CN106148343A - 驴的miRNA序列、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,公开了一种驴的miRNA序列、制备方法及其应用。该miRNA序列为SEQ ID NO:1所示的序列,本发明中的miRNA序列通过特异性结合到mRNA的相应部位,影响相应mRNA的转录作用,从而影响ACADVL基因的表达。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种驴的miRNA序列、制备方法及其应用。
背景技术
微小RNA(MicroRNAs,简称miRNA)是一组不编码蛋白质的短序列单链RNA,长约22nt。miRNA基因主要单个或成簇地位于基因组的非编码区内。目前人们已经发现的miRNA约为数千个,大部分功能未知。据目前的研究显示,miRNA通过不完全碱基互补的方式与mRNA相应的区域结合,从而抑制蛋白质的翻译;在某些植物中,其还可以降解mRNA。通常一个基因可以被多个miRNA所调节,同时一个miRNA也可以调节多个mRNA。
miRNA表达具有高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA参与了几乎所有的生命活动,并起着重要作用,在动物中,包括:细胞发育、造血、脂肪代谢、器官生成、凋亡、细胞增殖与分化及肿瘤的发生。此外,在某些病毒中也发现有miRNA表达。
在动物细胞中,转录形成的miRNA的前体首先折叠成茎环结构,然后在DCL1的作用下剪切形成成熟的miRNA。在不同的动物组织、器官和不同的发育时期,miRNA的表达谱是不同的,对miRNA表达谱的研究对miRNA生物功能的研究起到巨大的推动作用。
尽管目前已经在生物体中发现了一些miRNA,然而这些miRNA仅占生物体存在的miRNA中相当少的一部分,并且研究人员对于这些miRNA的功能还了解很少。
综上所述,本领域迫切需要提供一种新型miRNA,以研究miRNA对生物体的调节作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种驴的miRNA序列,这种miRNA能够特异性结合到mRNA的相应部位,影响相应mRNA的转录作用,从而影响相应基因的表达。
为解决上述技术问题,本发明的实施方式提供了一种驴的miRNA序列,该miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
本发明的实施方式还提供了一种制备上述驴miRNA序列的方法,该方法包含以下步骤:1)取驴各个部位的若干离体组织分别放入若干个容器中,并将温度调节至:-60~-100℃;形成若干个样品组织1;2)取步骤1中样品组织1,在液氮环境中研磨,放置于若干个容器中;并加入1~3ml的总RNA抽提试剂,混合均匀后,调节温度至30~40℃孵育5~15min;调节温度至2~6℃并离心分离5~15min,取上清液加氯仿混合均匀后静置,形成若干个样品组织2;3)调节步骤2中样品组织2的温度至2~6℃,离心分离10~20min,并加入异丙醇,放置15~20min;形成若干个样品组织3;4)调节步骤3中样品组织3的温度至2~6℃,离心分离5~15min后去除上清液并洗涤沉淀;形成若干个样品组织4;5)调步骤4中样品组织4的温度至2~6℃,离心分离1~5min,室温放置,并加入15~50ul无菌无酶水,混合均匀;形成若干个样品组织5;6)取适量的步骤5中样品组织5构建Micro RNA文库;并通过测序平台测序,将测序得到的序列进行转化、处理后,即得若干个待分析纯净序列数据;7)将步骤6中待分析纯净序列数据与若干个核苷酸序列数据库进行比对,去除重复序列和干扰片段;即得通过比对的miRNA序列;8)将步骤7中通过比对的miRNA序列与数据库中的miRNA 前体进行比对筛选;即得未通过比对的miRNA序列;9)将步骤8中未通过比对的miRNA序列与已知的驴基因组序列进行比对,筛选得到若干个miRNA序列;10)对步骤9中的miRNA序列进行靶基因预测;即得SEQ ID NO:1所示的序列。
本发明的实施方式还提供了一种将驴的miRNA序列用于制备抑制目的基因表达的组合物。
本发明实施方式相对于现有技术而言,通过特异性结合到mRNA的相应部位,影响相应mRNA的转录作用,从而影响ACADVL基因的表达。
进一步地,步骤1中取驴的心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓以及肌肉的离体组织。
进一步地,步骤2中调节温度至4℃,离心分离器的转速为:12000r/分钟,离心时间:10分钟。
进一步地,步骤2中的总RNA抽提试剂为Trizol试剂,每加入1ml的Trizol试剂相应加入0.2ml的氯仿,涡旋混匀15秒静置。
进一步地,步骤4中用75%乙醇进行洗涤沉淀,其中,每使用1ml Trizol试剂至少使用1ml 75%的乙醇。
进一步地,步骤5中调节步骤4中样品组织4的温度至2~4℃,离心分离2~4min,室温放置2~3min。
进一步地,步骤6中的各个样品组织5等量混合后RNA分子完整数大于7、浓度不小于100ng/ul、总量大于10ug。
进一步地,步骤6中的测序平台为Hiseq 2000测序平台。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明的各实 施方式进行详细的阐述。然而,本领域的普通技术人员可以理解,在本发明各实施方式中,为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是,即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改,也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种驴的miRNA序列,该miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
在本实施方式中,制备该miRNA序列的详细步骤如下:
1.样品采集
我们采取了一头驴的8个组织样:心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓、肌肉。将所取的组织放入无核糖核酸酶(RNase)的Eppendorf管中,立即投入液氮中,带回实验室后转移保存在-80℃冰箱,用于提取Total RNA与后续分析。
2.Total RNA的提取与质量评估
1)在经过液氮预冷的研钵里加入100mg组织样品,同时加入少许液氮,并迅速将样品研磨成粉末,然后转移至1.5mL的离心管;
2)加入1ml Trizol(一种新型总RNA抽提试剂,可以直接从细胞或组织中提取总RNA)并混匀做匀浆处理,为了让核酸蛋白质复合物彻底分离,室温孵育10min;
3)4摄氏度12000r/分钟离心10分钟,取上清;
4)每加入1ml Trizol相应加入0.2ml氯仿,涡旋混匀15秒,室温静置3分钟;
5)调节温度至4摄氏度,离心,调节离心的转速:12000r/分钟,离心15分钟分层后,(由于RNA主要集中在水层,取上层无色水相)并转移到新管中;
6)在水相中加入等体积的异丙醇,混匀,室温放置15-20分钟;
7)调节温度至4摄氏度,离心,调节离心的转速:12000r/分钟,离心10分钟,去除上清液;
8)加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀,每使用1ml Trizol使用1ml75%乙醇;
9)调节温度至4摄氏度,离心,调节离心的转速:12000r/分钟,离心3分钟,倒出液体,剩余少量液体,短暂离心,吸出液体。室温放置2-3分钟,加入15-50ul无菌无酶水,混匀,溶解RNA;
10)用1%的琼脂糖凝胶电泳,检验总RNA的完整性。
具体步骤如下:取5μL总RNA与上样缓冲液(Loading Buffer)充分混匀后用1%的琼脂糖凝胶电泳在140V恒压电泳进行检测,高压快速电泳,在较短的时间内(20分钟切断电源)使RNA电泳完毕,防止RNA降解,由此来检验总RNA的完整性。结果显示,28S和18S两条亮带比较清晰,5s条带非常模糊,说明提取的样品RNA降解率较低,完整性较好,质量也较好。
利用紫外光分光光度仪分别测定样品在260nm和280nm的光密度及RNA的纯度和浓度,各样品测定结果如表1所示,均符合相关标准(纯度检测标准为,如果OD值260/280在1.8-2.0之间,260/230的值大于2.0,则说明没有DNA和蛋白的污染)。
表1:
其中,OD260/OD280、OD260/OD230代表RNA质检参数,260、280、320、230nm下的吸光度分别代表了核酸、蛋白质、盐浓度和有机溶剂的值。
3.Micro RNA文库制备与测序
每个组织样品取3μg total RNA等量混合后构建Micro RNA(miRNA)文库,动物组织样品构建MiRNA文库之前,所有样品等量混合后的RNA分子完整数(RNA integritynumber)要保证至少为7,浓度≥100ng/ul,且总量大于10ug,满足所有要求之后才可以构建文库。
值得注意的,在本实施方式中,构建Micro RNA文库的步骤如下:首先利用miRNA3′端羟基的特点加3′端接头,终止反应后,再加5′端接头,使用反转录随机引物与反转录酶合成cDNA第一链,然后用引物做12个PCR扩增循环,电泳之后切胶回收PCR产物并纯化,利用Agilent2100精确检测文库浓度和质量。检测合格后,在cBot上生成簇(Cluster),通过Hiseq2000测序平台得到50bp的单端测序reads。
4.测序数据的质量控制
测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据,称之为raw data或raw reads。随后对这些raw reads进行质量控制,得到纯净序列,称为clean reads。利用IIIumina Hiseq 2000对上述驴的miRNA文 库测序,一共得到了45,947,065条raw reads。对原始序列进行去除低质量reads,5’接头及3’接头等过滤,得到44,033,167条cleanreads。clean reads所占的比例分别为95.83%,反映了本实验的测序质量较高。
对miRNA数据库样品的纯净序列进行了长度统计。结果显示,测序所得序列长度主要集中在21-23nt左右,占纯净序列总量90%以上,符合Dicer酶切割产物的长度。
5.参考序列比对
通过将上述实验样品中的clean reads与miRNA、Genbank、Rfam等数据库比对,去除样品中的重复序列、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA及mRNA外显子内含子等干扰片段。将得到的miRNA与miRBase19.0中的miRNA前体进行了比对,能够比对上的序列有20,203,532。
6.各样品中新miRNA预测统计
值得注意的是,在本实施方式中,并非所有的片段都能比对到数据库中,有一些片段,在数据库中没有记录,同时又具有一定的结构功能,这样的miRNA片段称之为新的miRNA。应用mireap程序,在已知家驴基因组的辅助下,从测序所得的序列中预测miRNA,筛选出新的miRNA。我们一共鉴定出了133个新型的miRNA。
7.miRNA靶基因预测
为了获取这些miRNA的生物学功能,对所获得的新的miRNA进行了靶基因预测。应用软件miranda程序,以驴基因组为目标序列进行靶基因预测。得到其中一个miRNA序列即为SEQ ID NO:1所示的序列,将其命名为序列eas-m0041-3p。
本发明的第二实施方式涉及一种驴的miRNA序列具有抑制目的基因表达的功能,在本实施方式中,该目的基因为ACADVL,具体实验步骤如下:
1.合成eas-m0041-3p的模拟物(miRNA mimics)
成熟的eas-m0041-3p模拟物(miRNA mimics)可以自己合成也可以从市 面上购买获取。使用前用灭菌的RNase-free H2O或者灭菌的ddH2O,配制成20μM溶液。
2.转染
1)细胞培养:取家驴的耳尖皮肤组织,清洗消毒后,用眼科剪剪成1mm3左右的小块,在卡氏瓶中贴壁培养。当贴壁细胞铺满瓶子的底部时,用胰酶消化法传代培养;
2)转染前一天,接种适当数量的细胞至24孔细胞培养板中,每孔中加入不含抗生素的培养基,使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样,因此,接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。
值得注意的是:转染时,细胞密度是影响转染效率的关键因素之一,细胞生长过度会削弱细胞活力,从而降低细胞的转染效率。
3)在24孔板中,设置两组对照。一组用于转染,另一组不转染。每组各有6个平行对照;
4)稀释miRNA mimics:
a.用50μl不含血清培养基Ⅰ(v2)稀释25pmol miRNA mimics(加入细胞中的RNA总浓度为50nM),轻轻混匀,室温孵育5min;
b.稀释lipo2000:用50μl不含血清培养基Ⅰ(v2)稀释1μl lipo2000,轻轻混匀并室温孵育5min;
c.将a与b轻轻混匀,室温孵育20min(溶液可能会有浑浊,但不会影响转染);
5)将miRNA mimics与lipo2000的混合液加入含有细胞以及培养液(v1)(即上述步骤2)中的培养基)的培养孔中,轻轻混匀;
6)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24~96h。培养4~6h后,可以将孔里含有mimics-lipo2000混合液的培养基移去,更换新鲜培养基。
3.定量
1)引物设计
选取GAPDH用作相对定量PCR的看家基因。利用Primer3.0设计ACADVL基因的特异性引物。
2)总RNA的提取
按照RNAprep pure微量样品总RNA提取试剂盒说明书进行操作。吸取2μL总RNA利用酶标仪检测质量和浓度。
3)反转录合成cDNA第一链
取提取的总RNA,在PCR管中配制cDNA第一条链合成反应混合液,具体反应体系如表2所示。
表2:
轻轻混匀,调节温度至37℃,反转录反应15min;再次调节温度至85℃,反转录酶失活反应5s;产物在-20℃保存备用。
4)Real-time PCR体系的建立
按照表3中所示组分配制PCR反应液,同时配制阴性对照。每个样品做3个重复:
表3:
成分 | 加样量(μL) |
SYBR Premix Ex TaqTM(2×) | 10μl |
PCR Forward Primer(10μM) | 0.4μl |
PCR Reverse Primer(10μM) | 0.4μl |
cDNA模版 | 1.0μl |
ddH20(灭菌双蒸水) | 8.2μl |
总计 | 20μl |
按照如表4中所示的反应条件,采用三步法PCR扩增程序:
表4:
上面PCR运行结束后,立即运行如下程序:94℃30s,55℃30s至95℃30s连续扫描,以0.5℃作为一个梯度,扫描0.06s,绘制熔解曲线。各基因熔解曲线均只有单一的尖峰,表明扩增产物单一,无非特异性扩增干扰。
5)结果与分析
实时荧光定量RT-PCR获取基因转染前后达到荧光阈值所对应的Ct值,以GAPDH为内参基因,2△Ct计算出ACADVL基因转染前后的相对表达量。结果如表5所示:
表5:
序号 | 转染 | 不转染 |
1 | 0.006 | 0.03 |
2 | 0.007 | 0.032 |
3 | 0.006 | 0.044 |
4 | 0.0043 | 0.041 |
5 | 0.004 | 0.051 |
6 | 0.0052 | 0.063 |
结果表明,转染组与对照组相比,转染组的ACADVL的表达量有显著的下降。说明eas-m0041-3p能够抑制ACADVL的表达。
本领域的普通技术人员可以理解,上述各实施方式是实现本发明的具体实施例,而在实际应用中,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种驴的miRNA序列,其特征在于,所述miRNA序列的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于,包含以下步骤:
1)取驴各个部位的若干离体组织分别放入若干个容器中,并将温度调节至:-60~-100℃;形成若干个样品组织1;
2)取步骤1中所述的样品组织1,在液氮环境中研磨,放置于若干个容器中;并加入1~3ml的总RNA抽提试剂,混合均匀后,调节温度至30~40℃孵育5~15min;调节温度至2~6℃并离心分离5~15min,取上清液加氯仿混合均匀后静置,形成若干个样品组织2;
3)调节步骤2中所述的样品组织2的温度至2~6℃,离心分离10~20min,并加入异丙醇,放置15~20min;形成若干个样品组织3;
4)调节步骤3中所述的样品组织3的温度至2~6℃,离心分离5~15min后去除上清液并洗涤沉淀;形成若干个样品组织4;
5)调节步骤4中所述的样品组织4的温度至2~6℃,离心分离1~5min,室温放置,并加入15~50ul无菌无酶水,混合均匀;形成若干个样品组织5;
6)取适量的步骤5中所述的若干个样品组织5等量混合后构建Micro RNA文库;并通过测序平台测序,将测序得到的序列进行转化、处理后,即得若干个待分析纯净序列数据;
7)将步骤6中所述的待分析纯净序列数据与若干个核苷酸序列数据库进行比对,去除重复序列和干扰片段;即得通过比对的miRNA序列;
8)将步骤7中所述的通过比对的miRNA序列与数据库中的miRNA前体进行比对筛选;即得未通过比对的miRNA序列;
9)将步骤8中所述的未通过比对的miRNA序列与已知的驴基因组序列进行比对,筛选得到若干个新型miRNA序列;
10)对步骤9中所述的新型miRNA序列进行靶基因预测;即得SEQ ID NO:1所示的序列。
3.根据权利要求2所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于,所述步骤1中取驴的心、肝、脾、肺、肾、脑、骨髓以及肌肉的离体组织。
4.根据权利要求2所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于,所述步骤2中调节温度至4℃,离心分离器的转速为:12000r/分钟,离心时间:10分钟。
5.根据权利要求2所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于;所述步骤2中的总RNA抽提试剂为Trizol试剂,每加入1ml的Trizol试剂相应加入0.2ml的氯仿,涡旋混匀15秒静置。
6.根据权利要求5所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于;所述步骤4中用75%乙醇进行洗涤沉淀,其中,每使用1ml Trizol试剂至少使用1ml 75%的乙醇。
7.根据权利要求2所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于;所述步骤5中调节步骤4中所述的样品组织4的温度至2~4℃,离心分离2~4min,室温放置2~3min。
8.根据权利要求2所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于;所述步骤6中的各个样品组织5等量混合后RNA分子完整数大于7、浓度不小于100ng/ul、总量大于10ug。
9.根据权利要求2所述的驴的miRNA序列的制备方法,其特征在于;所述步骤6中的测序平台为Hiseq 2000测序平台。
10.根据权利要求1至9任一项权利要求所述的驴的miRNA序列的应用,其特征在于,将所述驴的miRNA序列用于制备抑制目的基因表达的组合物。
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Granted publication date: 20181002 Termination date: 20190615 |