CN106153664B - 一种检测海洋多糖抗氧化作用的方法、试液及制备试液的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测海洋多糖抗氧化作用的方法、试液及制备试液的方法。所述检测海洋多糖抗氧化作用的方法包括如下步骤：步骤101，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；步骤102，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 ‑·)的浓度；步骤103，根据步骤102的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。本发明提出的检测多糖抗氧化作用的方法准确度高，且能够检出海洋多糖对不同种类ROS的抗氧化作用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测海洋多糖抗氧化作用的方法、试液及制备试液的方法。
背景技术
自然界中的植物、动物及微生物体内都含有多糖。多糖在医药及食品保健领域应用广泛，发展迅速，具有很好的开发前景。海洋生物由于特殊的生活环境，导致海洋生物体内多糖的合成过程与陆地生物不同，因此产生许多结构新颖、作用特殊的活性物质，其中不少海洋生物具有显著的抗肿瘤功能和免疫调节作用。
海洋生物多糖根据来源不同可分为三大类，海藻多糖，海洋动物多糖和海洋微生物多糖。不同多糖的生物活性有所差别，活性高低受多糖的结构、分子量等多种因素影响，多糖类药品及保健品的功效存在很大差异，检测海洋多糖的生物活性是判断多糖药品及保健品功效的方法之一。
传统的动物学实验检测多糖活性方法存在动物个体差异、工作量大、资金消耗多等问题。目前细胞体系中抗氧化活性的检测通常通过DCFH-DA来检测，检测过程中利用荧光探针来检测被检样品中的活性氧自由基(ROS)。在检测过程中，荧光酶标仪发挥着重要的作用，其根据加入荧光探针后细胞群体的吸光值大小来判断细胞活性，而DCFH-DA用来检测细胞体系中活性氧自由基。DCFH-DA检测方法的原理如下：细胞经过氧化氢(H2O2)处理后开始产生炎症反应，容易触发过氧化反应的发生，而再经多糖样品处理后，可以有效的减弱这种过氧化反应，起到一定的抗氧化作用，在细胞体系中加入DCFH-DA荧光探针标记体系中的ROS，然后在激发和发射波长分别为485nm和530nm处测定各孔的荧光强度，进而分析多糖抗氧化作用的效果。该方法的不足是仅通过荧光值来间接反映试液中ROS的量，因此准确度较差，而且荧光值仅代表被检样品中ROS的总量，而不能分别检出不同种类的ROS含量。并且DCFH-DA方法所检测到的荧光值表示的是被检样品中ROS的总量，而本方法可准确的分别检出不同种类的ROS含量。
因此，现有的检测多糖抗氧化作用的方法存在准确度差，且不能检出海洋多糖对不同种类ROS的抗氧化作用。建立一种新的检测海洋多糖抗氧化活性的方法极为必要。
电子自旋共振波谱(ESR)法是一种根据电子自旋共振波谱吸收程度，检查组织、细胞或者其提取液中的自由基，并通过朗达(Lande)g因子的测定来推断自由基离子的存在状态的方法。电子自旋共振波谱技术可以较为准确地检测不同种类自由基的含量，因此有可能将该项技术应用于检测海洋多糖的抗氧化作用。图1和图2示出了用DMPO分别捕获OH·自由基和O2 -·自由基典型的ESR谱图。
电子自旋共振波谱技术迄今还未见于涉及体外(细胞体系)检测相关专利，关于海洋多糖的专利如专利CN201210094611.8涉及一种海洋多糖双组分絮凝剂处理海水养殖废水的方法，专利CN201010577744.1涉及一种具有抗菌功能的海洋多糖多层复合包装膜，专利CN200610125844.4涉及一种多功能果蔬保鲜剂，专利CN200510047285.5涉及一种同时测定细胞活性氧与还原型谷胱甘肽的检测方法，专利CN200610049809.9涉及一种改良的细胞内活性氧检测方法，而关于利用电子自旋共振波谱技术检测细胞内ROS的研究未见于相关专利，故利用电子自旋共振波谱技术检测海洋多糖在细胞体系内抗氧化活性明显具有突破性意义，因此有希望在利用现有的高新技术的基础上，实现更快速更精准的海洋多糖抗氧化作用的实时定量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测海洋多糖抗氧化作用的方法、试液及制备试液的方法，以解决现有技术的检测多糖抗氧化作用的方法存在准确度差，且不能检出海洋多糖对不同种类ROS的抗氧化作用的技术问题。
本发明实现上述目的的技术方案如下：
一种检测海洋多糖抗氧化作用的方法，包括如下步骤：
步骤101，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；
步骤102，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；
步骤103，根据步骤102的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤101包括如下步骤：
步骤A，取多糖样品配制成多糖溶液；
步骤B，取RAW264.7细胞，并调整细胞密度至105～106个/mL；
步骤C，取所述步骤B得到的细胞液，加入0.25mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液到所述步骤A中的所述多糖溶液，得到若干份浓度在0～200μg/mL之间且浓度不同的试液，并对其进行培养，由此就得到了用于检测海洋多糖抗氧化作用的所述待测试液。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤A和所述步骤B同时进行，或所述步骤B在所述步骤A之前进行。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤A中用DMEM培养基或蒸馏水配制所述多糖溶液。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤B包括使用DMEM培养基调整RAW264.7细胞密度。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤B包括将调整过细胞密度的所述RAW264.7细胞置于37℃下进行培养24h。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤C将加入H2O2溶液后的细胞液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱培养24h，将加入多糖溶液后的细胞液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱分别培养30min和5min，分别用于最终检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度。
如上所述的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，进一步，其中所述步骤102在常温条件下进行。
本发明还提出一种制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法，包括如下步骤：
步骤A，取多糖样品配制成多糖溶液；
步骤B，取RAW264.7细胞，并调整细胞密度至105～106个/mL；
步骤C，取所述步骤B得到的细胞液，加入0.25mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液到所述步骤A中的所述多糖溶液，得到若干份浓度在0～200μg/mL之间且浓度不同的试液，并对其进行培养，由此就得到了用于检测海洋多糖抗氧化作用的所述待测试液。
本发明还提出一种制备用于检测海洋多糖抗氧化作用的试液，其用如上的制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法制备。
本发明的有益效果是：
本发明提出的制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法及用该方法制备出的用于检测海洋多糖抗氧化作用的试液，采用了稳定的单核巨噬细胞株RAW264.7细胞，该细胞株先前已被广泛使用于分子水平来表征各种组分的免疫调节作用，同时也是常用的抗氧化及炎症细胞模型之一。
进一步地，本发明依据上述制备方法和制备出的试液提出了一种基于电子自旋共振波谱(ESR)技术检测海洋多糖抗氧化作用的方法，该方法通过检测单核巨噬细胞株RAW264.7细胞上清液中ROS含量来评价海洋多糖抗氧化活性，降低了检测难度，提高了检测结果的稳定性，丰富了检测方法。
此外，本发明提出的检测方法采用了电子自旋共振波谱检测技术，其具有检测范围广、检测对象广泛、检测条件简单、检测灵敏度高等优点。当经药物刺激后的细胞上清液中ROS浓度很低时，利用普通的方法很可能不能检出，但利用本方法将大大提高灵敏度，且能在自由基层面上分析传统方法检测的结果，给出一个合理的解释。
本发明实现了快速有效检测海洋多糖抗氧化活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本发明从自由基的角度为该方面的检测拓宽了思路。
另外，本发明提出的方法有望应用于细胞生物学，药物分析，环境毒性物质检测等相关领域。
附图说明
图1是现有技术中用DMPO捕获OH·自由基的ESR谱图。
图2是现有技术中用DMPO捕获O2 -·自由基的ESR谱图。
图3是本发明一实施例的检测海洋生物多糖抗氧化活性的流程图。
图4(A)和图4(B)是本发明实施例1对扇贝多糖抗氧化活性的检测所获得的ESR谱图。
图5(A)和图5(B)是本发明实施例2对裙带菜孢子叶多糖抗氧化活性的检测所获得的ESR谱图。
图6(A)和图6(B)是本发明实施例3对海参水煮液多糖抗氧化活性的检测所获得的ESR谱图。
其中，
图4(A)所示为扇贝多糖对经H2O2处理的巨噬细胞内OH·的清除作用；图4(B)所示为扇贝多糖对经H2O2处理的巨噬细胞内O2 -·的清除作用。图4中：(a)空白对照；(b)H2O20.25mmol/L；(c)扇贝多糖12.5μg/mL；(d)扇贝多糖25μg/mL；(e)扇贝多糖50μg/mL；(f)扇贝多糖100μg/mL；(g)扇贝多糖200μg/mL。
图5(A)所示为裙带菜孢子叶多糖对经H2O2处理的巨噬细胞内OH·的清除作用；图5(B)所示为裙带菜孢子叶多糖对经H2O2处理的巨噬细胞内O2 -·的清除作用。图5中：(a)空白对照；(b)H2O2 0.25mmol/L；(c)裙带菜孢子叶多糖12.5μg/mL；(d)裙带菜孢子叶多糖25μg/mL；(e)裙带菜孢子叶多糖50μg/mL；(f)裙带菜孢子叶多糖100μg/mL；(g)裙带菜孢子叶多糖200μg/mL。
图6(A)所示为海参水煮液多糖对经H2O2处理的巨噬细胞内OH·的清除作用；图6(B)所示为海参水煮液多糖对经H2O2处理的巨噬细胞内O2 -·的清除作用。图6中：(a)空白对照；(b)H2O2 0.25mmol/L；(c)海参水煮液多糖12.5μg/mL；(d)海参水煮液多糖25μg/mL；(e)海参水煮液多糖50μg/mL；(f)海参水煮液多糖100μg/mL；(g)海参水煮液多糖200μg/mL。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明基于电子自旋共振波谱(ESR)技术，提出了一种检测海洋多糖抗氧化活性的方法、试液及制备试液的方法。下文详细阐述了这种检测海洋多糖抗氧化活性的方法，以及制备用于这种检测方法的试液。
如图3所示，本发明所提出的检测海洋多糖抗氧化作用的方法，包括如下步骤：
步骤101，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；
步骤102，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；
步骤103，根据步骤102的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。
本发明提出的检测方法采用了电子自旋共振波谱检测技术，其具有检测范围广、检测对象广泛、检测条件简单、检测灵敏度高等优点。当经药物刺激后的细胞上清液中ROS浓度很低时，利用普通的方法很可能不能检出，但利用本方法将大大提高灵敏度，且能在自由基层面上分析传统方法检测的结果，给出一个合理的解释。
本发明实现了快速有效检测海洋多糖抗氧化活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本发明从自由基的角度为该方面的检测拓宽了思路。
RAW264.7细胞株先前已被广泛使用于分子水平来表征各种组分的免疫调节作用，同时也是常用的抗氧化及炎症细胞模型之一。该细胞株生长密度较大，通常大于106，但实际操作中考虑到96孔板额定体积，一般将细胞密度调整为105～106较为适宜。
其中，所述步骤101包括如下步骤：
步骤A，取多糖样品配制成多糖溶液；
具体地，使用DMEM培养基或蒸馏水配制所述多糖溶液。通常细胞实验中，样品多用培养基进行配制，以保证细胞生长中所需营养物质充足，但亦存在用蒸馏水配制的实例，蒸馏水配制的好处为避免了培养基中复杂的组分，能够单纯考察样品对细胞的作用。
步骤B，取RAW264.7细胞，并调整细胞密度至105～106个/mL；
具体地，使用DMEM培养基调整RAW264.7细胞密度，并将调整过细胞密度的所述RAW264.7细胞置于37℃下进行培养24h。通常哺乳动物细胞均在37℃细胞培养箱内进行常规培养，培养时间依实际情况而定。
其中，所述步骤A也能够和所述步骤B同时进行，或所述步骤B在所述步骤A之前进行。实际上，步骤A和步骤B的顺序无强制性要求，可按照实际操作情况自行制定。
步骤C，取所述步骤B得到的细胞液，加入0.25mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液到所述步骤A中的所述多糖溶液，得到若干份浓度在0～200μg/mL之间且浓度不同的试液，并对其进行培养，由此就得到了用于检测海洋多糖抗氧化作用的所述待测试液。
具体地，其将加入H2O2溶液后的细胞液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱培养24h，将加入多糖溶液后的细胞液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱分别培养30min和5min，分别用于最终检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度。自由基寿命极短，短时间内即发生淬灭，淬灭后，信号不再被捕捉到，根据大量的实验摸索，发现，在5～30min时间段内，可完整检测到生成的自由基。
所述步骤102在常温条件下进行。本发明中，步骤102适宜在常温条件用ESR设备进行测试，所测试出的结果比较准确。
具体地，在利用ESR检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的过程中，ESR的具体参数分别如下所示：
OH·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.8GHz；微波功率：20mW；调制幅度：0.2mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：0.1s；温度：26℃。
O2 -·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.44GHz；微波功率：1.16mW；调制幅度：0.1mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：3s；温度：26℃。
所述步骤103根据所述步骤102的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。
具体地，根据比较不同浓度的海洋多糖待测试样中的羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度，来判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。若待测试液的多糖浓度越高，所检测到的羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度越低，并且所检测到的羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度对待测试液的多糖浓度越敏感，则说明所检测的多糖样品的抗氧化作用越强，反之则不强。
本发明还提出了一种制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法，包括如下步骤：
步骤A，取多糖样品配制成多糖溶液；
步骤B，取RAW264.7细胞，并调整细胞密度至105～106个/mL；
步骤C，取所述步骤B得到的细胞液，加入0.25mM的过氧化氢H2O2溶液到所述步骤A中的所述多糖溶液，得到若干份浓度在0～200μg/mL之间且浓度不同的试液，并对其进行培养，由此就得到了用于检测海洋多糖抗氧化作用的所述待测试液。
本发明还提出一种制备用于检测海洋多糖抗氧化作用的试液，其用如上的制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法制备。将该试液用于检测海洋多糖抗氧化作用，能降低检测的难度，提高检测结果的稳定性。
实例1扇贝多糖在巨噬细胞内的抗氧化活性的检测
步骤101’，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；
具体地，取扇贝多糖样品，用DMEM培养基配制成200μg/mL(微克每毫升，下同)的扇贝多糖溶液；取过氧化氢(H2O2)样品，用DMEM培养基配制0.25mmol/L的H2O2溶液；用DMEM培养基将RAW264.7细胞密度调整至3×105个/mL；将调整好密度的细胞置于96孔细胞培养板中，在37℃下培养24h；在所述96孔培养板中加入适量H2O2溶液，使其浓度为0.25mmol/L；将所述96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养24h；向96孔培养板中加入适量扇贝多糖溶液，使不同孔中扇贝多糖浓度分别为0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；将所述96孔培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5％的二氧化碳培养箱中分别继续培养30min和5min，分别用于最终检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；收集所述96孔培养板不同多糖浓度细胞液(细胞上清)，此即是用于检测扇贝多糖抗氧化作用的待测试液。
步骤102’，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；
具体地，向tube管中加入待测试液及ROS捕获剂(DMPO)并充分混匀；利用毛细管吸混合液至适当高度，并用凡士林封毛细管下口，然后擦净管壁残余的凡士林；利用ESR技术检测羟基自由基(OH·)和超氧阴离子自由基(O2 -·)生成情况，得到各多糖浓度下DMPO-OO(H)及DMPO-OH信号图谱见图4。在利用ESR检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的过程中，ESR的具体参数分别如下所示：
OH·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.8GHz；微波功率：20mW；调制幅度：0.2mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：0.1s；温度：26℃。
O2 -·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.44GHz；微波功率：1.16mW；调制幅度：0.1mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：3s；温度：26℃。
步骤103’，根据步骤102’的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。
根据步骤102’中所获得的图谱判定所述扇贝多糖样本的抗氧化活性。由图4可知，H2O2对照组的峰高发生显著增高，与其相比，加入了浓度递增的扇贝多糖后，OH·及O2 -·的ESR峰高均发生明显降低，表明扇贝多糖有效的阻止了氧化进程，具有较好的抗氧化作用。
实例2裙带菜孢子叶多糖在巨噬细胞内的抗氧化活性的检测
步骤101”，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；
具体地，取RAW264.7细胞，用DMEM培养基将RAW264.7细胞密度调整至5×105个/mL。然后，取裙带菜孢子叶多糖样品，用蒸馏水配制成200μg/mL的裙带菜孢子叶多糖溶液；取过氧化氢(H2O2)样品，用蒸馏水配制0.25mmol/L的H2O2溶液；将调整好密度的细胞置于96孔细胞培养板中，在37℃下培养24h；在所述96孔培养板中加入适量H2O2溶液，使其浓度为0.25mmol/L；将所述96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养24h；向96孔培养板中加入适量裙带菜孢子叶多糖溶液，使不同孔中裙带菜孢子叶多糖浓度分别为0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；将所述96孔培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5％的二氧化碳培养箱中分别继续培养30min和5min，分别用于最终检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；收集所述96孔培养板不同多糖浓度的细胞液(细胞上清)，此即是用于检测裙带菜孢子叶多糖抗氧化作用的待测试液。
步骤102”，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；
具体地，向tube管中加入待测试液及ROS捕获剂(DMPO)并充分混匀；利用毛细管吸混合液至适当高度，并用凡士林封毛细管下口，然后擦净管壁残余的凡士林；利用ESR技术检测羟基自由基(OH·)和超氧阴离子自由基(O2 -·)生成情况，得到各多糖浓度下DMPO-OO(H)及DMPO-OH信号图谱见图5。在利用ESR检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的过程中，ESR的具体参数分别如下所示：
OH·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.8GHz；微波功率：20mW；调制幅度：0.2mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：0.1s；温度：26℃。
O2 -·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.44GHz；微波功率：1.16mW；调制幅度：0.1mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：3s；温度：26℃。
步骤103”，根据步骤102”的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。
根据步骤102”中所获得的图谱判定所述裙带菜孢子叶多糖样本的抗氧化活性。由图5可知，H2O2对照组的峰高发生显著增高，与其相比，加入了浓度递增的裙带菜孢子叶多糖后，OH·及O2 -·的ESR峰高均发生明显降低，表明裙带菜孢子叶多糖有效的阻止了氧化进程，具有较好的抗氧化作用。
实例3海参水煮液多糖在巨噬细胞内的抗氧化活性的检测
步骤101”’，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；
具体地，取海参水煮液多糖样品，用DMEM培养基配制成200μg/mL的海参水煮液多糖溶液；取过氧化氢(H2O2)样品，用DMEM培养基配制0.25mmol/L的H2O2溶液；用DMEM培养基将RAW264.7细胞密度调整至1×106个/mL；将调整好密度的细胞置于96孔细胞培养板中，在37℃下培养24h；在所述96孔培养板中加入适量H2O2溶液，使其浓度为0.25mmol/L；将所述96孔细胞培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养24h；向96孔培养板中加入适量海参水煮液多糖溶液，使不同孔中海参水煮液多糖浓度分别为0μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL；将所述96孔培养板置于温度为37℃、CO2浓度为5％的二氧化碳培养箱中分别继续培养30min和5min，分别用于最终检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；收集所述96孔培养板不同多糖浓度的细胞液(细胞上清)，此即是用于检测海参水煮液多糖抗氧化作用的待测试液。
步骤102”’，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；
具体地，向tube管中加入待测试液及ROS捕获剂(DMPO)并充分混匀；利用毛细管吸混合液至适当高度，并用凡士林封毛细管下口，然后擦净管壁残余的凡士林；利用ESR技术检测羟基自由基(OH·)和超氧阴离子自由基(O2 -·)生成情况，得到各多糖浓度下DMPO-OO(H)及DMPO-OH信号图谱见图6。在利用ESR检测羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的过程中，ESR的具体参数如下所示：
OH·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.8GHz；微波功率：20mW；调制幅度：0.2mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：0.1s；温度：26℃。
O2 -·：X-波段；调制频率：100kHz；谐振频率：9.44GHz；微波功率：1.16mW；调制幅度：0.1mT；中心磁场：336mT；扫描时间：30s；扫描宽度：10mT；时间常数：3s；温度：26℃。
步骤103”’，根据步骤102”’的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低。
根据步骤102”’中所获得的图谱判定所述海参水煮液多糖样本的抗氧化活性。由图6可知，H2O2对照组的峰高发生显著增高，与其相比，加入了浓度递增的海参水煮液多糖后，OH·及O2 -·的ESR峰高均发生明显降低，表明海参水煮液多糖有效的阻止了氧化进程，具有较好的抗氧化作用。
从上述实施例可知，本发明提出的制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法及用该方法制备出的用于检测海洋多糖抗氧化作用的试液，采用了稳定的单核巨噬细胞株RAW264.7细胞，该细胞株先前已被广泛使用于分子水平来表征各种组分的免疫调节作用，同时也是常用的抗氧化及炎症细胞模型之一。
进一步地，本发明依据上述制备方法和制备出的试液提出的基于电子自旋共振波谱(ESR)技术检测海洋多糖抗氧化作用的方法，通过检测单核巨噬细胞株RAW264.7细胞上清液中ROS含量来评价海洋多糖抗氧化活性，降低了检测难度，提高了检测结果的稳定性，丰富了检测方法。
此外，本发明提出的检测方法采用了电子自旋共振波谱检测技术，其具有检测范围广、检测对象广泛、检测条件简单、检测灵敏度高等优点。当经药物刺激后的细胞上清液中ROS浓度很低时，利用普通的方法很可能不能检出，但利用本方法将大大提高灵敏度，且能在自由基层面上分析传统方法检测的结果，给出一个合理的解释。
本发明实现了快速有效检测海洋多糖抗氧化活性，检测过程简洁，检测结果稳定可靠，并且本发明从自由基的角度为该方面的检测拓宽了思路。
因此，本发明提出的方法有望应用于细胞生物学，药物分析，环境毒性物质检测等相关领域。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种检测海洋多糖抗氧化作用的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤101，准备用于检测海洋多糖抗氧化作用的待测试液；
步骤102，用ESR法检测所述待测试液中羟基自由基(OH·)及超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度；
步骤103，根据步骤102的检测结果判定所检测的多糖样品的抗氧化活性高低；
其中，所述步骤101包括如下步骤：
步骤A，取多糖样品配制成多糖溶液；
步骤B，取RAW264.7细胞，并调整细胞密度至105～106个/mL；
步骤C，取所述步骤B得到的细胞液，采用0.25mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液将所述步骤B得到的细胞液的浓度调整为0.25mmol/L，将加入所述过氧化氢溶液后的细胞液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱培养24h；然后加入所述步骤A中的所述多糖溶液，得到若干份浓度在0～200μg/mL之间且浓度不同的试液，将所述试液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱分别培养30min和5min，培养30min后的试液用于最终检测羟基自由基(OH·)的浓度，培养5min后的试液用于最终检测超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度，由此就得到了用于检测海洋多糖抗氧化作用的所述待测试液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤A和所述步骤B同时进行，或所述步骤B在所述步骤A之前进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤A中用DMEM培养基或蒸馏水配制所述多糖溶液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤B包括使用DMEM培养基调整RAW264.7细胞密度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤B包括将调整过细胞密度的所述RAW264.7细胞置于37℃下进行培养24h。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述步骤102在常温条件下进行。
7.一种制备用于检测海洋多糖抗氧化作用试液的方法，其特征在于，其包括如下步骤：
步骤A，取多糖样品配制成多糖溶液；
步骤B，取RAW264.7细胞，并调整细胞密度至105～106个/mL；
步骤C，取所述步骤B得到的细胞液，采用0.25mmol/L的过氧化氢(H2O2)溶液将所述步骤B得到的细胞液的浓度调整为0.25mmol/L，将加入所述过氧化氢溶液后的细胞液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱培养24h；然后加入所述步骤A中的所述多糖溶液，得到若干份浓度在0～200μg/mL之间且浓度不同的试液，将所述试液置于37℃、CO2浓度5％的二氧化碳培养箱分别培养30min和5min，培养30min后的试液用于最终检测羟基自由基(OH·)的浓度，培养5min后的试液用于最终检测超氧阴离子自由基(O2 -·)的浓度，由此就得到了所述用于检测海洋多糖抗氧化作用试液。
8.一种用于检测海洋多糖抗氧化作用的试液，其特征在于，其用如权利要求7所述的方法制备。
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