CN1061372C - 含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜及其制法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，特别涉及含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜及其制法和用途。膜是由固定化氧化酶的高分子膜基质和憎水的纳米金颗粒组成，憎水金颗粒的粒径为1-100nm。用反胶束法制备憎水纳米金颗粒，其是将氯金酸及还原剂反胶束溶液分别加入到相同体积，并配制好的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中，然后在搅拌下混合两种反胶束溶液；氧化酶功能复合敏感膜的制备是将上述溶液同氧化酶水溶液及高分子凝胶溶液搅拌混合，经交联处理，把凝胶溶液涂在固体载体上，干后，即形成本发明的膜。能使生物产品酶用量减少，性能提高。

Description

含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜及其制法和用途
本发明属于酶生物技术领域，特别是涉及含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜及其制法和用途。
利用葡萄糖氧化酶生物工程制造出的产品，广泛用于人体及工业中，例如：葡萄糖生物传感器对人的血糖、工业废水、发酵、饮料中糖份的测量，但是生物传感器发展至今，能进入实际使用的为数不多，主要因为酶等生物敏感物质固定化过程中，生物活性大大降低，故响应敏度与使用寿命一直是生物传感器研制中的大问题。美国A.L.Crumbliss.等人曾引入亲水的金颗粒到生物传感器中，证明了金颗粒的生物相容性，但他们用的是30纳米的亲水金颗粒，对酶电极的敏度没有帮助，这在《生物技术和生物工程》杂志，1992年，40卷，483-490页的文章“适用于作为电沉析法组装酶电极的一种生物相容固定介质-胶体金”已有报道(A.L.Crumbliss.S.C.Perine,J.Stonehuemer,KR.Tubergen,JunguoZhao,and R.W.Henkens Biotechnology and Bioengineering,Vol.40 Pp.483-490(1992))。我们曾引入憎水二氧化硅到酶电极中，改进了电极的敏度，《中国科学(B辑)》1995年7月第25卷，第27期，701-703页的文章“溶胶-凝胶法制备含纳米憎水二氧化硅颗粒葡萄糖酶电极”中有这方面的报道；另外，引入憎水二氧化硅到酶电极中还改进了电极的寿命，这在《生物传感器和生物电子器件)》1992年第七期503-507页的文章“用亚微米二氧化硅颗粒改进L-B膜的酶活性和寿命”(F.Q.Tang,J.R.Li,L.Zhang&L.Jiang,Biosensors&Bioelectronics&(1992)503-507)也有报导，但响应敏度还不理想，而且葡萄糖氧化酶用量相对较高，究其原因，还是因为做为工作电极的生物膜不理想。
本发明的目的在于将纳米憎水金颗粒引入氧化酶膜中，提供一种理想的、能够节约酶用量、用于改变生物器件质量的含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜及其制法和用途。
本发明的目的是通过下述技术方案实现的：
本发明的膜是由固定化葡萄糖氧化酶的高分子膜基质和憎水的纳米金颗粒组成；憎水金颗粒的粒径为1-100nm，最好为1-10nm；氧化酶是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、碳酸酐酶；高分子物质为醋酸纤维素，聚乙烯醇缩丁醛，聚氨脂，聚乙二醇。各种原料可以从市售得到。
含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法
A：采用反胶束法制备的憎水纳米金颗粒，具体制备方法如下：
①分别配制氯金酸及还原剂的水溶液，其摩尔浓度相同，且都依据憎水纳米金颗粒的大小所要求的RW值(RW为水对表面活性剂的摩尔比)及RE值(RE为电解质氯金酸或还原剂水溶液对表面活性剂的摩尔比)来确定，RW值为1-16,RE值为0.0002-0.5；
②．配制表面活性剂的非极性有机溶剂溶液，其重量摩尔浓度为50-300mmol/Kg溶剂；
③．制备氯金酸及还原剂的反胶束溶液：取氯金酸及还原剂的水溶液分别加入到相同体积的步骤②中配制的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中，氯金酸及还原剂的水溶液的用量依据憎水纳米金颗粒的大小所要求的RW值及RE值来确定；
④．制备憎水纳米金颗粒的反胶束溶液：室温下，按相同体积将步骤③中的两种反胶束溶液在搅拌下混合2～8小时，制备出所要求颗粒大小的憎水纳米金颗粒，憎水纳米金颗粒的粒径在1-100纳米，最好在1-10纳米。
其中还原剂包括柠檬酸、柠檬酸钠、硼氢化钠、乙醇、抗坏血酸、鞣酸、硫氰酸等；表面活性剂包括非离子表面活性剂，如TritonX系列、Span80；阴离子表面活性剂，如AOT；天然表面活性剂，如卵磷脂等；非极性有机溶剂包括正己烷、环己烷、氯仿等。
B：含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法按如下步骤进行：
a．将重量摩尔浓度为1×10-5_10-2 mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液0.02-5.0ml同每毫升浓度为50-10000个活力单位的氧化酶水溶液0.005-1.0ml混合；所用氧化酶为葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、碳酸酐酶等；
b．接着加入重量百分浓度为0.5-5％的高分子的凝胶溶液1-10ml，搅拌均匀；所用高分子物质包括醋酸纤维素，聚乙烯醇缩丁醛，聚氨脂，聚乙二醇等。
c．再加入重量百分浓度为1-10％的戊二醛0.01-0.5ml进行交联处理；
d．将凝胶溶液涂在固体载体上，室温下，挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层本发明的膜，即含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜。
本发明所制备的氧化酶功能复合敏感膜，可用于酶生物传感器，生物传感装置，生物分离膜，生物催化工程。
本发明所制备出的憎水纳米金颗粒生物膜，具有常规亲水纳米金颗粒生物膜不可比拟的优越性，从用本发明的膜做的生物传感器就可看出。
将用上述方法制得的憎水纳米金颗粒的葡萄糖氧化酶生物膜，涂在铂丝上制成的电极作为工作电极，Ag/AgCl电极或甘汞电极做为参比电极，组成葡萄糖氧化酶生物传感器。它的工作原理是：
H2O2扩散到铂电极被分解，放出电子，产生电流：
将葡萄糖氧化酶生物传感器的双电极置于PH值为6-7的磷酸盐缓冲液电池里，测其基质电流，然后依次加入不同浓度的葡萄糖水溶液，测其响应电流，对应于相应的葡萄糖浓度做出电极电流响应曲线。
由于此种生物传感器对葡萄糖具有特征的响应，因此它特别适用于人体中的血糖，工业废水，发酵，饮料中糖分的测量。
由于此种生物传感器含有粒径1-100纳米，特别是1-10纳米憎水金颗粒，所以它的电极电流响应比未引入憎水金颗粒的电极电流至少高出1-2个数量级。如图1所示：曲线a是含憎水金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电极电流响应曲线，而曲线b是不含憎水金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电极电流响应曲线。曲线a的电流响应值较曲线b的电流响应值提高了40倍。
由于纳米级的憎水金颗粒的引入，憎水金颗粒表面疏水链与葡萄糖氧化酶的疏水链作用，使葡萄糖氧化酶构象变得更加稳定，这种疏水作用的结果，也增加了葡萄糖氧化酶的灵敏度。同时，在与水混溶的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮里，它同高分子凝胶共价固定在电极的表面上，仍保持很高的酶活性。这种作用机制，已在《胶体和表面B：生物界面》杂志1996年第七期173-179页的文章“纳米颗粒对葡萄糖氧化酶的吸附性和活性的影响”(Colloids and Surfaces B:Biointerfaces7(1996)173-179)中有类似的报导。
含有粒径1-10nm憎水纳米金颗粒的葡萄糖传感器同时大大减少了葡萄糖氧化酶的用量，由于憎水金颗粒的电子传递催化作用，每1ml高分子凝胶中仅用几个至几十个单位的葡萄糖氧化酶，就可以获得几千甚至几万纳安/厘米2(nA/cm2)的响应电流。另外，含憎水金颗粒的葡萄糖传感器的稳定性也大大提高，实验连续测定100次，电极电流响应结果很重复。而未引入纳米憎水金颗粒的传感器仅能重复测定10次左右。
从上述结果就可看出，本发明的生物膜，特别适用于制造生物工程所用的产品，其效果具有突出的质变。
本发明的优点：
1．制备简单易行，不需化学后处理，易于推广应用。
2．由于纳米级的憎水金颗粒的引入，能使产品稳定性及寿命较未引入纳米憎水金颗粒的产品大大提高，所用酶量也比通常用量减少。
3．在有机溶剂，即使在有与水可混溶的有机溶剂里，仍可保证酶蛋白无损伤固定化。
附图说明：
图1--电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线
     横坐标---葡萄糖浓度(单位：mmol/L)
     纵坐标---响应电流(单位：nA/cm2)
     曲线a---含憎水纳米金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线
     曲线b---不含憎水金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线
图2--含憎水纳米金颗粒和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例1中电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线
     横坐标---葡萄糖浓度(单位：mmol/L)
     纵坐标---响应电流(单位：nA/cm2)
     曲线C---含憎水纳米金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线
图3--含憎水纳米金颗粒和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例2中电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线
     横坐标---葡萄糖浓度(单位：mmol/L)
     纵坐标---响应电流(单位：nA/cm2)
     曲线f---含憎水纳米金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线
图4--含憎水纳米金颗粒和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例2中电极响应电流对应于葡萄糖浓度关系曲线
     横坐标---葡萄糖浓度(单位：mmol/L)
     纵坐标---响应电流(单位：nA/cm2)
     曲线h---含憎水纳米金颗粒的葡萄糖传感器对葡萄糖浓度做的电流响应曲线
下面仅以利用本发明的膜所做的生物传感器，并结合附图对本发明的技术作进一步的描述。反胶束法制备憎水纳米金颗粒实施例：
                            实施例1
将阴离子表面活性剂AOT 100mmol溶解在1Kg环己烷里，氯金酸水溶液被表面活性剂增溶在非极性有机溶剂里形成反胶束，控制其RW值为2,8,12,RE值在0.001，同样将柠檬酸水溶液按同样的RE0.001和RW 2,8,12制备反胶束，在室温下，按相同体积混合两种反胶束，搅拌2小时，制备出憎水超细金颗粒。憎水金颗粒的粒径在6,8.5,10纳米。
                            实施例2
用反胶束法制备纳米金颗粒。将表面活性剂TritonX-45 200mmol溶解在1Kg环几烷里，氯金酸水溶液被表面活性剂增溶在非极性有机溶剂里形成反胶束，控制其RW值为1,4,8,12,RE值在0.0005，同样将柠檬酸钠水溶液按同样的RE0.0005和RW1,4,8,12制备反胶束，在室温下，按相同体积混合两种反胶束，搅拌5小时，制备出憎水超细金颗粒。憎水金颗粒的粒径在10,25,36,48纳米。
                            实施例3
将天然表面活性剂卵磷脂50mmol溶解在1Kg氯仿里，氯金酸水溶液被表面活性剂增溶在非极性有机溶剂里形成反胶束，控制其RW值为5,10,RE值在0.05，同样将乙醇水溶液按同样的RE0.05和RW 5,10制备反胶束，在室温下，按相同体积混合两种反胶束，搅拌8小时，制备出憎水超细金颗粒。憎水金颗粒的粒径在2-6纳米。含纳米金颗粒和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极的制法实施例：
                            实施例1.1
a：将实施例1中用AOT反胶束方法制得的超细金颗粒0.8ml，重量摩尔浓度为1×10-4mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升500个活力单位的葡萄糖氧化酶(GOD)水溶液0.05ml混合；
b．接着加入重量百分浓度为2％的聚乙烯醇缩丁醛(PVB)的乙醇凝胶溶液3ml，搅拌均匀；
c．然后再加入重量百分浓度为2％的戊二醛0.1ml进行交联处理；
d．然后将处理过的铂丝(直径d=1mm)浸入上述凝胶溶液中，10分钟后取出，室温下，挥发掉溶剂，使之在铂丝转换器的表面形成一层葡萄糖氧化酶膜。即制得含憎水纳米金颗粒的葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜的生物电极。
用Ag/Agcl电极做为参比电极，将双电极置于5ml PH6.86的磷酸盐缓冲液电池里，测其基质电流，然后依次加入2.8、5.6、11.1、16.7、22.2、27.8、33.3mmol/l浓度β-D葡萄糖水溶液，测其响应电流(Y轴)，对应于相应的葡萄糖浓度(X轴)做出响应曲线C。图2，葡萄糖浓度为33mmol/l，电极响应电流可达16875hA/cm2。
                          实施例2.2
按实施例1.1中的相同步骤，将实施例2中用TritonX-45反胶束方法制得的超细金颗粒0.8ml，重量摩尔浓度为1×10-5mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升5000个活力单位的葡萄糖氧化酶(GOD)0.05ml混合后再简单的同聚乙烯醇缩丁醛(PVB)乙醇凝胶4ml混合，以浸涂电极的方法，让GOD吸附、自组装，并用PVB凝胶共同固定在铂电极上。做出响应曲线f。图3。
                           实施例3.3
按实施例1.1中的相同步骤，将实施例3中用卵磷脂反胶束方法制得的超细金颗粒0.8ml，重量摩尔浓度为1×10-2mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升600个活力单位的葡萄糖氧化酶(GOD)0.1ml混合后再简单的同PVB乙醇凝胶4ml混合，以浸涂电极的方法，让GOD吸附、自组装，并用PVB凝胶共同固定在铂电极上。将制得酶电极作为工作电极，进行酶电极响应电流测量。图4，葡萄糖浓度为33mmol/l，电极响应电流可达34000nA/cm2。
                              实施例4.4
按实施例1.1中的相同步骤，将实施例1中用AOT反胶束方法制得的超细金颗粒0.1ml，重量摩尔浓度为1×10-4M的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升50个活力单位的乳酸氧化酶(LOP)0.02ml混合，以浸涂电极的方法，让LOD吸附、自组装，共同固定在铂电极上。将制得酶电极作为工作电极，Ag/AgCl电极做为参比电极。进行酶电极响应电流测量。乳酸锂盐浓度为5mmol/l，电极响应电流可达2000hA/cm2。
                          实施例5.5
按实施例1中的相同步骤，将实施例2中用TritonX-45反胶束方法制得的超细金颗粒1.6ml，重量摩尔浓度为1×10-5mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升1000个活力单位的GOD0.08ml混合后再简单的同醋酸纤维素5ml凝胶混合，以浸涂电极的方法，让GOD吸附、自组装，共同固定在铂电极上。将制得酶电极作为工作电极，进行酶电极响应电流测量。葡萄糖浓度为33mmol/l，电极响应电流可达6000nA/cm2。
                          实施例6.6
按实施例1.1中的相同步骤，将实施例2中用TritonX-45反胶束方法制得的超细金颗粒4ml，重量摩尔浓度为1×10-2mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升2000个活力单位的GOD0.2ml混合后再简单的同醋酸纤维素凝胶10ml混合，以浸涂电极的方法，让GOD吸附、自组装，共同固定在铂电极上。将制得酶电极作为工作电极，进行酶电极响应电流测量。在33mmol/l葡萄糖浓度时的响应电流为17100hA/cm2。
                            实施例7.7
按实施例1.1中的相同步骤，将实施例1中用AOT反胶束方法制得的超细金颗粒4ml，重量摩尔浓度为1×10-5mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升5000个活力单位的GOD0.1ml混合后，再简单的同醋酸纤维素凝胶10ml混合，以浸涂电极的方法，让GOD吸附、自组装，共同固定在铂电极上。将制得酶电极作为工作电极，进行酶电极响应电流测量。在33mmol/l葡萄糖浓度时的响应电流为43000nA/cm2。
                             实施例8.8
按实施例1.1中的相同步骤，将实施例1中用AOT反胶束方法制得的超细金颗粒5ml，重量摩尔浓度为1×10-5mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液，同浓度为每毫升10000个活力单位的GOD0.005ml混合后，再简单的同PVB乙醇凝胶2ml混合，以浸涂电极的方法，让GOD吸附、自组装，共同固定在铂电极上。再将涂有含纳米金颗粒和葡萄糖氧化酶功能复合敏感膜生物电极浸入到重量百分浓度为1％的硅橡胶1ml中2秒，取出，晾干，即涂上一层0.5微米厚的保护膜。将制得酶电极作为工作电极，进行酶电极响应电流测量。在33mmol/l葡萄糖浓度时的响应电流为21000nA/cm2。

Claims (10)

1．一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜，其特征在于：膜是由固定化氧化酶的高分子膜基质和憎水的纳米金颗粒组成，憎水纳米金颗粒的粒径为1--100nm。
2．如权利要求1所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的憎水纳米金颗粒的粒径为1--10nm。
3．如权利要求1所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的氧化酶是葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、碳酸酐酶。
4．如权利要求1所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜，其特征在于所述的高分子物质为醋酸纤维素，聚乙烯醇缩丁醛，聚氨脂，聚乙二醇。
5．一种权利要求1所述的含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于：A：采用反胶束法来制备憎水纳米金颗粒，具体制备方法如下：
①分别配制氯金酸及还原剂的水溶液，其摩尔浓度相同，且都依据憎水纳米金颗粒的大小所要求的水对表面活性剂的摩尔比RW值及电解质氯金酸或还原剂水溶液对表面活性剂的摩尔比RE值来确定，RW值为1-16,RE值为0.0002-0.5；
②．配制表面活性剂的非极性有机溶剂溶液，其重量摩尔浓度为50-300mmol/Kg溶剂；
③．制备氯金酸及还原剂的反胶束溶液：取氯金酸及还原剂的水溶液分别加入到相同体积的步骤②中配制的表面活性剂的非极性有机溶剂溶液中；
④．制备憎水纳米金颗粒的反胶束溶液：室温下，按相同体积将步骤③中的两种反胶束溶液在搅拌下混合2～8小时，制备出所要求颗粒大小的憎水纳米金颗粒，憎水纳米金颗粒的粒径为1-100纳米；B：含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法：
a．将重量摩尔浓度为1×10-5-10-2mol/kg的憎水纳米金颗粒反胶束溶液0.02-5.0ml同每毫升浓度为50-10000个活力单位的氧化酶水溶液0.005-1.0ml混合；
b．接着加入重量百分浓度为0.5-5％的高分子的凝胶溶液1-10ml，搅拌均匀；
c．再加入重量百分浓度为1-10％的戊二醛0.01-0.5ml进行交联处理；
d．将凝胶溶液涂在固体载体上，室温下，挥发掉溶剂，即在固体载体表面形成一层膜。
6．如权利要求5所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的还原剂为柠檬酸、柠檬酸钠、硼氢化钠、乙醇、抗坏血酸、鞣酸、硫氰酸。
7．如权利要求5所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的表面活性剂为非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，天然表面活性剂。
8．如权利要求5所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的非极性有机溶剂为正己烷、环己烷、氯仿。
9．如权利要求5所述的一种含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的制法，其特征在于所述的憎水纳米金颗粒的粒径为1-10纳米。
10．一种权利要求1所述的含憎水纳米金颗粒的氧化酶功能复合敏感膜的用途，其特征在于用于酶生物传感器、生物传感装置、生物分离膜、生物催化工程。
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CN1180102A (zh) 1998-04-29

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