CN106119211B - 一种猪德尔塔冠状病毒毒株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒毒株（Porcine Deltacoronavirus），CCTCC NO：V201558。本发明获得一种猪德尔塔冠状病毒毒株，将对该病毒的病原学研究、流行病学调查、诊断防制及疫苗研究奠定重要基础。

Description

一种猪德尔塔冠状病毒毒株
技术领域
本发明属于微生物病毒领域，涉及病毒新毒种，具体涉及一种猪传染性德尔塔冠状病毒毒株及其生物学特性。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是一种新型冠状病毒，临床特征主要引起母猪和仔猪的急性水样腹泻。剖检可见肠壁变薄，肠绒毛脱落。2012年，PDCoV首次在香港猪粪便中检测到，在哺乳动物和鸟类上也检测到该病毒。2014年2月，美国首次检测到该病毒，其与香港的两株同源性达99％，同年3月在加拿大和加利福尼亚州的猪场粪便中检测到PDCoV的其他毒株。随后韩国从腹泻仔猪的粪便中也分离出了PDCoV株KUN14-04，它的同源性和美国株同源性99.6-99.8％。之后，美国艾亥俄州也分离出该病毒。据报道，南美猪场PDCoV患病率超过25％，在艾亥俄州的5个农场，PDCoV的阳性检测率高达92.9％，在胡慧对艾亥俄州的5个猪场调查中，PDCoV的阳性率达29％。而中国在香港猪粪便中发现过该病毒，之后对我国华东省地区猪场进行检测，发现腹泻样品PDCoV阳性率25.76％，说明我国猪群中存在PDCoV的感染。而且据报道，在对我国安徽、广西、河北、江苏地区病料的检测中发现，PDCoV在我国至少存在了11年。
在世界上养猪国家均有猪传染性胃肠炎(TGE)发生，猪流行性腹泻(PED)于70年代初首先发现于英国，随后许多国家均有该病的报道。新生仔猪感染TGEV死亡率高达100％，仔猪即使病愈也会生长受阻，甚至成为僵猪。猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻极易感染仔猪发病，引起较高的死亡率，是造成世界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病，这两种传染病已列入我国防控的重点疫病之中。更为主要的是，PDCoV的流行流行病学和病理剖检与PED、TGE极其相似，但是死亡率稍低于后两者，彼此没有共同的抗原性，不能交互免疫，PEDV、TGEV、PDCoV等的混合感染而引起的疾病是全球养猪业的一大问题，对养猪业造成很大的损失。目前对于PDCoV，没有有效的治疗措施和疫苗，因此分离与鉴定该病毒对此病的防制意义重大。
发明内容
本发明提供一种猪德尔塔冠状病毒毒株，分类命名：猪德尔塔冠状病毒，拉丁文学名：Porcine Deltacoronavirus，保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期：2015年12月24日，保藏编号：CCTCC NO：V201558。
本发明的下技术方案是：一种猪德尔塔冠状病毒毒株，(PorcineDeltacoronavirus)，CCTCC NO：V201558。
所述的猪德尔塔冠状病毒毒株具有以下特点：
(1)病毒的分离是在ST上和LLC-PK细胞上，在VERO细胞上不能分离出PDCoV；
(2)病毒对氯仿稍敏感，对甲醛、紫外线和酸碱比较敏感；
(3)所述病毒在LLC-PK细胞中的TCID50稳定在10-7.5，在ST细胞中的TCID50稳定在10-7.3。
本发明的有益效果在于：获得一种猪德尔塔冠状病毒毒株，对该病毒将对该病毒的病原学研究、流行病学调查、诊断防制及疫苗研究奠定重要基础。
附图说明
图1为猪Delta冠状病毒接种到LLC-PK上产生的细胞效应，其中A为模拟接种的LLC-PK细胞培养，B为PDCoV接种后的LLC-PK细胞培养；
图2为猪Delta冠状病毒cDNA扩增产物，其中M为DL2000Marker，1为空白对照，2为PDCoV病毒PCR产物。
具体实施方式
1.材料与方法
1.1病料来源
2015年11月11日，河南省某猪场(200头母猪)发生腹泻，母猪产后3天，母猪和仔猪均出现黄色水样性腹泻，仔猪被毛粗乱，食欲不佳，嗜睡，尾根部沾有粪便，腹泻严重的已出现***红肿。该场此次共生产仔猪5窝(58头)，死亡率31％(15/58)。解剖仔猪，发现肠绒毛脱落，肠壁变薄，肺实质性肉变，肾有针状出血点。
1.2细胞和菌种
猪睾丸细胞(ST)和猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK)购自中国兽监察所并由河南省动物性食品安全重点实验室传代保存。
1.3主要仪器与试剂
主要仪器：THERMO PCR仪，37℃5％CO2恒温培养箱(SANYO)，超净工作台；
主要试剂：DMEM培养基(GIBCOBR)；胎牛血清(Hyclone)；胰酶(SIGMA)；Taq DNA聚合酶及DL-2000DNA Marker购自TaKaRa公司，pH值7.6磷酸缓冲液(PBS)为实验室自配；青霉素、链霉素(GIBCOBR)。
1.4样品处理
刮取肠内容物，用生理盐水1:10稀释；粪便直接用生理盐水1:10稀释。4℃3000r/min离心30min，取上清液，0.22μm滤器过滤后，用于提RNA和细胞的分离与增殖后续实验。
1.5病毒在细胞上的分离和增殖
用含10％的灭活胎牛血清的DMEM培养液作为肾小管上皮细胞(LLC-PK)细胞的培养液。用含1％的灭活胎牛血清的DMEM以及胰酶(终浓度为1％)的培养液作为维持液。
当细胞生长1-2d后，细胞长满，用D-hanks冲洗两遍，加入胰酶消化，用细胞管将细胞吹打成单个分散的细胞，加入细胞培养液制成12孔板。约12h后，12孔板中细胞平铺至60％，可以接毒。用D-hanks快速冲洗细胞，将样品对应接种100μl/孔，37℃CO2恒温培养箱中吸附1.5h后，加入维持液。观察细胞病变，待病变至80％时，收获病毒，并记为F0代，放入-20℃，将毒反复冻融三次后进行下代接毒。连续盲传几代。
病毒的增殖：将LLC-PK细胞悬液加入T25的培养瓶中，细胞量大约1×105个/mL，于5％CO237℃恒温培养箱中培养至贴壁，弃上清，快速用D-Hanks冲洗两遍，接毒100μl，轻晃均后，37℃5％CO2恒温培养箱中吸附1.5h后，加入维持液。当病变达80％时，收获病毒，-80℃保存。
1.6病毒的鉴定
1.6.1病毒的理化性质取经LLC-PK细胞传代的病毒液F8代，用96孔板中致密单层的LLC-PK细胞分别对病毒进行有机溶剂(氯仿)、甲醛和紫外线照射的敏感试验、病毒的耐热性试验(56℃，30min)及耐酸性试验(pH 3.0，2h)，具体方法见文献。
1.6.2病毒的生物学特性分析
1.6.2.1TCID50测定病毒滴度用LLC-PK细胞悬液加入96孔细胞培养板，细胞量大约1×105个/mL，于5％CO2 37℃恒温培养箱中培养至贴壁，弃上清，用D-hanks冲洗两遍。用2％DMEM培养液将各代病毒连续10倍倍比稀释(10-1～10-10)，每个稀释度各做8个重复孔，分别接种于96孔细胞培养板，同时设不含病毒的阴性对照，100μl/孔，吸附1.5h后，再加入维持液(2％的DMEM及终浓度为1％的胰酶)，100μl/孔，逐日观察细胞病变并记录CPE的细胞孔数，按照Reed-Muench法计算TCID50。
1.6.2.2动物接种实验从某猪场挑选健康仔猪6只(仔猪未吃初乳)，并通过RT-PCR方法检测未感染PEDV和TGEV。将仔猪随机分为两组，设立实验组和对照组，根据TCID50结果，每头猪注射病毒量应为约105个/mL，实验组仔猪注射0.5mL/只，对照组注射生理盐水0.5mL/只，随后观察仔猪发病状态并做记录。
1.6.3RT-PCR的鉴定
1.6.3.1总RNA的提取将上述心、肝、脾、肺、肾和肠内容物研磨的组织液和接种细胞后增殖每代的病毒液提RNA。步骤按照QIAGEN试剂盒操作。具体步骤：吸取140μl的样品于560μl配好的Buffer AVL-carrier RNA中，漩涡震荡，瞬离，室温孵育10min，加入560μl的乙醇(96-100％)至样本中，混匀，瞬离；将上步混合液吸取630μl于QiAamp Mini columm(柱子)上，8000r/min离心1min，丢弃带废液的旧管，移至新的2ml的收集管中，重复此步骤。加入500μl Buffer AW1，8000r/min离心1min，丢弃废管，移至新管。加入500μl Buffer AW2，12000r/min离心3min，丢弃废管，移至新管。12000r/min空离1min，移至新EP管中，60μl的平衡酚Buffer AVE至膜上，室温1min，8000r/min。RNA的反转录也按QIAGEN试剂盒步骤操作。
1.6.3.2PDCoV N基因的扩增应用Primer Premier 5.0基因分析软件，参照Genbank中登录的Illinois121株PDCoV N基因序列设计一对引物，扩增PDCoV N基因部分片段541bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
PDCoV-F：CGCGTAATCGTGTGATCTATGT
PDCoV-R：CCGGCCTTTGAAGTGGTTAT
PCR产物扩增：20μl的体系，上下游引物各0.5μl(25μmol/l)，模板2μl，Taq酶10μl，ddH2O7μl，反应条件：95℃预变性5min，94℃45s，58℃退火40s，72℃50s，35个循环；72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
2.结果
2.2病毒的分离和增殖
将肠内容物处理后，将上清液分别接种已铺满80％的单层LLC-PK和ST细胞，从第3代开始出现细胞病变(CPE)，表现为圆缩、集聚、脱落继而死亡(如图B)，而空白对照组细胞形态正常(如图A)，细胞轮廓清晰，饱满。
2.3病毒对理化因子的敏感性
将从细胞上分离的第8代病毒，反复冻融三次后，经病毒倍比稀释，10-1-10-10，进行有机溶剂(氯仿)、甲醛和紫外线照射的敏感试验，病毒的耐热性试验(60℃，30min)及耐酸性试验(pH3.0，2h)，结果病毒活性有明显下降。表明该病毒对有机溶剂(氯仿)、甲醛、紫外线、酸、热敏感。
表1.PDCoV对各种理化因子的敏感性
2.4病毒的生物特性分析
将从LLC-PK和ST细胞上分离每代病毒，反复冻融三次，用TCID50测定病毒滴度。结果分离的每代病毒能够在ST和LLC-PK细胞上进行增殖，且在感染后第3代开始出现细胞病变，病变特征为细胞圆缩，聚集，脱落。说明病毒能在ST和LLC-PK上增殖，并产生细胞病变，细胞病变为细胞圆缩、聚集和脱落。
表2.PDCoV在细胞上分离每代的感染统计
Figure BDA0000898340560000051
“-”表示未检测。
2.5动物接种实验
从某猪场挑选健康仔猪6只(母猪未注射疫苗)，并通过RT-PCR方法检测未感染PEDV和TGEV。将仔猪随机分为两组，实验组3只，对照组3只，将从ST细胞上分离的F8代细胞毒口服接种实验组仔猪，每头仔猪接种病毒量为105个/mL，对照组接种等量的生理盐水。结果试验组仔猪在接种病毒12h后陆续出现食欲不振，精神萎靡，嗜睡，腹泻，体温降低，随后拉黄色水样粪便。对照组仔猪均表现正常。将实验组仔猪剖检发现：肠绒毛脱落，肠壁变薄，肺实质性肉变，肾有针状出血点。应用RT-PCR检测小肠内容物，结果为猪Delta冠状病毒阳性，对照组为阴性。
2.6PDCoV N基因PCR扩增结果
以制备的cDNA为模板，通过设计的特异性引物进行PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，样品可见1条541bp的特异性条带，与预测RNA的片段大小一致(如图2)，而阴性对照未扩增出条带，呈阴性。

Claims (1)

1.一株猪德尔塔冠状病毒毒株，其特征在于，所述猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus），CCTCC：V201558。
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