CN106085933A - 一株重组大肠杆菌及其在制备具有人血型b抗原活性的n‑糖蛋白中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CEBO86，是将构建的重组质粒pACT3‑PglB和pBAD24‑malE^M共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中获得，该重组大肠杆菌的基因型为CLM24/p‑pglB+p‑malE^M，有能同时表达PglB和malE^M基因的功能。利用本发明所述重组大肠杆菌能够发酵制备具有人血型B抗原活性的N‑糖蛋白，且生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可实现N‑糖蛋白的大规模生产；制备获得的N‑糖蛋白具有良好的B抗原活性，可高效吸附人血浆中的抗B抗体，为通用血产品的制备提供新的选择方案，同时，可用于血型不兼容的器官移植，具有良好的工业开发和应用前景。

Description

一株重组大肠杆菌及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖 蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及一株重组大肠杆菌及其应用，尤其涉及一株重组大肠杆菌CEBO86及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用；属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。

背景技术

ABO血型***是人类血型***中最重要的一类。根据红细胞所含的特殊的抗原不同，该***分为A、B、AB和O四种血型。该血型***是由A、B两种抗原决定，它们是一种多糖抗原，在血小板以及内皮细胞上有分布。血型不相容是因为人体内产生有相应的抗体来对抗A或B抗原。这些抗体就像血凝素，它们能够引起血细胞凝集而消融，在大量输血或者进行器官移植过程甚至会造成死亡。移除血浆里的抗A或B抗体可克服因为不同血型之间进行的器官移植而引起的超敏排斥，因此，适时移除血浆里的抗A或B抗体是一种有效并切实可行的抗凝集和排异方法。目前，已有多种方法可去除血浆中抗A或抗B抗体，其主要根据这些抗体与相应抗原的特异性结合，利用免疫吸附的方式除去相应的抗体或者是抗体生成细胞，可用于ABO血型不合型的器官移植。常用的免疫吸附是将A或B血型抗原通过配糖类物质连接到琼脂糖基质上。值得一提的是，A或B血型抗原不仅仅很难获取，而且很难固定化，使得整个方法造价相当昂贵以致不能在资源匮乏、收入低下的国家得到很好地应用。因此亟需找到一种费用低、效率高的具有人血型抗原活性的糖抗原的生产方法。

目前，A、B血型抗原多数都是通过化学方法和生物酶法合成。其血型抗原糖链的化学合成不仅需要复杂的保护和去保护的操作，步骤繁杂，立体专一性不易控制，而且产率低。同时酶法合成中所用的相关糖基转移酶较难大批量获取，并且，酶促反应中活化的糖供体价格昂贵，这为血型糖抗原的酶法合成增加了困难。经检索，利用重组大肠杆菌制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白(大肠杆菌O86:H7N-糖蛋白)以及利用N-糖蛋白在去除血浆B抗体中的应用的文献还未见报道。

发明内容

针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。

研究证明，大肠杆菌O86:B7的O抗原与人B血型抗原结构相似，具有人B血型抗原活性(图1)。本发明的技术方案基于空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似的特点，采用在大肠杆菌O86:H7中过量表达来源于大肠杆菌中的malE基因(来源NEB公司的质粒pMAL-p5X)突变体和来源于空肠弯曲菌的pglB基因(PglB NCBI-GeneID:905417)，构建获得基因型为O86Δwaal/p-malE^M+p-PglB的重组大肠杆菌，并且在改良LB培养基中发酵生产具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白。

本发明所述的重组大肠杆菌菌株命名为重组大肠杆菌CEBO86，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：

构建含有PglB基因的pACT3-PglB的重组质粒和含有malE^M基因的pBAD24-malE^M的重组质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3-PglB和pBAD24-malE^M共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malE^M基因的重组大肠杆菌，其基因型为CLM24/p-pglB+p-malE^M，该菌株即为重组大肠杆菌CEBO86；

其中，所述malE^M基因来源于质粒pMAL-p5X，所述PglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTC 11168；

上述malE^M基因为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端***一段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得；

上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌O86的waaL基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为O86Δwaal。

进一步的，上述重组大肠杆菌CEBO86的构建方法概述：

1.waaL基因的敲除

基本方法是通过Red重组***在大肠杆菌E.coli O86中敲除基因waaL(寡糖基转移酶)。制得的缺失waaL基因的大肠杆菌E.coli O86Δwaal，命名为CLM24。

上述Red重组***，是通过质粒pKD46表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo，通过设计带有waaL基因同源臂的引物扩增带有筛选标记卡那霉素抗性基因的重组片段。然后通过电穿孔仪电击，将重组片段转入表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo的大肠杆菌中，重组片段在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原有的基因置换下来，而抗性基因通过表达FLP内切酶，从基因组上切除掉。

2.malE^M基因和PglB基因表达载体的构建

基本方法是以空肠弯曲菌基因组为模板，克隆pglB基因，将所克隆获得的pglB基因***质粒pACT3中，从而获得重组表达载体p-pglB；以质粒pMAL-p5X为模板，克隆malE^M基因，将所克隆获得的malE^M基因***质粒pBAD24中，从而获得重组表达载体p-malE^M。

3.N-糖蛋白发酵重组菌株的构建

基本方法是将所构建的重组质粒p-pglB和p-malE^M共转化大肠杆菌CLM24中，从而获得过量表达malE^M和pglB基因的重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CEBO86。

本发明所述重组大肠杆菌CEBO86在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。

具体的，利用重组大肠杆菌CEBO86制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的方法是：

1.摇瓶培养

挑取所构建的重组菌株CEBO86单菌落置装有3-5mL改良LB培养基的15mL的试管中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，壮观霉素终浓度为50μg/mL，在37℃，200-225r/min，培养12h。

将过夜培养的菌液按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有50mL改良LB培养基的100mL的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200-225r/min条件下培养。

待菌液OD₆₀₀＝0.4-0.6时，按照0.5-3％(v/v)的接种量接入装有1L改良LB培养基的3L的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200-225r/min条件下培养。

待菌液OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入终浓度为0.2％(v/v)的L-***糖和终浓度为100mM/L的IPTG，在16-37℃，200-225r/min条件下培养。

其中，上述加入L-***糖后，发酵温度优选28℃。

待培养4-6h后，补加一次终浓度为0.2％(v/v)的L-***糖，在200-225r/min，28℃继续培养14-16小时。

2.N-糖蛋白纯化

将摇瓶发酵的菌液以10,000-12,000r/min离心5-10min。离心所得沉淀用1mg/ml溶菌酶4℃处理1h。再以10,000-12,000r/min离心5-10min，收集上清用亲和镍柱纯化，收集N-糖蛋白的洗脱液，超滤脱盐。

检测结果：摇瓶发酵中N-糖蛋白的产量为1.5mg/L。

本发明公开了一株重组大肠杆菌CEBO86及其在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用，利用本发明提供的重组大肠杆菌发酵制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于具有人血型B抗原的N-糖蛋白的大规模生产；同时，本发明生产的人血型B抗原的N-糖蛋白具有良好的B抗原活性，可高效吸附人血浆中的抗B抗体，为通用血产品的制备提供新的选择方案，同时，可用于血型不兼容的器官移植，具有良好的工业开发和应用前景，应用价值巨大。

附图说明

图1.大肠杆菌O86:B7的O抗原与人B血型抗原结构图。

图2.基因敲除原理步骤示意图及waal基因敲除琼脂糖凝胶电泳检测。

图3.p-pglB表达载体图谱。

图4.p-malE^M表达载体图谱。

图5.SDS-PAGE分析MBP糖基化。MBP为malE^M基因表达的蛋白，MBP-OPS为糖基化的MBP。泳道1为MBP-OPS，泳道2为MBP。

图6.Western blot分析MBP糖基化。泳道1为MBP-OPS，泳道2为MBP。

图7.MALDI-TOF分析MBP糖基化。

图8.MBP-OPS与人血浆中抗B抗体特异性结合的ELISA检测。

图9.MBP-OPS去除人血浆中抗B抗体及其对凝血功能的影响。

图10.重组大肠杆菌CEBO86表达产物示意图。

具体实施方式

一般性说明：如下实施例所涉及的酶均购自Thermo公司，质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自天根公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。质粒pBAD24来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5α感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。所用人血液标本在受试者知情同意条件下取自正常成年人。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。

所述LB培养基为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

所述SOC培养基为：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl₂ 0.203g/L，MgSO₄ 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。

所述改良LB培养基为：蛋白胨10-20g/L，酵母粉5-30g/L，甘油1-10ml/L，NaCl5-10g/L。

实施例1、敲除大肠杆菌E.coli O86waal基因，构建大肠杆菌工程菌CLM24

(1)同源片段的克隆

利用Red重组***对目的基因进行敲除。

根据Genbank公布的waal基因序列设计引物如下：

pKD-waal F：

5’-TTGGAAAAGTTATCATCATTATAAAGGTAAAACATGCTAACATCCTTTAAACTTCATTCATTGAAACCTTACACTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’

pKD-waal R：

5’-GAGTTTTAACTCACTTCTTAAACTTGTTTATTCTTAATTAATTGTATTGTTACGATTATTAATGACGAGTAAGAGGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’

以pKD4通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。通过DpnI内切酶消化后，回收纯化浓缩同源重组片段。

(2)电转化感受态细胞的制备

(I)挑取带有pSIM19质粒的大肠杆菌O86，转入LB培养基中，同时加入100mg/L氨苄青霉素，30℃，200r/min，培养OD₆₀₀至0.4；

(II)42℃水浴15min，200r/min；

(III)冰浴15min，离心菌体，然后利用10％的甘油洗涤3次；

(IV)加入10％的甘油，浓缩至50倍，分装感受态。

(3)电转化，筛选重组子

(I)吸取8μg/ml的同源重组片段，加入100μl的感受态细胞中，混匀后转移至预冷的2mm电转杯中，轻甩至杯底部。调节电穿孔仪，2.5Kv，电击；

(II)加入900μl的SOC培养基，混匀后转移至无菌EP管中，37℃，120r/min，培养1h；

(III)涂布卡那霉素抗性平板，调取重组子利用

waal test F:GGTATGTAGGGCTCCAAGAG

waal test R:AATTTGGTCCCCGAATCATC

进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实waal基因已被卡那霉素抗性基因替换。

(IV)FLP位点特异性重组

将pCP20转入卡那霉素抗性克隆，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环沾取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的已将卡那霉素抗性基因消除。利用检测引物waal test F和waal test R进行进一步鉴定。

(V)获得敲除waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为O86Δwaal，命名为大肠杆菌CLM24。结果见图2。

实施例2、重组质粒pACT3-pglB、pBAD24-malE^M的构建

(1)pglB基因(PglB NCBI-GeneID:905417)表达载体的构建

根据NCBI公布的空肠弯曲杆菌NCTC 11168基因组序列设计引物：

pglB-F:

5’-CACGCCATGGTCTTGAAAAAAGAGTATTTAAAAAACCC-3’

pglB-R:

5’-ATTCCCGGGTCAATGATGATGATGATGATGAATTTTAAGTTTAAAAACTTTAG-3’

以NCTC 11168基因组为模板，PCR克隆pglB基因。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

将克隆的pglB基因片段分别利用限制性内切酶SmaI和SalI消化处理，同时将质粒载体pACT3也分别利用核酸内切酶SmaI和SalI消化处理。将消化处理的pglB基因片段和pACT3质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。

连接体系为10μl：

16℃连接12h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的LB培养基，37℃，100r/min，孵化1h，涂布氯霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证pglB基因的正确。从而获得重组质粒pACT3-pglB。

(2)malE^M(来源NEB公司的质粒pMAL-p5X)基因表达载体的构建

根据NCBI公布的质粒pMAL-p5x序列设计引物：

malE^M-F:

5’-TCCCCCGGGGGAAGGAGG CATAGATTATGAAAATAAAAACAGGTGC-3’

malE^M-R:

5’-GCGTCGACGTCTCAATGATGATGATGATGATGGGTCGCGTTCTGATCTCCTCCAGTGGCGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCGCCGCCGGTCGCGTTCTGATCTTCCAGC TGCGCGTCTTTCAGGGC-3’

其中：上述malE^M-R中含有表达糖基化序列的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体是：

5’-CTGGAAGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATCAGAACGCGACCGGCGGCGATC AGAACGCCACTGGAGGAGATCAGAACGCGACC-3’

以质粒pMAL-p5x为模板，PCR克隆malE^M基因。PCR反应体系如下：(引物浓度为20μmol/L)

PCR反应条件：97℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

将克隆的malE^M片段分别利用核酸内切酶SalI和HindIII消化处理，同时将质粒载体pBAD24也分别利用核酸内切酶SalI和HindIII消化处理。将消化处理的malE^M片段和pBAD24质粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后利用T4连接酶连接。

连接体系为10μl：

16℃连接12h后，将10μl的连接液转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

转化过程为：将10μl的连接液加入100μl的DH5α感受态细胞中，混匀。冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入900μl的LB培养基，37℃，100r/min，孵化1h，涂布氨苄青霉素抗性平板，培养16h，挑取转化子，提取质粒验证。然后进一步测序验证malE^M基因的正确。从而获得重组质粒pBAD24-malE^M。

实施例3、构建重组大肠杆菌菌株CEBO86和利用该菌株制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白的应用

(1)重组大肠杆菌菌株CEBO86的构建

制备CLM24的CaCl₂化学感受态细胞50ul加入5μL的重组质粒p-pglB，混匀冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，然后加入900ul LB培养基，37℃，120r/min恢复培养1h；4,000r/min离心2min，倒出部分上清，将剩下的菌体涂布Cam抗生素平板，37℃培养24h后挑取重组子验证。从而获得重组菌CLM24/p-pglB。

向制备的CLM24/p-pglB CaCl₂化学感受态细胞50μL加入5μL质粒p-malE^M，混匀冰浴30min，42℃水浴锅热激90s，冰浴2min，然后加入900μL LB培养基，37℃，120r/min恢复培养1h；4,000r/min离心2min，倒出部分上清，将剩下的菌体涂布Amp抗生素平板，37℃培养24h后挑取重组子验证。从而获得重组菌CLM24/p-pglB+p-malE^M，命名为重组大肠杆菌CEBO86。

(2)重组大肠杆菌的发酵

挑取所构建的重组菌株CEBO86(CLM24/p-pglB+p-malE^M)单菌落至装有5mL的改良LB培养基的25mL的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200r/min，培养12h。

将过夜培养的菌液按照1％(v/v)的接种量接入装有50mL改良LB培养基的100mL的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200-225r/min条件下培养。

待菌液OD₆₀₀＝0.6时，按照1％(v/v)的接种量接入装有1L改良LB培养基的3L的三角瓶中，其中氨苄青霉素终浓度为100μg/mL，氯霉素终浓度为25μg/mL，在37℃，200-225r/min条件下培养。

待菌液OD₆₀₀＝0.6时，加入终浓度为0.2％(v/v)的L-***糖和终浓度100mM/LIPTG，在28℃，200-225r/min条件下培养。

待培养6h后，补加一次终浓度为0.2％(v/v)的L-***糖，在28℃，200-225r/min条件下继续培养14h。

(3)N-糖蛋白的纯化

取1L发酵液经10,000r/min离心10min，收集菌体并用30mL的周质空间蛋白提取液(20mM Tris-HCl，20％(wt/vol)蔗糖，1mM EDTA，1mg/ml溶菌酶，pH 7.5)4℃处理菌体1h。12,000r/min离心30min，然后收集上清并加入到已用结合缓冲液(10mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，pH 7.4)预平衡过的5mL的亲和镍柱中。经过10个柱体积的结合缓冲液洗涤，用洗脱缓冲液(250mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液，pH7.4)洗脱，收集含N-糖蛋白的洗脱液。

将含有目的蛋白的洗脱液装入截留分子量为10kDa超滤管，4℃5,000g离心30min，弃去下管液体，向套管内加满脱盐缓冲液，4℃，5,000g离心30min。重复3次，至目的蛋白浓缩至2mL，并将咪唑充分除去。浓缩后的蛋白冻存于-70℃冰箱中。

实施例5、N-糖蛋白的鉴定

纯化的N-糖蛋白取样进行SDS-PAGE分析。MBP分子量在46KDa左右，与理论分子量相符。N-糖基化的MBP形成梯状条带，主条带分子量分布于50KDa与55KDa之间。由于SDS-PAGE灵敏度有限，有些糖蛋白的条带未显出。结果见图5。

利用Western Blot鉴定N-糖蛋白，分别采用anti-His、anti-MBP、anti-O157抗体作为一抗，选用合适的羊抗鼠或羊抗兔作为二抗，进行检测分析。N-糖基化的MBP由于添加了链长不等的O-抗原而显示出分子量比非糖基化的MBP大的梯状条带，证明MBP发生糖基化。结果见图6。

利用MALDI-TOF对N-糖基化的MBP及MBP进行分子量的鉴定。MBP分子量为45823Da，MBP主分子量分布于48790Da附近。结果见图7。证明利用重组大肠杆菌CEBO86发酵制备的蛋白为N-糖蛋白，命名为N-糖蛋白MBP_mut-OPS。

实施例6、N-糖蛋白的人血型B抗原活性

(1)N-糖蛋白与人抗B抗体的结合

不同浓度MBP、MBP-OPS(1μg/mL,2μg/mL,4μg/mL,6μg/mL,8μg/mL,10μg/mL和12μg/mL)包被96孔板，4℃过夜。2％BSA室温封闭2小时后，PBST(PBS,0.05％Tween-20)洗板三次，每次5分钟。一抗(抗A/抗B抗体，稀释度为1:20)室温孵育2小时候，PBST洗板3～5次，每次5分钟。加入羊抗鼠IgM(1:20000)，并室温孵育1小时。最后，加入TMB显色10～20分钟，并用1MHCl终止显色反应，酶标仪读取450nm的吸光度值。结果见图8。

(2)血浆抗B抗体滴度测定

采用凝聚胺试验测定血清血浆B抗体滴度。血浆倍比稀释，取10支EP管，每管各加入生理盐水100μL，在第一管加入待测血浆100μL，混匀后移出100μL，至第二管，同样操作稀释至第10管，从第10管吸出100μL暂时保留在另一支EP管仲。从第1管到到第8管的血浆稀释度依次是：1:2,1:4,1:8,1:16……1:1024。每管各加入2％的B红细胞悬液100μL，充分混匀；然后，各管加入凝聚胺试剂盒中的LIM液0.7ml，混匀后各加Polybrene溶液2滴，混匀，离心，加Resuspending液2滴重悬溶液，观察凝集情况，读取结果。以肉眼观察的最后一个“1+”的凝集管作为判断的终点，终点血浆稀释度的倒数为效价。

(3)MBP-OPS吸附人血浆抗B抗体

将终浓度为0,80,160and 320μg/mL的MBP_mut-OPS与800μL血浆混合，置室温1小时候，测定血浆中抗B抗体滴度，方法同实例6(2)；并应用全自动凝血功能分析仪测定样品血浆凝血参数。结果见图9

根据所得吸附B抗体结果可得出结论，本发明的重组大肠杆菌CEBO86生产的具有B抗原活性的N-糖蛋白有明显吸附去除人血浆中B抗体的作用，提示通过本发明的重组大肠杆菌可大量合成去除B抗体所需要的B抗原，为人血型B抗原的生产提供了新的选择，且其具有成本低，产率高的特点。预示本发明的重组大肠杆菌可作为生人血型B抗原的工厂，具有良好的应用前景。

Claims (2)

1.一株重组大肠杆菌，该菌株命名为重组大肠杆菌CEBO86，其特征在于：所述重组大肠杆菌由如下方法制得：

构建含有PglB基因的pACT3-PglB的重组质粒和含有malE^M基因的pBAD24-malE^M的重组质粒，然后将上述构建的重组质粒pACT3-PglB和pBAD24-malE^M共转化已缺失waal基因的大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达PglB和malE^M基因的重组大肠杆菌，其基因型为CLM24/p-pglB+p-malE^M，该菌株即为重组大肠杆菌CEBO86；

其中，所述malE^M基因来源于质粒pMAL-p5X，所述PglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTC11168；

上述malE^M基因为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端***一段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的表达糖基化序列的基因所得；

上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌O86的waaL基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为O86Δwaal。

2.权利要求1所述重组大肠杆菌在制备具有人血型B抗原活性的N-糖蛋白中的应用。