CN106109054A - 利用大孔径平行聚己内酯电纺棉构建自体组织工程血管 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种大孔径平行聚己内酯(PCL)电纺棉，属于生物医学工程技术领域。本发明还提供该电纺棉制备的组织血管工程支架、组织工程血管。其优点表现在：(1)大孔径聚己内酯电纺棉具有良好的力学性能和细胞相容性，且有利于细胞快速长入；(2)最终得到的组织工程血管组织细胞和细胞外基质来源于自体，不产生免疫排斥反应；(3)平行排列的聚己内酯电纺棉纤维引导细胞和细胞外基质定向环形排列，能模拟天然血管的组织学构造。

Description

利用大孔径平行聚己内酯电纺棉构建自体组织工程血管

技术领域

本发明涉及生物医学工程技术领域，具体地说，是利用大孔径平行聚己内酯电纺棉构建自体组织工程血管。

背景技术

现有的几种血管移植替代物尚存在不具有生长性、或异体组织易导致免疫排斥反应等缺陷。因此，构建具备生长性，且有自体组织或细胞的新型组织工程血管具有重要意义。

一般地，构建组织工程血管首先需要解决三个问题：(1)组织支架，(2)种子细胞来源和(3)组织构建方法。“组织支架”是细胞赖以粘附和生长的环境。由于人工构建的组织在形成初期尚缺乏植入细胞分泌的细胞外基质，因此需要人为地为细胞提供附着的支架；从另一方面讲，组织支架还决定了所构建组织的最终形态、种子细胞的选择及定植方法，因此，制备出合适的组织支架是组织工程血管构建成功的关键。

在各种组织工程血管支架制备方法中，较普遍采用的是利用静电纺技术制备出的纤维支架。将亲细胞、可生物降解的高分子聚合材料，如聚己内酯(PCL)，聚乳酸(PLA)等配制成一定浓度的溶液，装入连接有微泵的注射器。从注射器针头挤出的聚合物溶液在电场力的作用下会拉成细丝，并以一定的方式聚集于接收装置，最终得到静电纺纤维支架。

之前，发明人已就静电纺纤维膜在构建组织工程血管中的应用进行了探索，并建立了一种组织工程血管构建方法：即以平滑肌，一种广泛存在于大中血管中膜层的细胞作为种子细胞；将平滑肌细胞在体外预先种植在纳米纤维电纺膜上，待细胞在其表面粘附生长后，卷曲缠绕于圆柱管，再移植到动物皮下形成血管状组织。由于该方法类似“三明治”的制作过程，因此也被称为“三明治夹心法”。

之所以采用这种“种子细胞体外种植-卷曲包裹-皮下移植”的构建方式的原因是，我们先前研制出的纳米级静电纺纤维直径细小、纤维之间排列致密紧实，因此直接皮下移植或血管原位移植后自体细胞难以长入电纺膜内部并实现电纺膜的组织化——这与Gore-Tex管道或牛颈静脉管道移植后的结果无太大差别。然而，这还带来了另外的问题：(1)种子细胞体外分离、培养扩增的过程复杂，极易发生细胞污染、老化；(2)结合“三明治法”将载有种子细胞电纺膜卷曲移植后，种子细胞首先需要克服皮下营养不足的环境，这带来了构建成功率低的问题；(3)体外种植细胞还容易发生细胞流失。因此，利用上述“三明治法”较难构建出满意的组织工程血管。图1展示了一例“三明治法”组织工程血管构建失败的案例，可见分层的、未组织化的材料。因此，需要从根本上改进静电纺支架的性质。

本发明希望解决传统方法纺出的静电纺纳米纤维膜细密紧实，细胞不易长入的问题。以PCL为基本原料的大孔径、粗纤维PCL电纺棉及其在自体组织工程血管中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有静电纺纤维膜(即传统“电纺膜”)技术中的不足，提供一种电纺棉。

本发明的再一的目的是，提供一种电纺棉的应用。

本发明的另一的目的是，提供一种组织工程支架的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于制备组织工程血管的电纺棉，所述的电纺棉为聚己内酯电纺棉。

所述的电纺棉为大孔径平行聚己内酯电纺棉，电纺棉的孔径为20μm～100μm。

所述的电纺棉为30～40％的聚己内酯的三氟乙醇溶液通过静电纺丝获得的电纺棉。

所述的电纺棉通过如下方法制得：配置质量体积比为35％的聚己内酯的三氟乙醇溶液，然后以镂空的滚筒为收集装置进行静电纺丝，在短距离接收条件下获得电纺棉。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的电纺棉在制备组织工程血管的支架的应用。

一种组织工程血管支架，所述的组织工程血管支架为利用电纺棉构建的管状支架。

所述的电纺棉为大孔径平行聚己内酯电纺棉。

所述的组织工程血管支架的制备方法为：以圆柱体为内支撑，将大孔径聚己内酯电纺棉沿同一方向包绕于圆柱体表面，制成组织工程血管支架。

所述的组织工程血管支架的制备方法为：配置质量体积比为35％的聚己内酯的三氟乙醇溶液，然后以镂空四骨架滚筒为收集装置进行静电纺丝获得电纺棉，以橡胶圆柱管为内支撑将电纺棉沿同一方向包绕于橡胶圆柱管表面，制成组织工程血管支架。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的组织工程血管支架在制备组织工程血管中的应用。

本发明优点在于：

1、大孔径聚己内酯电纺棉具有良好的力学性能和细胞相容性，且有利于细胞快速长入。

2、最终得到的组织工程血管组织细胞和细胞外基质来源于自体，不产生免疫排斥反应。

3、平行排列的聚己内酯电纺棉纤维引导细胞和细胞外基质定向环形排列，能模拟天然血管的组织学构造。

附图说明

附图1：以传统电纺膜为支架材料，通过“三明治”法构建组织工程血管。利用明胶/PCL(50:50,m/m)纳米纤维电纺膜作为血管支架，以骨髓间充质干细胞为种子细胞，在体外将骨髓间充质干细胞种植于电纺膜，并卷曲缠绕于圆柱管上(“三明治法”)，再移植到裸鼠皮下构建组织工程血管。移植9个月后取材依然可见层叠的明胶/PCL电纺膜(B)，表明电纺膜未降解、组织形成差。组织切片HE染色(A，C和D)可见6层电纺膜相互分离，中间几乎没有细胞长入。最外层的电纺膜在对称的两个部位有少量细胞长入(图A黑色星号标记区域)，分别为皮下紧贴皮肤和紧贴体壁的区域。由于这些部位血供充足，促进了细胞长入和部分移植细胞的存活。C图放大显示细胞长入电纺膜的区域(对应A图实线方框部位)；D图放大显示电纺膜细胞长入交界区域(对应A图虚线方框区域)。E图为细胞长入电纺膜区域的Masson染色，仅见下层少量蓝染的胶原纤维。外层蓝染部位为取材时未除尽的组织表面疏松***。红色箭头指示第二层电纺膜下尚残留的种子细胞核。标尺：A＝1.0mm；C-E＝100μm。

附图2：静电纺PCL纤维膜(棉)的制备及其形态。10％PCL电纺丝用表面贴附有铝箔的滚筒装置接收最终得到细密的电纺丝(A)。电纺丝间紧密排列成PCL电纺膜(B)。透光可见PCL电纺膜细密紧实的结构，肉眼难以观察到纤维质地(C)。35％PCL电纺丝用镂空装置接收后可得到排列取向一致的粗纤维(D)。这种纤维多层叠加后可得到结构疏松的PCL电纺棉(E)，透光可见定向排列的粗纤维(F)。

附图3：PCL电纺膜(棉)扫描电子显微镜观察。传统PCL纳米纤维电纺膜(对照)及大孔径PCL电纺棉(本发明)扫描电子显微镜图。在相同放大倍率条件下，PCL电纺膜纤维细小，纤维之间留出的孔洞很小(A，B)；而PCL电纺棉纤维粗，纤维之间形成的孔洞大(B，D)。标尺：A,C＝100μm；B,D＝10μm。

附图4：静电纺纤维的排列及直径分布特征。应用ImageJ图像分析软件测量电镜图片中150根纤维相对平面坐标x轴的成角及纤维直径(A，B)。PCL纳米纤维电纺膜(对照)的平均直径约0.67±0.34μm，而大孔径PCL电纺棉(本发明)的直径约3.90±1.85μm，其纤维直径的频数分布图分别为C和D。

附图5：PCL电纺膜(棉)的力学性能。材料在不同方向上收到拉力时具有不同的形态特征，也具有不同的可拉伸长度(紧实PCL电纺膜：A和B，大孔径PCL电纺棉：C和D)。用拉力机测量材料的在收到拉力条件时的受力情况，其单位面积上的受力用MPa为单位，相对测量前的原始长度变化用百分数表示，得到两种材料在顺纤维方向(E)和垂直纤维方向(F)的拉力-拉伸比例曲线。杨氏模量是评价材料顺应性的指标，即受力-拉长曲线上线性上升段的斜率。大孔径PCL电纺棉(本发明)在两个方向上的杨氏模量均明显小于传统PCL电纺膜(对照)(G和H,*p<0.05.)。

附图6：PCL电纺膜(棉)的亲水角检测。将5μL水滴于电纺膜(棉)，并分别检测水滴在材料不同纤维延展方向上的亲水角。滴加水滴后50s水滴于材料所成亲水角显示于图A～D，每图中右上角为检测方向模式图：A,C显示检测相机与材料纤维方向平行；B,D显示材料与纤维方向垂直。每种材料不同方向上0s,20s和50s所成的亲水角总结于图E(*p<0.05)。

附图7：人平滑肌细胞在PCL电纺膜(棉)上的生长。人平滑肌细胞在PCL电纺膜(对照，A)和PCL电纺棉(本发明，B)体外培养6天后的细胞形态。C图展示单个细胞在单根PCL电纺棉纤维上的生长状态(箭头所指)。图中细胞骨架均染成红色，DAPI套染的细胞核发出蓝色荧光。PCL纤维自发绿色荧光。标尺：A,B＝200μm，C＝100μm。

附图8：无细胞电纺膜(棉)组织工程血管支架皮下移植前后大体观。血管支架分别由传统PCL电纺膜(对照)或大孔径PCL电纺棉(本发明)包绕于橡胶管制成(A和H)。血管支架作动物皮下移植用于构建具有自体组织的组织工程血管。其中紧密电纺膜血管支架皮下移植后4w(B,C和D)和6w(E，F和G)取材；对应地，疏松电纺棉血管支架皮下移植后4w(I，J和K)和6w(L，M和N)后取材。最右侧一栏显示对应移植物抽离橡胶管支撑物后的横切面(D，G，K和N)。

附图9：无细胞PCL电纺膜(棉)组织工程血管支架大鼠皮下移植4w后组织切片。无细胞紧实PCL电纺膜和无细胞大孔径PCL电纺棉组织工程血管支架移植到大鼠皮下，4w后取材。电纺膜(对照组)冰冻切片HE染色可见电纺膜外层的***包裹。电纺膜间无细胞和细胞外基质沉积(A和B)。Masson染色未见蓝色的胶原纤维(C)。电纺棉(本发明)石蜡切片见细胞长入电纺膜全层，细胞外基质开始沉积(D和E)，Masson染色可见少量蓝色的胶原纤维(F)。标尺：A,D＝400μm；B,C,E,F＝100μm。

附图10：电纺膜(棉)大鼠皮下移植6w形成血管组织切片。无细胞紧实PCL电纺膜和无细胞大孔径PCL电纺棉组织工程血管支架移植到大鼠皮下，6w后取材。电纺膜(对照组)冰冻切片HE染色见电纺膜外包裹***，电纺膜内无自体细胞长入，也无细胞外基质沉积(A和B)。Masson染色仅见电纺膜外***极少量的胶原沉积(C)。电纺棉(本发明)石蜡切片HE染色可见全层大量细胞和细胞外基质(D和E)，Masson染色见蓝色胶原纤维沉积增多，细胞外基质呈类似天然血管壁的环向排列(F)。标尺：A,D＝400μm；B,C,E,F＝100μm。

附图11：组织工程血管平滑肌细胞标记物免疫荧光染色。用大孔径PCL电纺棉(本发明)构建的组织工程血管(大鼠皮下4w)冰冻切片免疫荧光染色。每行图片成一组，每组中细胞骨架被标记为红色荧光(A，E和I)，组织中大部分细胞SM22标记物呈阳性(B)，组织中负责营养供给的新生血管管壁表达SMA或Calponin(F和J)。细胞核用DAPI套染为蓝色(C，G和K)，每组图片叠加结果分别为D，H和L。所有图片标尺＝50μm。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、材料和方法

1动物

150g雄性清洁级SD大鼠为本实验所涉及的动物，均由上海斯莱克实验动物有限公司提供。动物实验方案和实验操作均通过上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心实验动物管理小组审查批准。

2仪器

3试剂和材料

4方法

4.1相关溶液的配制

(1)10％和35％聚己内酯(PCL)静电纺溶液

以TFE为溶剂，用电子天平称取PCL颗粒，按10％和35％(m/v)的溶质比例称量后转入溶解瓶。按1.386g/ml的密度用电子天平量取相应体积的TFE转入对应溶解瓶中。室温下反复翻转溶解瓶促进PCL均匀溶解。持续翻转溶解4d后用于静电纺。配制好的溶液应于1w内用完。

(2)平滑肌细胞培养液

平滑肌细胞培养液以原装High-glucose DMEM培养液一瓶为单位配制。以500ml/瓶High-glucose DMEM培养液为例，加入55ml胎牛血清(FBS)和5.5ml青霉素链霉素双抗(PS)。混匀后配成含10％FBS和1％PS的High-glucoseDMEM平滑肌细胞培养液。培养液开封配成后，置于4℃冰箱保存，应于2w内用完。

4.2静电纺PCL纤维的制备

(1)粗纤维PCL电纺棉的制备(本发明)

用注射器吸取35％PCL静电纺溶液，换14G平口点胶针头。将注射器装载于微量注射泵，并安置使之悬于镂空四骨架滚筒接收装置的上方。调节高度，使针尖与接收装置之间的距离为6cm。将高压电源地级端连接于滚筒接收装置，电源高压端夹于针头金属部分。调节高压电源，使高压输出为16kV。调节微量注射泵注射速率为5ml/h。调节滚筒控制器，使滚筒旋转速率为2000rpm。静电纺初期，由于出丝尚不稳定，这部分电纺丝可搜集于滚筒一端。待出丝稳定后，于滚筒中部接收电纺丝。接收过程中应不断缓慢左右移动滚动，使电纺丝在滚筒上以均匀的密度分布。

(2)传统细纤维PCL电纺膜的制备(对照组材料)

参考我们之前制备纳米纤维电纺膜的方法制备细密PCL电纺模：用注射器抽取10％PCL静电纺溶液，换用18G平口点胶针头。类似PCL粗纤维的制备，以同样的方式安装于微量注射泵。以表面包裹有铝箔的实心滚筒为接收装置。调节针头与滚筒间的接收距离为12cm，微量注射泵的注射速度为3ml/h，高压电源电压为12kV，滚筒转速为2000rpm。收集到的电纺膜作为下列实验的对照组。

4.3PCL电纺膜(棉)的形态观察

(1)大体观察

分别观察两种不同的静电纺纤维在收集装置上的形态，注意纤维粗细，纤维之间排列的平行度等指标。多层粗纤维PCL电纺棉层叠可以得到“大孔径PCL电纺棉”(简称“电纺棉”，即本发明)；剥离下铝箔表面聚集的纤维得到“传统PCL电纺膜”(简称“电纺膜”，为本发明的对照组)。观察电纺膜(棉)形态。

(2)扫描电子显微镜观察和分析

将两种PCL电纺膜(棉)置于真空冷冻干燥箱中干燥过夜。初步干燥后的电纺膜(棉)再经过临界点干燥、喷镀金属处理，置于扫描电子纤维镜中观察。得到的图片用ImageJ1.50i图像分析软件处理，随机测量图像中150根纤维相对平面坐标x轴的角度和直径，再统计角度分布、纤维直径分布和纤维平均直径等指标(n＝3)。两种材料的纤维直径按平均直径±标准差表示，统计差异性使用独立样本t检验(p<0.05被认为有统计学差异)。

4.4PCL电纺膜(棉)的力学检测

用滚筒接收的PCL电纺膜(棉)纤维排列具有一定的取向特征，因此在分析其力学特征时，分顺纤维方向力学特征和垂直纤维方向力学特征两方面。按顺纤维方向和垂直纤维方向为长方形的长，将电纺膜(棉)裁剪为10×40mm大小的长方形片，分别测量其厚(每组材料n＝5)。测量时拉力机上下夹具夹住长方形片每端各10mm，因此纳入测量计量的纤维片长、宽、高分别为：a＝20mm,b＝10mm,c＝游标卡尺测量的厚度(mm)。拉力机启动后，将测量不同拉长长度下(l/mm)材料片所产生的拉力(f/kN)。

拉伸过程中，材料产生的拉力(压强)按下列公式计算：

$Stress\left(mPa\right)=\frac{f\left(kN\right)/1000}{b\left(mm\right)\&CenterDot;c\left(mm\right)}$

拉伸过程中，材料相对原始长度的拉伸比例为：

$Strain\left(\%\right)=\frac{\mathrm{\&Delta;}l\left(mm\right)}{a\left(mm\right)}\&times;100\%$

拉伸过程中，“拉力-拉伸比例曲线”被用于衡量材料整体的变化，曲线线性上升段的斜率为材料的杨氏模量(Young’s modulus)，用于衡量材料对抗形变的能力(顺应性)。两种材料的杨氏模量按“平均直径±标准差”表示，材料间的统计学差异性使用独立样本t检验(p<0.05被认为有统计学差异)。

4.5PCL电纺膜(棉)的亲水角检测

亲水角是检测材料对某种液体亲和性的方法。本研究中材料对水的亲水角即材料与水的接触角(contactangle)，后者是指气、液、固三相交汇处所作的气-液界面的切线与固-液交界之间的夹角。将上述经真空冷冻干燥后的电纺膜(棉)按“纤维与摄像头平行”或“纤维与摄像头垂直”两种放置方向分别置于亲水角检测仪上，再滴加纯水水滴，记录液滴接触材料表面后0s，20s和50s的亲水角(n＝5)。每次测量后的各个时间点亲水角按“平均直径±标准差”表示，每种材料不同放置方向上的亲水角，材料间相同放置方向的亲水角的统计学差异性使用独立样本t检验(p<0.05被认为有统计学差异)。

4.6PCL电纺膜(棉)的细胞学实验

(1)材料准备

分别裁剪合适大小的静电纺膜(棉)置于6孔板内(每组n＝3)，每个板孔用环形不锈钢压住材料四周，以免操作过程中材料在孔内游走。以75％消毒酒精浸泡孔中的材料2h后，用灭菌蒸馏水洗涤3次。置于真空冷冻干燥箱内冻干。临用前于紫外灯下辐照表面灭菌30～60min。

(2)细胞准备

取P2～4代人动脉导管平滑肌细胞。吸去培养皿中的平滑肌培养液，用PBS漂洗1～2次后，加入1ml胰酶/10cm培养皿。放置于37℃培养箱中消化2～3min。完成后加入3倍胰酶量的平滑肌细胞培养液终止消化，移入离心管。以1000rpm的速率离心5min。吸走上清液，再一定量的平滑肌细胞培养液重悬，细胞计数板计数。

(3)细胞的种植

将(1)中处理后装有两种材料的6孔板用于平滑肌细胞培养。细胞接种前预先在每孔中加入一定量的平滑肌细胞培养液，使材料充分吸收培养液后，培养液可完全没过材料。将重悬后的平滑肌细胞按5×10⁵/孔的密度缓慢均匀地滴加到每个孔中，静置培养于含5％CO₂的37℃恒温培养箱。每2d换液1次。

(4)细胞的荧光染色观察

上述细胞接种培养6天后，吸走培养液，用PBS洗涤2～3次，再转移至新的6孔板，避免原6孔板底部生长的细胞对实验结果造成干扰。用4％多聚甲醛固定30min。PBS漂洗2～3次。细胞骨架荧光染液与PBS按3.5:500(v/v)的比例配制并加入板孔中，于常温染色30min，PBS漂洗3次。加入1:2000稀释的DAPI染液套染细胞核10s，三蒸水漂洗3次。荧光显微镜镜检观察。

5PCL电纺膜(棉)用于自体组织工程血管的构建

5.1电纺膜(棉)组织工程血管支架的搭建

(1)大孔径无细胞PCL电纺棉组织工程血管支架的搭建(本发明所述的组织工程血管支架)

粗纤维PCL电纺棉最初收集于镂空四骨架滚筒。以橡胶圆柱管为内支撑，将滚筒上的粗纤维沿同一方向包绕于橡胶管表面10圈，制成大孔径无细胞PCL电纺棉组织工程血管支架。为了避免电纺棉纤维在缠绕后散开，橡胶管两端用7-0丝线固定。

(2)细密无细胞PCL电纺膜组织工程血管支架的搭建(对照)

类似粗纤维组织工程血管支架的搭建方法。从铝箔表面剥离细密静电纺纤维膜，再缠绕于橡胶圆柱管表面10圈，制成细密无细胞PCL电纺膜组织工程血管支架。完成后两端以7-0丝线固定。

5.2组织工程血管支架的动物皮下移植和评价

移植前应该按照上述细胞学实验中叙述的方法完成“75％乙醇消毒-蒸馏水冲洗-真空冻干-紫外灭菌的”的消毒灭菌步骤。同时，还应该在移植前用含抗生素的生理盐水浸泡。

以150g左右雄性SD大鼠为移植对象。称量待实验大鼠体重，以0.3ml/100g体重的剂量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠。待大鼠失去知觉后，用电动剃刀剔除背部毛发。用络合碘消毒手术部位及周围3～5cm范围内的皮肤。以无菌纱布铺单。切开合适大小的皮肤，用止血钳分离部分皮肤和皮下组织后，将包裹有电纺棉或电纺膜组织工程血管支架移植到皮下(每组n>3)。注意血管支架移植所在部位应该远离皮肤切口。完成移植后用4-0带线三角针缝合皮肤。用络合碘消毒伤口3次。于手术完成后当即，1d和2d肌肉注射抗生素预防感染。

5.3自体组织工程血管的评价

(1)大体观察

组织工程血管支架大鼠皮下移植后4w和6w取材。过量麻醉处死大鼠后沿原手术切口剪开皮肤。用止血钳小心分离皮肤和皮下组织直至组织工程血管显现。观察组织工程血管组织与周围组织的关系。完整剥离组织工程血管，抽出内包裹的橡胶支撑，注意组织横切面情况。用镊子感受组织弹性。

(2)石蜡切片和染色

常规石蜡切片并染色，完成组织石蜡切片和HE染色、Masson三色染色。显微镜观察切片部位血管组织形成情况。应尤其注意组织深部是否有细胞长入。

(3)冰冻切片平滑肌细胞标记物免疫荧光染色

常规冰冻切片和染色方法，以SM22，Calponin和SMA为平滑肌细胞标记物，并套染细胞骨架和细胞核，完成组织冰冻切片和染色。最后用荧光显微镜观察拍照。

二、结果

1PCL电纺膜(棉)的制备

1ml浓度为35％的PCL溶液通过静电纺丝并收集于镂空滚筒上可以得到排列呈平行取向的粗纤维PCL电纺棉。光学显微镜下观察可见纤维弯曲如弹簧，大部分纤维排列取向一致。将镂空骨架间的纤维沿同一方向绕于C形铁丝两臂之间，多层叠加后可得到结构疏松的大孔径PCL电纺棉(本发明)。用3.5ml浓度为10％的PCL溶液通过静电纺丝收集于实心滚筒上可得到细密的纤维。从铝箔表面揭下收集到的纤维膜，即“传统PCL电纺膜”(对照)，可明显感受到细密的纤维堆积成的紧实结构(图2)。

2PCL电纺膜(棉)的扫描电子显微镜观察

扫描电子显微镜是观察两种电纺膜微观结构最有效的工具之一。在相同倍率条件下，10％PCL静电纺溶液按照一定条件纺出的PCL电纺膜具有传统电纺膜的特征：纤维细小(直径约0.67±0.34微米)，且纤维间形成的孔洞小；相反，本研究用35％PCL静电纺溶液在镂空滚筒上接收到的PCL纤维丝粗大(直径约3.90±1.85μm)，纤维架构出的孔径也明显大于前者(约数十微米)。由于采用滚筒收集，因此两种纤维排列还呈明显的取向特征(图3、图4)

3PCL电纺膜(棉)的力学性能

由于PCL电纺膜(棉)的纤维具有一定的取向排列，因此，材料的拉伸性能可分为顺纤维方向和垂直纤维方向两种情况。(1)在顺纤维方向上，材料在单位面积上所受的拉力与拉伸比例在一定范围内呈线性关系，之后出现一拐点，单位面积拉力随材料拉长而降低。纤维紧实的PCL电纺膜曲线拐点对应材料断裂的时刻，因此拐点之后的曲线陡降至“0”MPa；而纤维疏松的PCL电纺棉在拐点之后其受力缓慢降低，实际表现为棉片纤维单根陆续断裂，而非整体断裂。(2)在垂直纤维方向上，在一定范围内两种材料同样存在拉力-拉长比例的线性关系及拐点。然而，拐点的出现位置较顺纤维方向上更低，离坐标原点距离更远，表明纤维垂直方向具有更高的顺应性和更小的断裂受力。值得注意的是，垂直方向的曲线形态呈锯齿状。杨氏模量是评价材料抵抗形变能力的物理量(顺应性)，即材料拉力-拉伸比例曲线线性上升段的斜率。可见不论在顺纤维方向还是垂直纤维方向上，多孔的PCL电纺棉的杨氏模量均显著小于紧实的PCL电纺膜(图5)。

4PCL电纺膜(棉)的亲水角检测

亲水角可以用于衡量被测材料与水的亲和性，亲和角越小，被测材料与水的亲和性越高。PCL电纺膜和PCL电纺棉虽然属于疏水材料，但由于制备技术和材料微观结构的不同，两种材料间以及材料本身不同方向的亲水角依然不相同。紧实PCL电纺膜在“纤维与摄像头垂直放置方向”以及“纤维与摄像头平行方向”的亲水角均明显大于“多孔的PCL电纺棉”。对于多孔PCL电纺膜，在“纤维与摄像头垂直方向”，其亲水角明显小于“纤维与摄像头平行方向”。在紧实PCL电纺膜，虽然“纤维与材料垂直方向”上的亲水角有低于“纤维与材料平行方向”上亲水角的趋势，但两者对比没有统计学差异。此外，还可以观察到多孔PCL电纺膜“纤维与摄像头垂直”方向上的亲水角随时间不断减少的趋势(图6)。

5PCL电纺膜(棉)的细胞学实验

人血管平滑肌细胞培养于PCL电纺膜或PCL电纺棉6d后，细胞骨架荧光染色可观察到在PCL电纺膜上的细胞均匀地铺展于纤维膜表面，但由于电纺膜的平面结构，细胞不具有三维空间位置差异。电纺膜上的细胞可沿纤维取向排列，但不甚明显。平滑肌细胞同样可在PCL电纺棉中生长。由于电纺棉疏松，且呈三维分布，因此细胞位置依纤维的空间位置排列高低错落。平滑肌细胞粘附在电纺棉纤维上后，胞体可沿纤维表面伸展延长(图7)。

6PCL电纺膜(棉)用于构建组织工程血管

大孔径PCL电纺棉包绕至橡胶管后，可见无细胞电纺棉血管支架表面蓬松，而细密PCL电纺膜血管支架材料表面光滑紧密。大鼠皮下移植4w后取材，可见“电纺棉血管支架组”组织已完全包裹电纺棉支架。表面为一层疏松***，透过表层可见下层肉红色质地紧密的类血管组织。橡胶管支撑物可较轻松地与组织分离。分离后的组织工程血管横切面肉眼难以见到原有的静电纺纤维棉，管腔面光滑平整。移植4w的“电纺膜血管支架组”取材可见，表面有疏松***覆盖，可透见下层苍白色“组织”。然而，在取出橡胶支撑物过程中，包绕的电纺膜发生分离，不能得到完整的组织工程血管。“电纺棉血管支架”在皮下移植6w后取材结果从大体看与4周取材结果基本类似，表面有疏松***包裹，下层为致密的肉红色组织工程血管。电纺膜血管支架组皮下移植6w后，大体观与4w取材结果类似，依然无法取出完整的血管组织(图8)。

7PCL电纺膜(棉)组织工程血管的组织学观察

无细胞电纺棉血管支架皮下移植4w后形成的组织工程血管HE染色显示，细胞已长入电纺棉内部。部分区域细胞具有环形排列的特征。然而，组织细胞中空洞较多。Masson染色显示有松散的蓝色的胶原纤维沉积，沉积部位组织明显比无沉积部位致密。电纺膜支架移植后形成的血管由于支架与圆柱管难以剥离，因此取剥离出最具代表性的外层组织作冰冻切片。可见该组织工程血管仅最外层有疏松***包裹，内层电纺膜完全无细胞及细胞外基质，Masson染色表明组织中无胶原纤维沉积(图9)。

电纺棉支架皮下6w后形成的组织工程血管HE切片可见细胞已完全长入电纺棉内侧，血管壁全层组织紧密，尤其是橡胶支架侧细胞和细胞外基质密度较4w时明显增加。细胞外基质排列呈环形，基本形似天然血管中层的排列构象。Masson三色染色可见蓝色染色的胶原纤维沉积明显增厚且致密。紧实电纺膜支架组冰冻切片染色结果与4w无太大差异(图10)。

8组织平滑肌标记物检测

为了检测皮下形成的组织工程血管是否具有平滑肌细胞标记物阳性的细胞，实验通过组织冰冻切片免疫荧光染色平滑肌细胞标记物SM22，Calponin和SMA。结果表明，材料大鼠皮下移植4w后，构建的组织工程血管中存在大量细胞，其中多数细胞表达平滑肌细胞的特异性标记物SM22。Calponin+和SMA+细胞呈环形排列，是血管壁中负责营养供给的微血管壁染色(图11)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于制备组织工程血管的电纺棉，其特征在于，所述的电纺棉为聚己内酯电纺棉。

2.根据权利要求1所述的电纺棉，其特征在于，所述的电纺棉为大孔径平行聚己内酯电纺棉，电纺棉的孔径为20μm～100μm。

3.根据权利要求1所述的电纺棉，其特征在于，所述的电纺棉为30～40％的聚己内酯的三氟乙醇溶液通过静电纺丝获得的电纺棉。

4.根据权利要求3所述的电纺棉，其特征在于，所述的电纺棉通过如下方法制得：配置质量体积比为35％的聚己内酯的三氟乙醇溶液，然后以镂空的滚筒为收集装置进行静电纺丝，获得电纺棉。

5.根据权利要求1-4任一所述的电纺棉在制备组织工程血管的支架的应用。

6.一种组织工程血管支架，其特征在于，所述的组织工程血管支架为利用电纺棉构建的管状支架。

7.根据权利要求6所述的组织工程血管支架，其特征在于，所述的电纺棉为大孔径平行聚己内酯电纺棉。

8.根据权利要求6所述的组织工程血管支架，其特征在于，所述的组织工程血管支架的制备方法为：以圆柱体为内支撑，将大孔径聚己内酯电纺棉沿同一方向包绕于圆柱体表面，制成组织工程血管支架。

9.根据权利要求8所述的组织工程血管支架，其特征在于，所述的组织工程血管支架的制备方法为：配置质量体积比为35％的聚己内酯的三氟乙醇溶液，然后以镂空四骨架滚筒为收集装置进行静电纺丝获得电纺棉，以橡胶圆柱管为内支撑将电纺棉沿同一方向包绕于橡胶圆柱管表面，制成组织工程血管支架。

10.根据权利要求6-9任一所述的组织工程血管支架在制备组织工程血管中的应用。