CN106119411A - 一种car‑t细胞病毒感染效率的检测方法 - Google Patents

一种car‑t细胞病毒感染效率的检测方法 Download PDF

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许国贞
刘振云
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Abstract

本发明公开了一种CAR‑T细胞病毒感染效率的检测方法，包括如下步骤：将病毒侵染CAR‑T细胞；待细胞稳定表达，抽提CAR‑T细胞的全基因组DNA；运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；数据处理：按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；其中感染效率公式：P(K)＝1‑P(0)；其中，P(0)＝e‑m；e为自然常数；m为MOI值，即感染复数。本发明可计算病毒的感染效率，计算方法简便，且精确度高，便于实际操作。

Description

一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法
技术领域
本发明涉及CAR-T细胞病毒感染效率技术领域，尤其涉及一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法。
背景技术
肿瘤的细胞治疗始于上世纪80年代。第一代细胞治疗技术属于采用非特异性的细胞治疗，主要方法包括LAK、NK、CIK等。第二代细胞治疗技术兴起于上世纪90年代，主要代表为DC-CIK，这种治疗技术属于诱导肿瘤特异性细胞治疗。第一代和第二代细胞治疗技术由于疗效有限等原因，在美欧等主要国家已几乎不再开展。第三代细胞治疗技术始于本世纪初，属于基因重组细胞治疗，主要有CAR-T、CAR-NK等。其中，最新的CAR-T技术不仅解决了T细胞的靶向性、杀伤性的问题，还解决了其体内有效增殖的难题。
在CAR-T细胞的培养流程中，病毒的侵染能力对细胞的治疗效果有着举足轻重的作用，目前如何有效对CAR-T细胞病毒感染效率进行检测，成为目前亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明提出了一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，可计算病毒的感染效率，计算方法简便，且精确度高，便于实际操作。
本发明提出的一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒侵染CAR-T细胞；
S2、待细胞稳定表达，抽提CAR-T细胞的全基因组DNA；
S3、运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；
S4、数据处理：
按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；
其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；
其中，P(0)＝e-m；
P(0)：未被感染细胞的百分率；
P(K)：被感染细胞的百分率；
e：自然常数；
m为MOI值，即感染复数。
优选地，m的计算公式为m＝病毒拷贝数：细胞数；
其中病毒拷贝数单位为copies/μg，细胞数单位为个/μg，2.5～3.5×105个细胞含有1ugDNA，1μg DNA中病毒的拷贝数通过荧光定量PCR技术检测获知。
优选地，3×105个细胞含有1ugDNA。
在S2中，通过普通PCR鉴定细胞是否稳定表达。
本发明中，通过荧光定量PCR技术检测整合到细胞基因组DNA中的病毒拷贝数，根据病毒拷贝数与细胞数的比值计算出该病毒的感染复数，由于病毒感染细胞是一种随机事件，遵循Poisson分布规律，由此可计算病毒的感染效率。计算方法简便，且精确度高，便于实际操作。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒侵染CAR-T细胞；
S2、待细胞稳定表达，抽提CAR-T细胞的全基因组DNA；
S3、运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；S4、数据处理：
按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；
其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；
其中，P(0)＝e-m；
P(0)：未被感染细胞的百分率；
P(K)：被感染细胞的百分率；
e为自然常数；
m为MOI值，即感染复数。
实施例2
一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒侵染CAR-T细胞；
S2、待细胞稳定表达，抽提CAR-T细胞的全基因组DNA；
S3、运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；S4、数据处理：
按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；
其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；
其中，P(0)＝e-m；
P(0)：未被感染细胞的百分率；
P(K)：被感染细胞的百分率；
e为自然常数；
m为MOI值，即感染复数。
m的计算公式为m＝病毒拷贝数：细胞数；
其中病毒拷贝数单位为copies/μg，细胞数单位为个/μg，3.5×105个细胞含有1ugDNA，1μg DNA中病毒的拷贝数通过荧光定量PCR技术检测获知。
实施例3
一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒侵染CAR-T细胞；
S2、待细胞稳定表达，抽提CAR-T细胞的全基因组DNA；
S3、运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；
S4、数据处理：
按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；
其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；
其中，P(0)＝e-m；
P(0)：未被感染细胞的百分率；
P(K)：被感染细胞的百分率；
e为自然常数；
m为MOI值，即感染复数。
m的计算公式为m＝病毒拷贝数：细胞数；
其中病毒拷贝数单位为copies/μg，细胞数单位为个/μg，2.5×105个细胞含有1ugDNA，1μg DNA中病毒的拷贝数通过荧光定量PCR技术检测获知。
实施例4
一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，包括如下步骤：
S1、将病毒侵染CAR-T细胞；
S2、待细胞稳定表达，抽提CAR-T细胞的全基因组DNA；
S3、运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；
S4、数据处理：
按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；
其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；
其中，P(0)＝e-m；
P(0)：未被感染细胞的百分率；
P(K)：被感染细胞的百分率；
e为自然常数；
m为MOI值，即感染复数。
m的计算公式为m＝病毒拷贝数：细胞数；
其中病毒拷贝数单位为copies/μg，细胞数单位为个/μg，3×105个细胞含有1ugDNA，1μg DNA中病毒的拷贝数通过荧光定量PCR技术检测获知。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将病毒侵染CAR-T细胞；
S2、待细胞稳定表达，抽提CAR-T细胞的全基因组DNA；
S3、运用荧光定量PCR技术检测整合到全基因组DNA中的病毒拷贝数；
S4、数据处理：
按Poisson分布规律，计算该病毒的感染效率；
其中感染效率公式：P(K)＝1-P(0)；
其中，P(0)＝e-m；
P(0)：未被感染细胞的百分率；
P(K)：被感染细胞的百分率；
e为自然常数；
m为MOI值，即感染复数。
2.根据权利要求1所述的CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，其特征在于，m的计算公式为m＝病毒拷贝数：细胞数；
其中病毒拷贝数单位为copies/μg，细胞数的单位为个/μg，2.5～3.5×105个细胞含有1ugDNA，1μg DNA中病毒的拷贝数通过荧光定量PCR技术检测获知。
3.根据权利要求2所述的CAR-T细胞病毒感染效率的检测方法，其特征在于，3×105个细胞含有1ugDNA。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019129048A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 双重荧光定量pcr测定car拷贝数的方法和试剂盒
CN111394316A (zh) * 2020-04-09 2020-07-10 济南宜明医疗科技有限公司 一种检测car-t基因拷贝数的标准物质的制备
CN113151593A (zh) * 2020-12-31 2021-07-23 肇庆大华农生物药品有限公司 一种测定难以观察组织细胞感染与否的病毒的含量的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104404002A (zh) * 2014-12-12 2015-03-11 江苏省农业科学院 用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104404002A (zh) * 2014-12-12 2015-03-11 江苏省农业科学院 用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李影等: "用荧光定量PCR方法检测转染细胞中外源基因的拷贝数", 《中山医科大学学报》 *
肖薇等: "荧光定量PCR法用于转染CHO细胞中人凝血因子Ⅶ基因拷贝数检测的研究", 《中国输血杂志》 *
马海燕等: "应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率", 《生命科学研究》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019129048A1 (zh) * 2017-12-28 2019-07-04 上海细胞治疗研究院 双重荧光定量pcr测定car拷贝数的方法和试剂盒
CN111394316A (zh) * 2020-04-09 2020-07-10 济南宜明医疗科技有限公司 一种检测car-t基因拷贝数的标准物质的制备
CN113151593A (zh) * 2020-12-31 2021-07-23 肇庆大华农生物药品有限公司 一种测定难以观察组织细胞感染与否的病毒的含量的方法

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