单抗37℃孵育2小时,接着用HRP标记的抗鼠二抗进行孵育,最后读取吸光值OD450。
5聚丙烯酰胺凝胶电泳和western blot分析
蛋白样品与SDS-PAG上样缓冲液混合后,煮沸处理10min,经12%聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。通过考马斯亮蓝染色显示蛋白条带或者将蛋白转移到PVDF膜上进行western blot分析。单克隆抗体按最终浓度1ug/ml稀释到含1%脱脂牛奶的PBST中。鼠抗GII.4多克隆抗体1:1000稀释使用,接着用HPR标记的鼠二抗(sigma)进行孵育,最后用LAS-400发光图像分析仪进行记录。
6兔抗GI.1病毒样颗粒或GII.4病毒样颗粒多克隆抗体的制备
GI.1病毒样颗粒或GII.4病毒样颗粒与弗氏完全佐剂等体积混合充分乳化,皮下注射健康兔子150ug/只。3周和6周后将150ug的GI.1病毒样颗粒或GII.4病毒样颗粒与等量弗氏不完全佐剂佐剂混合,充分乳化后进行加强免疫。最后一次免疫后2周收集血清,分装后-80℃保存备用。
7夹心Elisa检测GI.1和GII.4病毒样颗粒
分别用兔抗GI.1病毒样颗粒的多抗血清(制备方法同上)和兔抗GII.4病毒样颗粒的多抗血清(制备方法同上)1:5000稀释度(50ul/孔)4℃过夜包被96孔Elisa板,Elisa板经含5%脱脂牛奶的PBST在37℃封闭2个小时后,将病毒样颗粒加入Elisa板中,40ng/50ul/孔始起,2倍比稀释12个浓度,37℃孵育2个小时,然后将病毒样颗粒特异的单抗10ng/50ul/孔37℃孵育1小时,接着用HPR标记的鼠二抗进行孵育,最后读取吸光值OD450。
8体外替代中和实验
用10ug/ml的猪胃粘液素Ⅲ(PGM)(上海远慕生物科技有限公司)(50ul/孔)室温包被96孔Elisa板,Elisa板经含5%脱脂牛奶的PBST在4℃封闭过夜后备用。将GII.4病毒样颗粒特异性单抗8ug/ml始起,2倍比稀释,与等体积0.5ug/ml的GII.4病毒样颗粒室温孵育1个小时后加到包被有PGM的96孔Elisa板上,室温孵育1个小时,然后加入兔抗GII.4病毒样颗粒多克隆抗体(制备方法同上)1:1000稀释液37℃孵育1小时,接着用HPR标记的兔二抗(sigma)进行孵育,最后读取吸光值OD450。
9单克隆抗体的基因序列扩增及表达载体的构建
先将杂交瘤细胞株的细胞用Trizol试剂提取总RNA,然后按照5’RACE试剂盒说明书扩增出重链和轻链全长基因。利用PCR扩增的方法在重链和轻链的5’端和3’端分别引入HindIII和EcoRI酶切位点,并将扩增出来的重链和轻链全的基因分别克隆到pGEM-T(Promage)中,筛选出阳性克隆测序,然后将序列正确的克隆用HindIII和EcoRI双酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化出目的片段后,与同酶切的质粒pcDNA3.1(Promage)用T4DNA连接酶连接,构建成真核表达载体pcDNA3.1-(m8E1H)和pcDNA3.1-(m8E1L)。
10单克隆抗体基因的重组表达鉴定
利用脂质体的方法共转染pcDNA3.1-(m8E1H)和pcDNA3.1-(m8E1L)到CHO细胞,72小时后收取培养上清进行分析,采用ELISA确定培养上清中的抗体的表达:用GI.1病毒样颗粒包板,用含5%牛奶的PBST于37℃封闭1小时,加入不同稀释度的待测培养上清37℃孵育2小时,接着用HRP标记的抗鼠IgG二抗进行孵育,最后读取吸光值OD450。
实施例1 分泌GII.4特异抗体的杂交瘤细胞的筛选
免疫了GII.4病毒样颗粒小鼠的脾脏细胞用来制备杂交瘤细胞。通过Elisa实验筛选杂交瘤细胞上清,从而获得能够分泌具有结合病毒能力的杂交瘤细胞株。最终,五株具有优异结合能力的单抗被筛选出来,他们都能够结合GII.4病毒样颗粒。亚型鉴定显示,G9、D11、7D8和8E1属IgG1,2D8属IgG3。
表1.分泌单抗的杂交瘤细胞株鉴定
杂交瘤细胞株 | 重链 | 轻链 | 与GII.4VLP结合能力* |
G9 | IgG1 | kappa | +++ |
D11 | IgG1 | kappa | +++ |
2D8 | IgG3 | kappa | +++ |
7D8 | IgG1 | kappa | +++ |
8E1 | IgG1 | kappa | +++ |
用于分析的样品均为50ul杂交瘤培养细胞。
*,+:OD450nm>0.15;++:OD450nm>0.3;+++:OD450nm>0.5。
实施例2 抗GII.4单抗的特异性分析
首先通过SDS-PAGE鉴定从腹水中纯化的GII.4单抗的纯度和完整性。图1显示了五种单抗的重链和轻链分别为50KD和25KD左右。接着,通过Elisa方法检测了单抗与不同抗原的反应活性,包括GI.1病毒样颗粒和GII.4病毒样颗粒。图2显示G9、D11、2D8和8E1可以特异性识别GII.4病毒样颗粒,不存在与GI.1病毒样颗粒的交叉反应,而有些单抗(如,7D8),同时与GI.1病毒样颗粒和GII.4病毒样颗粒结合,无法特异性识别GII.4病毒。
最后,通过Western blot分析单抗与GII.4的结合情况,图3显示,五种抗体中:D11、G9和8E1能够识别天然结构的GII.4病毒样颗粒,不能够识别变性后的GII.4病毒样颗粒,提示D11、G9和8E1识别的表位可能是构象表位。
实施例3 基于单抗的夹心Elisa可以特异灵敏地检测到GI.1和GII.4病毒样颗粒
通过夹心Elisa测定单抗对病毒样颗粒的最低检出限度(当OD450nm>0.15时,判为阳性)。图4显示了G9、D11、7D8和8E1单抗均可特异灵敏地检测到GII.4病毒样颗粒,最低检出限度分别为:0.3125ng、0.3125ng、0.3125ng、0.625ng。
实施例4 单克隆抗体的潜在中和活性
组织血型抗原(HBGA)是存在于粘膜组织和红细胞上的糖类,是诺如病毒感染所需的受体。HBGA的结合抑制试验被广泛用作为抗体介导的诺如病毒的替代中和试验。猪胃粘液素Ⅲ(PGM)中含有HBGA,已经被验证可以用于替代中和试验[2]。通过替代中和试验分别对G9、D11、2D8、7D8和8E1五种单抗的潜在中和活性进行检测。图5显示,D11、G9和8E1对GII.4显示了良好的中和活性,它们阻止病毒样颗粒与PGM结合的EC50分别是:0.0979ug/ml、0.6948ug/ml和0.04357ug/ml。上述结果表明,8E1对GII.4中和活性要远优于其它的抗体株,8E1单抗对GII.4的中和活性是D11抗体株的两倍多,是G9抗体株的16倍左右。
实施例5 单克隆抗体的基因序列分析
克隆出来的8E1的单抗的重链和轻链序列如下(其中,单下划线部分为信号肽序列,斜体部分为可变区序列,为恒定区序列):
8E1单抗重链核苷酸序列:
ATGGGATGGAGCTGGATCTTTCTCTTCCTTCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT (SEQ ID NO.:2)
8E1单抗重链氨基酸序列:
MGWSWIFLFLLSGTAGVHS (SEQ ID NO.:3)
8E1单抗轻链核苷酸序列:
ATGAGGGCTGCTGCACAGATTTTTGGCTTCTTGTTGCTCTTGTTTCCAGGTACCAGATGT (SEQ ID NO.:4)
8E1单抗轻链氨基酸序列:
MRAAAQIFGFLLLLFPGTRC (SEQ ID NO.:5)
进一步分析8E1单抗重链可变区和轻链可变区序列,8E1单抗重链可变区氨基酸如下(下划线标注的为重链CDR区):
EIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFTDYYMHWVKQSHGKSLEWIGYIDPFNGDTGYNQKFKVRATLTVDESSTTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARDDWGSPFSYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO.:6)
上述重链可变区属于IGHV1亚群。
8E1单抗轻链可变区氨基酸如下(下划线标注的为重链CDR区):
DIQMTQSPSSLSASLGESVSLTCRASHDIGSNLDWLQQEPDGTIKRLIYATSTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYASSPRTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.:7)
上述轻链可变区属于IGKV9亚群。
各CDR区氨基酸序列和核苷酸序列总结于表2。
表2
实施例6 单克隆抗体基因的重组表达及鉴定
为了验证所克隆出的8E1单抗的基因是否正确,将重链和轻链的编码序列分别***到pcDNA3.1中,构建表达载体pcDNA3.1-(m8E1H)和pcDNA3.1-(m8E1L),然后共转染CHO细胞,并通过ELISA检测细胞上清中是否有特异性结合GII.4病毒样颗粒的抗体存在。图6显示,表达8E1单抗序列的细胞上清有很高的结合信号,而且与上清的稀释倍数相关;而没有转染相关质粒的对照细胞的上清不管是否稀释都没有结合信号。该结果说明了本发明的8E1单抗能够成功地在宿主细胞中表达。
讨论
本发明获得了能特异结合GII.4病毒颗粒的单克隆抗体8E1,其具有强大的潜在中和活性,可以经过人源化后用作治疗性单克隆抗体药物或用作检测试剂。通过夹心ELISA检测,单克隆抗体8E1对GII.4病毒样颗粒的最低检出限度为0.625ng,这为将这些单克隆抗体开发成诺如病毒检测试剂盒提供了有利的理论依据。而本发明所得到的针对GII.4的单克隆抗体8E1对GII.4和PGM的相互作用的EC50为:0.04357ug/ml,远优于其它的单克隆抗体。而且,Western显示8E1单抗识别的表位为构象表位,这使得8E1只能识别空间构象正确的病毒颗粒,而不能识别解聚的和变性的病毒颗粒,能够用于可靠地病毒颗粒定量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (13)
1.一种抗体,其特征在于,所述抗体具有重链可变区和轻链可变区,
其中,所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO:8所示的CDR1,
SEQ ID NO:9所示的CDR2,和
SEQ ID NO:10所示的CDR3;
并且,所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR:
SEQ ID NO:14所示的CDR1',
SEQ ID NO:15所示的CDR2',和
SEQ ID NO:16所示的CDR3'。
2.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
3.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。
5.如权利要求1所述的抗体,其特征在于,所述抗体的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
6.一种重组蛋白,其特征在于,所述的重组蛋白具有:
(i) 如权利要求1-5任一项所述的抗体;以及
(ii) 任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸,其特征在于,它编码选自下组的多肽:
(1) 如权利要求1-5任一项所述的抗体;或
(2) 如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体,其特征在于,它含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中包括:
权利要求1-5中任一项所述的抗体。
11.一种免疫偶联物,其特征在于,该免疫偶联物含有:
(a) 权利要求1-5中任一项所述的抗体或权利要求6所述的重组蛋白;和
(b) 选自下组的偶联部分:可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
12.一种药物组合物,其特征 在于,所述组合物包含权利要求1-5中任一项所述的抗体、权利要求6所述的重组蛋白、或权利要求11所述免疫偶联物;以及
药学上可以接受的载体。
13.一种重组多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含:
(a) 在适合表达的条件下,培养权利要求9所述的宿主细胞;
(b) 从培养物中分离出重组多肽,所述的重组多肽是权利要求1-5中任一项所述的抗体或权利要求6所述的重组蛋白。
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C10 | Entry into substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Building 2, No. 225, Chongqing South Road, Huangpu District, Shanghai, 200025 Patentee after: Shanghai Institute of Immunology and Infection, Chinese Academy of Sciences Address before: No. 411, Hefei Road, Huangpu District, Shanghai 200025 Patentee before: INSTITUT PASTEUR OF SHANGHAI, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES |
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CP03 | Change of name, title or address |