CN106116883A - 一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：通过热带假丝酵母对红薯渣和水果废弃物进行发酵制得发酵物Ⅰ；将鸡粪、牛粪、沼气池渣和小麦秸秆混合自然发酵制得发酵物Ⅱ；将发酵物Ⅰ与发酵物Ⅱ按适当比例混合，接入白地霉、巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌发酵制得发酵物Ⅲ；在发酵物Ⅲ中加入适量的含根内球囊霉和摩西球囊霉两种菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染植物根段的混合物以及鱼粉、硫酸锌和枯草芽孢杆菌HS5B5菌液，混匀即制得牡丹灌根用复合微生物菌肥。本发明根据牡丹生长营养和环境需求，以农业副产物为原料，制备的菌肥能为牡丹根部提供保护，抑制病原微生物，为牡丹生长提供全面营养，促进生长，延长花期。

Description

一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法

技术领域

本发明涉及微生物菌肥制备方法领域，具体涉及一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法。

背景技术

牡丹是我国一种著名的观赏类的花卉，其花朵硕大，雍容华贵，深受人们的喜爱。牡丹生长在中性或微碱性土壤中，不耐酸，不耐黏重土壤。牡丹喜肥，尤其是氮磷钾等元素较为齐全的肥料，目前常用的肥料为无机的复合肥或畜禽粪便等有机肥。牡丹为肉质根，施用无机的复合肥必须施在距主根较远的地方，如果施肥距主根太近，容易引起牡丹根部失水，进而影响矿质元素的吸收，长期使用无机复合肥容易造成土壤的板结和地下水资源的污染；施用有机肥必须经过沤制腐熟，未经腐熟的有机肥会发酵释放出有机酸，进而引起牡丹根的腐烂。另外，牡丹在生长过程中，容易受到不良环境条件的影响和病原微生物的侵染，牡丹的叶、枝条和根茎部均可成为病原微生物危害的部位，目前采用的解决办法通常是施加化学农药或剪除病害枝叶等，但是长时间大量施用化学农药易使病原微生物产生抗药性，同时造成环境污染和生态平衡破坏。牡丹作为观赏花卉，施用化学农药还会威胁游客的健康。

随着农业的发展，其副产物及废弃物也越来越越多，它们大量堆积发酵，对环境造成严重污染，释放出的腐臭气味和有害物质对人们的生活造成不良影响，如果能作为底物，用来生产生物肥料也是一种好的解决方法。

本发明中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HS5B5，2012年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.6088(见申请号为201410163640.4的发明专利申请说明书)。枯草芽孢杆菌HS5B5通过生物拮抗作用对牡丹枝孢霉为病原真菌的牡丹褐斑病有抑制效果，对其他常见真菌病害也有一定抑制效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，通过该方法制备的复合微生物菌肥不仅可以为牡丹生长提供各种营养成分，而且能够抑制牡丹病原微生物的生长，为牡丹根部提供微生物保护。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取热带假丝酵母进行活化，培养至对数生长期，得到含热带假丝酵母的混合物A；按质量比1：4取红薯渣和水果废弃物，粉碎至1.5cm以下，以红薯渣和水果废弃物总质量为基准，加入1％的尿素，搅拌均匀得到混合物B；将混合物A接种到混合物B中，接种量为混合物B质量的1％，室温搅拌发酵4-5天，制得发酵物Ⅰ；

步骤二、按质量比1：1：2-3：2-3取鸡粪、牛粪、沼气池渣和粉碎至1cm以下的小麦秸秆，混合均匀得到混合物C，以混合物C的质量为基准，加入5％的生石灰，暴露于空气中，自然放置3-5天，制得发酵物Ⅱ；

步骤三、将步骤二制得的发酵物Ⅱ加入到步骤一制得的发酵物Ⅰ中，其中发酵物Ⅱ与发酵物Ⅰ质量比为3：1，混匀后得到混合物D；在混合物D中接种处于对数生长期的白地霉、巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，且各菌株的接种量均为混合物D质量的1％，于30℃条件下搅拌发酵4-6天，制得发酵物Ⅲ；

步骤四、以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁根内球囊霉，接种量为3％-5％，当根内球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有根内球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E1；以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁摩西球囊霉，接种量为3％-5％，当摩西球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E2；将混合物E1和混合物E2按质量比1：1混合均匀获得混合物E；

步骤五、按质量比100：90：2：1取发酵物Ⅲ、混合物E、鱼粉和硫酸锌，将混合物E、鱼粉和硫酸锌加入到发酵物Ⅲ中，混匀后制得半固体状的混合物F；

步骤六、取枯草芽孢杆菌HS5B5，在种子培养基中活化，活化后转入发酵培养基中发酵，当枯草芽孢杆菌HS5B5生长至稳定期时，得到含有枯草芽孢杆菌HS5B5的混合物G；

步骤七、将步骤五制得的混合物F与步骤六制得的混合物G按质量比3-5：1混合，搅拌均匀即制得牡丹灌根用复合微生物菌肥。

进一步地，步骤一所述的水果废弃物为苹果落果、苹果腐果、苹果鲜渣、菠萝渣中的任意一种或任意混合物。

进一步地，步骤一所述的水果废弃物为苹果鲜渣和苹果落果的混合物，且苹果鲜渣和苹果落果的质量比为1：3。

进一步地，步骤一所述红薯渣和水果废弃物粉碎至0.8cm以下。

进一步地，步骤二所述鸡粪、牛粪、沼气池渣和小麦秸秆的质量比为1：1：2：3。

进一步地，步骤四扩繁根内球囊霉和摩西球囊霉所用的扩繁基质由河沙和土按质量比1：1混合后灭菌制得。

进一步地，步骤六所述的种子培养基为营养肉汤培养基。

进一步地，步骤六所述的枯草芽孢杆菌HS5B5的活化温度为30℃，活化时长为11小时。

进一步地，步骤六所述的发酵培养基以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄·2H₂O 1.0g，水1000ml，调节pH至7.0。

进一步地，步骤六所述的枯草芽孢杆菌HS5B5在发酵培养基中发酵的条件为：30℃通气发酵25小时。

有益效果：

本发明中的各种原料和微生物在相关工艺的处理下，使所制备出的牡丹灌根用复合微生物菌肥中的各种成分相互协同，最终达到促进牡丹生长、延长花期、防治牡丹病害的目的；

通过本发明制备的牡丹灌根用复合微生物菌肥经灌根进入土壤，菌肥中的各种微生物与土壤微生物之间形成微妙的动态平衡，使菌肥中各种有机物在各微生物之间转化和利用，最终释放出牡丹可以直接吸收利用的营养物质到土壤中，进而被牡丹吸收利用。根内球囊霉和摩西球囊霉在土壤生长繁殖过程中，大部分菌丝在牡丹根际周围蔓延并与牡丹根系共生，增大了牡丹根系对营养物质的吸收面积，有利于牡丹对磷等矿质元素的吸收，同时根内球囊霉和摩西球囊霉与枯草芽孢杆菌HS5B5相互协同，共同抵御病原微生物对牡丹的侵袭；添加的硫酸锌，可以显著提高牡丹的自身抗逆性和多种病害的抵抗能力，加速叶绿素的形成，枝繁叶茂，促进牡丹的营养生长；

本发明所用原料红薯渣、苹果鲜渣、苹果落果、鸡粪、牛粪、沼气池渣、小麦秸秆均为廉价易得的农业副产物、废弃物或生活垃圾，经本发明提供的方法处理后，不仅可以缓解环境污染的压力，而且制得的菌肥能够满足牡丹对营养成分的需求，同时对改善土壤通透性、增强土壤肥力有良好的效果，还可以促进牡丹根系生长，延长花期，抑制牡丹病原微生物的生长，为牡丹根部提供微生物保护。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取热带假丝酵母在麦芽汁培养基(每1000ml水中加入麦芽膏粉130g，氯霉素0.1g；调节pH至6.0)中进行活化，培养至对数生长期，得到混合物A，混合物A中含有麦芽汁培养基与生长繁殖迅速的热带假丝酵母菌体及其代谢产物；生长呈对数增长的热带假丝酵母接入新培养基中，能够使热带假丝酵母更快的适应新的生长环境，缩短延迟期，从而缩短发酵时间；

按质量比1：4取红薯渣和水果废弃物，粉碎至1.5cm以下，以红薯渣和水果废弃物总质量为基准，加入1％的尿素，搅拌均匀得到混合物B；混合物B实质上是以红薯渣和水果废弃物为原料制备的一种可以用来繁殖热带假丝酵母菌体的培养基，不仅解决了农业废弃物(即红薯渣和水果废弃物)堆积腐败、污染环境的问题，缓解了环境压力，而且红薯渣和水果废弃物还为热带假丝酵母生长繁殖提供可利用的碳源、氮源、无机盐、水等各种营养成分，加入1％的尿素使碳氮比达到最佳状态，有利于热带假丝酵母菌体生长繁殖；红薯渣和水果废弃物粉碎至1.5cm以下，在搅拌发酵时，能够让热带假丝酵母与混合物B充分接触，有利于热带假丝酵母生长；

将混合物A接种到混合物B中，接种量为混合物B质量的1％，室温搅拌发酵4-5天，制得发酵物Ⅰ；采用所述接种量于室温条件下搅拌发酵，发酵4-5天后，热带假丝酵母将红薯渣和水果废弃物中的大部分大分子营养物质分解为容易利用的小分子化合物，在生长过程中会合成大量菌体蛋白，热带假丝酵母生长周期结束后，其菌体蛋白又可以被后续白地霉、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌以及土壤微生物利用；热带假丝酵母在生长繁殖过程中会产生大量水和二氧化碳，以及果渣中未被分解的大量的有机酸类物质，因此得到的发酵物Ⅰ是一种偏酸性的半固态的混合物；

步骤二、按质量比1：1：2-3：2-3取鸡粪、牛粪、沼气池渣和粉碎至1cm以下的小麦秸秆，混合均匀得到混合物C，鸡粪、牛粪和沼气池渣均可用作植物的有机肥，其本身含有大量的有机质，若三者分别单独使用，则会造成大量营养物质流失，利用率低，而且含有大量病原菌孢子和寄生虫卵，异味大，使用不当还容易引起烧苗现象；鸡粪、牛粪和沼气池渣中均含有大量不同种类的微生物，包括好氧微生物、厌氧微生物以及兼性厌氧型微生物，鸡粪、牛粪和沼气池渣三者混合，使混合物C中微生物种类和代谢产物更加丰富，有利于营养物质在各种微生物之间的转化、利用并释放到土壤中，有利于牡丹对各种营养成分的吸收和利用；在混合物C中加入适当比例粉碎至1cm以下的小麦秸秆，可以使混合物C保持一定的通气性，能够使土壤疏松透气，满足牡丹肉质根的生长需要，同时满足好氧微生物和兼性厌氧型微生物对氧气的需求；以混合物C的质量为基准，加入5％的生石灰，暴露于空气中，自然放置3-5天，制得发酵物Ⅱ，生石灰遇到鸡粪、牛粪和沼气池渣中的水，得到碱性的熟石灰，并伴随大量的热量形成高温，高温以及熟石灰的碱性不仅能杀死混合物C中的大部分病原菌和寄生虫卵，还能使小麦秸秆进一步分解、离析和降解，自然发酵3-5天后，混合物C中的大部分病原菌和寄生虫卵被杀死，各种原料之间的混合也更加均匀，原料中的大分子物质在微生物的作用下，转化为更多可以被牡丹直接吸收利用的营养物质；

步骤三、将步骤二制得的发酵物Ⅱ加入到步骤一制得的发酵物Ⅰ中，发酵物Ⅱ的碱性可以与发酵物Ⅰ的酸性中和，其中发酵物Ⅱ与发酵物Ⅰ质量比为3：1，使混匀后得到的混合物D的pH值适合后续微生物发酵的要求，最终得到的牡丹灌根用复合微生物菌肥不损伤牡丹的肉质根；在混合物D中接种处于对数生长期的白地霉、巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，且各菌株的接种量均为混合物D质量的1％，30℃搅拌发酵4-6天，制得发酵物Ⅲ；经过步骤二中生石灰的作用，小麦秸秆初步离析和降解后，其中的纤维素和木质素等大分子物质经过白地霉和巨大芽孢杆菌进一步分解，产生糊精、寡糖和单糖，可以为发酵菌株和土壤微生物利用；胶冻样芽孢杆菌在生长繁殖过程中可以释放出难溶性钾盐中的钾元素以及其它中微量元素，利于牡丹对这些元素的吸收利用，对延长牡丹花期有积极作用，胶冻样芽孢杆菌的代谢产物中的有机酸等物质可以被牡丹直接吸收利用，促进牡丹的生长；

步骤四、以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁根内球囊霉，接种量为3％-5％，当根内球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，此时菌根真菌已经大量侵染到植物根系，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有根内球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E1；以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁摩西球囊霉，接种量为3％-5％，当摩西球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，此时菌根真菌已经大量侵染到植物根系，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E2；将混合物E1和混合物E2按质量比1：1混合均匀获得混合物E；根内球囊霉和摩西球囊霉在土壤生长繁殖过程中，大部分菌丝在牡丹根际周围蔓延并与牡丹根系共生，增大了牡丹根系对营养物质的吸收面积，有利于牡丹对磷等矿质元素的吸收，同时根内球囊霉和摩西球囊霉与枯草芽孢杆菌HS5B5相互协同，共同抵御土壤中病原微生物对牡丹的侵袭；

步骤五、按质量比100：90：2：1取发酵物Ⅲ、混合物E、鱼粉和硫酸锌，将混合物E、鱼粉和硫酸锌加入到发酵物Ⅲ中，混匀后制得半固体状的混合物F；鱼粉中蛋白质含量比较高，降解后产生大量的小肽和氨基酸，牡丹吸收后可以增强牡丹的代谢功能，提高光合作用，延长花期，促进牡丹根系的生长，改善土壤微生态环境；硫酸锌可以显著提高牡丹的自身抗逆性和抵御多种病害的能力，加速叶绿素的形成，枝繁叶茂，促进牡丹的营养生长；

步骤六、取枯草芽孢杆菌HS5B5，在种子培养基中活化，活化后转入发酵培养基中发酵，当枯草芽孢杆菌HS5B5生长至稳定期时，得到含有枯草芽孢杆菌HS5B5的混合物G，此时发酵培养基中的养分消耗殆尽，混合物G中主要含有大量的菌体(﹥10⁸CFU/ml)、芽孢和次生代谢产物；枯草芽孢杆菌HS5B5对牡丹多种病害的病原微生物有显著的拮抗抑菌作用，可以与根内球囊霉和摩西球囊霉相互协同增强牡丹根系抗病能力；同时，在使用最终得到的复合微生物菌肥的过程中，也对牡丹的地上部分喷施枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂，这样处理后对牡丹根、茎、叶形成全方位保护，比单纯使用菌肥灌根的抗病效果更加明显；

步骤七、将步骤五制得的混合物F与步骤六制得的混合物G按质量比3-5：1混合，搅拌均匀即制得牡丹灌根用复合微生物菌肥。

进一步地，步骤一所述的水果废弃物为苹果落果、苹果腐果、苹果鲜渣、菠萝渣中的任意一种或任意混合物，苹果落果、苹果腐果、苹果鲜渣和菠萝渣中均含有大量酸性有机物质，其酸性和有益微生物菌群可以抑制牡丹病原微生物的繁殖，改善土地盐碱化程度，显著提高肥力。

进一步地，步骤一所述的水果废弃物为苹果鲜渣和苹果落果的混合物，苹果鲜渣和苹果落果的质量比为1：3；红薯渣、苹果鲜渣和苹果落果中的果胶、蛋白质和纤维素经菌肥中的微生物降解可以得到氨基酸、多肽和脂肪酸等物质，有利于牡丹吸收促进牡丹生长，提高牡丹抗逆性。

进一步地，步骤一所述红薯渣和水果废弃物粉碎至0.8cm以下，有利于缩短发酵时间。

进一步地，步骤二所述鸡粪、牛粪、沼气池渣和小麦秸秆的质量比为1：1：2：3。

进一步地，步骤四扩繁根内球囊霉和摩西球囊霉所用的扩繁基质由河沙和土按质量比1：1混合后灭菌制得。

进一步地，步骤六所述的种子培养基为营养肉汤培养基；步骤六所述的发酵培养基以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄·2H₂O 1.0g，水1000ml，调节pH至7.0；所述的枯草芽孢杆菌HS5B5的活化温度为30℃，活化时长为11小时；步骤六所述的枯草芽孢杆菌HS5B5在发酵培养基中发酵的条件为：30℃通气发酵25小时。

通过本发明提供的方法制备的牡丹灌根用复合微生物菌肥在对牡丹灌根的同时，用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒牡丹茎叶，可使牡丹植株健壮，增强抗病能力，提高牡丹花朵品质，延长花期，增加观赏效果。

实施例：

以下实施例所用的热带假丝酵母、白地霉、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、根内球囊霉和摩西球囊霉均购自山东深海生物科技股份有限公司，各菌种保藏地址及保藏号分别为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 2.2735。白地霉(Geotrichum candidum)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏菌号为CGMCC 2.1132。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏菌号为CGMCC 1.2416。胶冻样类芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为ACCC 10012。根内球囊霉(Glomus intraradices)和摩西球囊霉(Glomus mosseae)为欧洲菌种保藏中心注册保藏，保藏号分别为BEG 141和BEG 167。

实施例1

一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取热带假丝酵母在麦芽汁培养基(每1000ml水中加入麦芽膏粉130g，氯霉素0.1g；调节pH至6.0)中进行活化，培养至对数生长期，得到含热带假丝酵母的混合物A；按质量比1：1：3取红薯渣、苹果鲜渣和苹果落果，粉碎至0.8cm以下，以红薯渣、苹果鲜渣和苹果落果总质量为基准，加入1％的尿素，搅拌均匀得到混合物B；将混合物A接种到混合物B中，接种量为混合物B质量的1％，室温搅拌发酵5天，制得发酵物Ⅰ；

步骤二、按质量比1：1：2：3取鸡粪、牛粪、沼气池渣和粉碎至1cm以下的小麦秸秆，混合均匀得到混合物C，以混合物C的质量为基准，加入5％的生石灰，暴露于空气中自然放置5天，制得发酵物Ⅱ；

步骤三、将步骤二制得的发酵物Ⅱ加入到步骤一制得的发酵物Ⅰ中，其中发酵物Ⅱ与发酵物Ⅰ质量比为3：1，混匀后得到混合物D；在混合物D中接种处于对数生长期的白地霉、巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，且各菌株的接种量均为混合物D质量的1％，于30℃条件下搅拌发酵6天，制得发酵物Ⅲ；

步骤四、以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁根内球囊霉，接种量为5％，当根内球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有根内球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E1；以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁摩西球囊霉，接种量为5％，当摩西球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E2；将混合物E1和混合物E2按质量比1：1混合均匀获得混合物E；扩繁根内球囊霉和摩西球囊霉所用的扩繁基质均为由河沙和土按质量比1：1混合后灭菌制得；

步骤五、按质量比100：90：2：1取发酵物Ⅲ、混合物E、鱼粉和硫酸锌，将混合物E、鱼粉和硫酸锌加入到发酵物Ⅲ中，混匀后制得半固体状的混合物F；

步骤六、取枯草芽孢杆菌HS5B5，在种子培养基中30℃活化11小时，然后转入发酵培养基中30℃通气发酵25小时，使枯草芽孢杆菌HS5B5生长至稳定期，制得含有枯草芽孢杆菌HS5B5的混合物G；

所述的种子培养基为营养肉汤培养基,以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1 5.0g，水1000ml，调节pH至7.0；

所述的发酵培养基以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄·2H₂O 1.0g，水1000ml，调节pH至7.0；

步骤七、将步骤五制得的混合物F与步骤六制得的混合物G按质量比5：1混合，搅拌均匀即制得牡丹灌根用复合微生物菌肥。

实施例2

一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、取热带假丝酵母在麦芽汁培养基(每1000ml水中加入麦芽膏粉130g，氯霉素0.1g；调节pH至6.0)中进行活化，培养至对数生长期，得到含热带假丝酵母的混合物A；按质量比1：1：3取红薯渣、苹果鲜渣和苹果落果，粉碎至0.8cm以下，以红薯渣、苹果鲜渣和苹果落果总质量为基准，加入1％的尿素，搅拌均匀得到混合物B；将混合物A接种到混合物B中，接种量为混合物B质量的1％，室温搅拌发酵4天，制得发酵物Ⅰ；

步骤二、按质量比1：1：2：3取鸡粪、牛粪、沼气池渣和粉碎至1cm以下的小麦秸秆，混合均匀得到混合物C，以混合物C的质量为基准，加入5％的生石灰，暴露于空气中自然放置3天，制得发酵物Ⅱ；

步骤三、将步骤二制得的发酵物Ⅱ加入到步骤一制得的发酵物Ⅰ中，其中发酵物Ⅱ与发酵物Ⅰ质量比为3：1，混匀后得到混合物D；在混合物D中接种处于对数生长期的白地霉、巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，且各菌株的接种量均为混合物D质量的1％，于30℃条件下搅拌发酵4天，制得发酵物Ⅲ；

步骤四、以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁根内球囊霉，接种量为3％，当根内球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有根内球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E1；以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁摩西球囊霉，接种量为3％，当摩西球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E2；将混合物E1和混合物E2按质量比1：1混合均匀获得混合物E；扩繁根内球囊霉和摩西球囊霉所用的扩繁基质均为由河沙和土按质量比1：1混合后灭菌制得；

步骤五、按质量比100：90：2：1取发酵物Ⅲ、混合物E、鱼粉和硫酸锌，将混合物E、鱼粉和硫酸锌加入到发酵物Ⅲ中，混匀后制得半固体状的混合物F；

步骤六、取枯草芽孢杆菌HS5B5，在种子培养基中30℃活化11小时，然后转入发酵培养基中：30℃通气发酵25小时，使枯草芽孢杆菌HS5B5生长至对稳定期，制得含有枯草芽孢杆菌HS5B5的混合物G；

所述的种子培养基为营养肉汤培养基,以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaC1 5.0g，水1000ml，调节pH至7.0；

所述的发酵培养基以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄·2H₂O 1.0g，水1000ml，调节pH至7.0；

步骤七、将步骤五制得的混合物F与步骤六制得的混合物G按质量比3：1混合，搅拌均匀即制得牡丹灌根用复合微生物菌肥。

试验：

以通过实施例1提供的方法制备的牡丹灌根用复合微生物菌肥(以下简称牡丹专用菌肥)以及在制备过程中制得的中间产物进行试验。

试验一、在牡丹花期前一个月，选取洛阳国际牡丹园牡丹栽培区长势相同的牡丹400株，随机分为①、②、③、④、⑤、⑥、⑦和⑧八组，每组50株，各组分别处理如下：

①用牡丹专用菌肥灌根，同时用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒牡丹枝叶；

②用牡丹专用菌肥灌根，同时用水喷洒牡丹枝叶；

③用发酵物Ⅲ灌根，同时用水喷洒牡丹枝叶；

④用混合物D灌根，同时用水喷洒牡丹枝叶；

⑤用水灌根，同时用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒牡丹枝叶；

⑥用水灌根，同时用水喷洒牡丹枝叶；

⑦用普通微生物菌肥灌根，同时用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒牡丹枝叶；

⑧用普通微生物菌肥灌根，同时用水喷洒牡丹枝叶；

上述处理中灌根用的牡丹专用菌肥、发酵物Ⅲ、混合物D和普通微生物菌肥均按80g/株使用，用水稀释成1000ml进行灌根；⑤和⑥中，每株牡丹施用1000ml水灌根；

上述处理中喷洒牡丹枝叶用的枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂为实施例1制备过程中的混合物G，按10g/株使用，用水稀释成500ml均匀喷洒枝叶；②、③、④、⑥和⑧中，每株牡丹施用500ml水喷洒枝叶。

每15天重复处理一次，30天后观察并记录花期、新枝长度、成花率、花径、单花质量和感染真菌病害株数(所述真菌病害主要指牡丹褐斑病等常见牡丹真菌病害，以下所述的真菌病害与此相同)，结果如表1所示：

表1各种处理对牡丹开花的影响

表1中，牡丹是观赏类花卉，整株牡丹花期时间越长，则带来的收益越高；新枝长代表当年开花枝条的长势，枝条较长，花朵直立，则叶里藏花的情况得到改善，可以增加观花效果；成花率反映花蕾营养发育情况；花径和单花质量均反映花朵大小，花朵越大，则观赏效果较好；a、b、c和d均表示不同数据间差异的显著性，相同字母间差异不显著，不同字母间差异显著。

结果表明：①组平均整个花期为8.21天，新枝最长，花冠硕大，成花率100％表示植株上部所有新枝均能成花，说明植株营养状况较好，无花蕾败育情况。同时只有1株牡丹感染真菌病害；②组与①组差异不明显，但是有8株牡丹感染真菌病害，说明用牡丹专用菌肥灌根能够对牡丹根部形成保护，在一定程度上对牡丹真菌病害的起到防治作用，如果同时用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒牡丹枝叶，则能够对牡丹枝、叶以及根、茎形成全方位保护，能更好的抑制真菌病原菌，对牡丹真菌病害的防治效果也更好；③组和②组相比，花期缩短将近1天，成花率、花径和单花质量都比①组显著降低，感染病害植株数也较多，说明混合物E中的丛枝菌根混合物以及鱼粉、硫酸锌能够增加和丰富营养的吸收，促进光合作用，延长花期，提高牡丹的抗逆性，并减少病害的发生；④组施用混合物D，其各项指标均比③组略差，分析表明，混合物D中含有一定量的不易被牡丹吸收利用的氮素、碳水化合物、蛋白质和少量的生化黄腐酸；⑤组施用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂(即混合物G)喷洒枝叶，可以一定程度上预防牡丹真菌病害的发生，但同时仅用水进行灌根，和①组相比，各项指标明显降低，牡丹缺少了大量营养物质，降低了植株的抗逆性。①与⑦或②与⑧相比，平均花期延长了20％以上，成花率和花的品质也大幅增加，说明牡丹专用菌肥对提高牡丹品质、延长牡丹花期比普通微生物菌肥效果更好。综合以上分析，通过实施例1制备的牡丹专用菌肥施用后，能够提高牡丹的抗逆性以及花的品质，延长花期，促进牡丹开花，增加开花数量。混合物G即枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒枝叶后，也能够明显降低牡丹感染真菌病害的机率，因其是液体状态的特性，可以在实际应用喷洒与灌根配合施用。

试验二、在牡丹营养生长阶段，选取洛阳国际牡丹园牡丹栽培区长势相同的牡丹400株，随机分为八组，具体分组及各组处理均与试验一相同。

每15天重复处理一次，45天后记录牡丹营养生长情况，结果如表2所示：

表2各种处理对牡丹营养生长的影响

表2中，SPAD表示叶绿度，反映了叶片叶绿素含量高低，与净光合速率一起体现植株的光合同化能力；气孔导度增大，可以减轻气孔限制，促进光合作用的增加，但也不可避免的增加了蒸腾失水；水分利用效率增加，说明气孔导度增加则蒸腾作用增强，但促进光合作用的效应更为明显；a、b、c和d均表示不同数据间差异的显著性，相同字母间差异不显著，不同字母间差异显著。

结果显示：①组牡丹长势最好，也只有2株牡丹感染真菌病害；②组与①组差异不明显，但是有7株牡丹感染真菌病害，进一步说明用牡丹专用菌肥灌根的同时，用枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂喷洒牡丹枝叶能够更好的拮抗真菌病原菌，对牡丹真菌病害的防治效果也更好；③组和②组相比，光合速率明显降低，说明缺少了丛枝菌根以及鱼粉、硫酸锌，不仅使根际吸收面积减少，而且缺乏氨基酸和锌素，导致光合作用和植株抗逆性降低，牡丹营养生长的各项指标有了显著性降低；④组施用混合物D，其营养生长的各项指标比③组差，进一步说明混合物D中的营养物质不如③组容易被牡丹吸收利用；⑤组施用混合物G喷洒枝叶，可以一定程度上预防牡丹真菌病害的发生，但营养物质不足，降低了植株的抗逆性。①与⑦或②与⑧相比，叶绿素含量高，光合作用增强，说明植株更为健壮，抗病能力增强。综合以上分析，牡丹专用菌肥能够提供丰富的营养物质，促进牡丹的光合作用和营养生长，提高植株的抗逆性，有效预防牡丹真菌病害的发生。

综上所述，②、③、④和⑥四组相比，②组处理的牡丹叶绿素含量最高，光合速率最强，平均花期最长，感病株数也最少，说明通过实施例1提供的方法制备的菌肥能够促进牡丹根系生长、延长花期，对牡丹真菌病害也有一定的防治效果；①、②和⑤三组相比，①组牡丹长势最好，平均花期最长，新枝最长，花冠硕大，成花率100％(表示植株上部所有新枝均能成花)，仅有一两株牡丹感染病害，说明菌肥配合枯草芽孢杆菌HS5B5菌剂使用对牡丹防止真菌病害的效果更好；①与⑦或②与⑧相比，说明通过实施例1制备的牡丹专用菌肥比普通微生物菌肥更具针对性，对牡丹的营养生长和延长花期具有良好的效果。

Claims (10)

1.一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、取热带假丝酵母进行活化，培养至对数生长期，得到含热带假丝酵母的混合物A；按质量比1：4取红薯渣和水果废弃物，粉碎至1.5cm以下，以红薯渣和水果废弃物总质量为基准，加入1%的尿素，搅拌均匀得到混合物B；将混合物A接种到混合物B中，接种量为混合物B质量的1%，室温搅拌发酵4-5天，制得发酵物Ⅰ；

步骤二、按质量比1：1：2-3：2-3取鸡粪、牛粪、沼气池渣和粉碎至1cm以下的小麦秸秆，混合均匀得到混合物C，以混合物C的质量为基准，加入5%的生石灰，暴露于空气中，自然放置3-5天，制得发酵物Ⅱ；

步骤三、将步骤二制得的发酵物Ⅱ加入到步骤一制得的发酵物Ⅰ中，其中发酵物Ⅱ与发酵物Ⅰ质量比为3：1，混匀后得到混合物D；在混合物D中接种处于对数生长期的白地霉、巨大芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，且各菌株的接种量均为混合物D 质量的1%，于30℃条件下搅拌发酵4-6天，制得发酵物Ⅲ；

步骤四、以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁根内球囊霉，接种量为3%-5%，当根内球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有根内球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E1；以苜蓿为宿主植物，在扩繁基质中扩繁摩西球囊霉，接种量为3%-5%，当摩西球囊霉孢子达到每克土中含30个以上时，打碎苜蓿根和扩繁基质，获得含有摩西球囊霉菌根真菌孢子、根内外菌丝和侵染根段的混合物E2；将混合物E1和混合物E2按质量比1：1混合均匀获得混合物E；

步骤五、按质量比100：90：2：1取发酵物Ⅲ、混合物E、鱼粉和硫酸锌，将混合物E、鱼粉和硫酸锌加入到发酵物Ⅲ中，混匀后制得半固体状的混合物F；

步骤六、取枯草芽孢杆菌HS5B5，在种子培养基中活化，活化后转入发酵培养基中发酵，当枯草芽孢杆菌HS5B5生长至稳定期时，得到含有枯草芽孢杆菌HS5B5的混合物G；

步骤七、将步骤五制得的混合物F与步骤六制得的混合物G按质量比3-5：1混合，搅拌均匀即制得牡丹灌根用复合微生物菌肥。

2.根据权利要求1所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤一所述的水果废弃物为苹果落果、苹果腐果、苹果鲜渣、菠萝渣中的任意一种或任意混合物。

3.根据权利要求2所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤一所述的水果废弃物为苹果鲜渣和苹果落果的混合物，且苹果鲜渣和苹果落果的质量比为1：3。

4.根据权利要求1所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤一所述红薯渣和水果废弃物粉碎至0.8cm以下。

5.根据权利要求1所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤二所述鸡粪、牛粪、沼气池渣和小麦秸秆的质量比为1：1：2：3。

6.根据权利要求1所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤四扩繁根内球囊霉和摩西球囊霉所用的扩繁基质均为由河沙和土按质量比1：1混合后灭菌制得。

7.根据权利要求1所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤六所述的种子培养基为营养肉汤培养基。

8.根据权利要求7所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤六所述的枯草芽孢杆菌HS5B5的活化温度为30℃，活化时长为11小时。

9.根据权利要求1所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤六所述的发酵培养基以每加入1000ml水为参照，其组分及其添加量分别为：玉米粉15.0g，葡萄糖3.0g，大豆粉15.0g，蛋白胨3.0g， MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄·2H₂O 1.0g，水1000ml，调节pH至7.0。

10.根据权利要求9所述的一种牡丹灌根用复合微生物菌肥的制备方法，其特征在于：步骤六所述的枯草芽孢杆菌HS5B5在发酵培养基中发酵的条件为：30℃通气发酵25小时。