CN106084030B - 一种提高白细胞介素il-34热稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高白细胞介素IL‑34热稳定性的方法,属于生物技术领域。所述方法通过对人源IL‑34cDNA中编码98号丝氨酸的密码子agc,定点突变为编码半胱氨酸的密码子tgt;将含有S98C IL‑34突变体编码序列的转移质粒与BacVector‑3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞来制备表达S98C IL‑34的杆状病毒;再使用杆状病毒转导HEK 293细胞表达S98C IL‑34。所述方法获得的S98C IL‑34与native IL‑34相比,热稳定性得到提升。经过M‑NFS‑60细胞增殖实验和CSF‑1R磷酸化实验,证明S98C IL‑34活性与native IL‑34没有显著差别。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高白细胞介素IL-34(interleukin-34,IL-34)热稳定性的方法,具体地说,涉及一种通过氨基酸定点突变提升IL-34热稳定性的方法,属于生物技术领域。
背景技术
白细胞介素-34(interleukin-34,IL-34)是一个新近发现的细胞因子(HaishanLin et al.Science 2008)。它是集落刺激因子-1受体(colony-stimulating factorlreceptor,CSF-1R)的一个新配体,它能特异识别并独立激活CSF-1R。IL-34发挥生物活性的形式为二聚体形式,生物二聚体的分子量50KD,每个单体的分子量为25KD,单体的氨基酸序列为:
IL-34自从被识别为CSF-1R的新配体以来,它的功能以及结构已经被深入的研究。IL-34虽然有着与CSF-1相似的激活CSF-1R的效应,但是激活效应更强,半衰期更短(Eda Het al.Cytokine.2010)。在许多组织都能分泌IL-34,但以脾脏的分泌为主导(Clavel G etal.Joint Bone Spine.2013)。IL-34能促进单核细胞的存活,增殖以及分化成巨噬细胞。IL-34也能促进破骨细胞生成。有研究表明,类风湿性关节炎患者关节液中的IL-34水平相比一般的关节炎患者有提升,同时IL-34在滑膜以及关节液中的表达水平与炎症的严重程度成正相关(Baud’huin M et al.J Pathol 2010;Hwang S-J et al.ArthritisRes Ther2012)。
虽然IL-34有着与CSF-1相似的激活CSF-1R的能力,但研究指出它们的功能是不重叠的,它们的表达方式存在时空差异(Wei,S.et al.J.Leukoc.Biol.2010)。TetsuyaMizuno报道IL-34能够选择性的增强小鼠小胶质细胞对于神经毒性的修复能力(TMizuno.et al.Am J Pathol.2011)。同时有研究通过IL-34LacZ/LacZ小鼠模型,发现IL-34具有组织限定性(Wang,Y.et al.Nat Immunol.2012)。该研究发现IL-34主要由皮肤和中枢神经***分泌,在IL-34缺失时,上皮的朗格汉斯细胞发育受到影响而使小鼠出现接触过敏症状,而缺少IL-34的小神经胶质细胞会在数量上受到影响,削弱小胶质细胞对于中枢神经***的保护能力。这个研究展示出IL-34在神经保护和修复方面具有成药潜力。
IL-34在神经元修复中展现的有意义影响使得IL-34具有了成药可能性(Wang,Y.et al.Nat Immunol.2012)。对于蛋白类药物,保质期以及在体内的半衰期是能否成药的重要条件,这些条件都与蛋白的热稳定性有关系。一个新的细胞因子如果要成为上市药物,必须要提升蛋白的稳定性,但是自发现以来尚无提升IL-34热稳定性的方法。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷,本发明的目的在于提供一种提高IL-34热稳定性的方法,所述方法通过对IL-34进行氨基酸定点突变来提高IL-34的热稳定性,在提高IL-34热稳定性的同时,保持了IL-34的生物活性,让IL-34具有更大的成药潜力。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一种提高IL-34热稳定性的方法,所述方法通过对IL-34进行氨基酸定点突变,将IL-34的98号丝氨酸突变成半胱氨酸来提高IL-34的热稳定性,下文中,用S98C IL-34指代98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸的IL-34,所述S98C IL-34单体的氨基酸序列如下:
所述方法具体步骤如下:
将GeneBank ID:NM_152456的表达蛋白质的IL-34 cDNA中表达98号丝氨酸的密码子agc,采用基因定点突变为表达半胱氨酸的密码子tgt;将突变后的S98C IL-34 cDNA与BacVector-3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞来制取表达S98C IL-34的杆状病毒;再使用杆状病毒感染HEK 293细胞表达S98C IL-34。
有益效果
1.本发明提供了一种提高IL-34热稳定性的方法,所述方法基于已有的IL-34结构(PDB ID:4DKC)分析,发现在蛋白核心处98号丝氨酸残基与168号半胱氨酸残基距离很近,两者Cα的距离为为了提升IL-34的热稳定性,将IL-34的98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸,下文用native IL-34指代未突变的IL-34,S98C IL-34指代98号丝氨酸残基突变成半胱氨酸的IL-34;
2.本发明提供了一种提高IL-34热稳定性的方法,所述方法通过蛋白晶体技术结晶S98C IL-34蛋白并解析其结构,从晶体结构层面证实S98C IL-34突变成功,并证实在98号半胱氨酸与168号半胱氨酸之间形成了native IL-34不具备的二硫键;
3.本发明提供了一种提高IL-34热稳定性的方法,所述方法获得的S98C IL-34与native IL-34相比,Tm(melting temperature)提升了7.6℃,说明S98C IL-34相比nativeIL-34热稳定性得到了提升。同时经过M-NFS-60细胞的增殖实验和CSF-1R的磷酸化实验,证明S98C IL-34的生物学活性与native IL-34没有显著差别。
附图说明
图1为PCR程序设置示意图。
图2为Native IL-34和S98C IL-34的SDS-PAGE鉴定图。
图3为Native IL-34和S98C IL-34经分子筛***纯化图。
图4为条件优化后得到的S98C IL-34晶体。
图5为S98C IL-34晶体结构(左)与native IL-34晶体结构图(右)。
图6为S98C IL-34晶体结构的单体中Cys98-Cys168二硫键的Fo-Fc差值电子密度图(左:A链;右:B链;Fo-Fc level=3.0)。
图7为native IL-34在不同温度下的同步辐射CD图谱。
图8为S98C IL-34在不同温度下的同步辐射CD图谱。
图9为Native IL-34和S98C IL-34的二态转化平衡拟合图。
图10为S98C IL-34和native IL-34刺激M-NFS-60细胞增殖的浓度依赖曲线图。
图11为S98C IL-34和native IL-34激活产生磷酸化的CSF-1R(pCSF-1R)与细胞内总体CSF-1R(Total CSF-1R)的Western blot条带图。
图12为S98C IL-34和native IL-34激活产生磷酸化的CSF-1R(pCSF-1R)与细胞内总体CSF-1R(Total CSF-1R)的Western blot条带的灰度比值柱状图。
图13为不同种属的IL-34的氨基酸序列比对图(参考Uniprot数据库,用单字母表示氨基酸)。
具体实施方式
实施例1
1.表达质粒的构建
材料:
IL-34的cDNA购自Origene公司。所使用的克隆载体为BacMam载体。
实验所用的大肠杆菌菌种为DH5α菌株,购自鼎国生物公司。
PCR引物由北京三博远志公司合成。
PCR相关试剂:Vent DNA聚合酶(NEB),dNTP mixture(NEB),MgSO4(NEB),DMSO(NEB),10×PCR buffer(NEB)。
DNA克隆相关试剂:琼脂糖(invitrogen),限制性内切酶(NEB),T4 DNA ligase(NEB),凝胶回收试剂盒(Promega),质粒小提试剂盒(Promega),核酸染料GelRed(Biotium)。
细菌培养试剂:酵母提取物(OXOID),蛋白胨(OXOID),氨苄青霉素(Amresco),LB-Agar(Sigma-Aldrich)。
实验用超纯水由Milli-Q纯水***制备。
方法和结果:
(1)从cDNA中扩增基因片段
此步骤主要使用聚合酶链式反应(PCR)来扩增及定点突变IL-34cDNA,以生成native IL-34和S98C IL-34的基因。PCR实验的反应体系总体积为50μL。体系组分如表1,PCR程序设置如图1表示,PCR引物见表2。
表1 PCR反应体系组分
表2 PCR引物
(2)PCR产物的回收提纯
PCR实验结束后,取5μl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,以确定PCR反应是否成功扩增目的条带。琼脂糖凝胶电泳的设置参数为电压100V,电泳时间30min。
琼脂糖凝胶电泳后,使用Promega公司的PCR产物回收试剂盒提取产物中的目的基因。提取步骤按照试剂盒说明书进行。
(3)目的基因的双限制酶切及连接
使用限制性剪切酶处理纯化后的产物以及载体质粒BacMam。根据引物设计时的酶切位点选择相应限制性剪切酶,实验中使用的限制性剪切酶包括BamHI,NotI,XhoI等,反应体系如表3。
表3 双限制连接酶实验组分
将酶切反应体系置于37℃水浴3h。然后使用琼脂糖凝胶电泳得到酶切好的目的产物条带以及载体质粒条带。使用Promega公司的DNA回收试剂盒提取凝胶中的目的基因与载体质粒。提取步骤按照试剂盒说明书进行。
双限制性酶切处理后,将目的基因与载体质粒连接,反应体系见表4。反应在室温下进行60min。
表4 目的基因与载体连接的反应组分
(4)连接产物的转化
将连接产物加入从-80℃冰箱里取出后加入刚刚融化的100μl DH5α感受态细胞中,在冰上静置30min。然后在42℃水浴中热激90s,迅速转移至冰上放置2min左右。在超净台中加入800μl SOC培养基,放入37℃、5rpm摇床中复苏40min。最后将菌液均匀涂布在加有氨苄青霉素的LB平板上进行抗性筛选,在37℃培养箱中放置14~16h。
(5)阳性克隆的筛选
挑取单菌落接种于添加有氨苄青霉素的3ml LB培养基中,放入37℃、180rpm摇床中培养12~14h。利用Promega质粒小提试剂盒提取质粒,并进行酶切鉴定,选取鉴定结果为阳性的克隆进行基因测序,测序工作测序公司完成。将测序结果正确的质粒保存于-20℃冰箱中备用。
2.重组蛋白的表达
材料:
本实施例中用于病毒扩增的的细胞系为sf9昆虫细胞,用于表达蛋白的细胞系为HEK293细胞。
表5 用于病毒制备和蛋白表达的真核细胞系
昆虫细胞培养基包括:Grace,SF-II 900(Gibco)
哺乳动物细胞培养基:DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco),青链霉素(Gibco)
转染试剂:Cellfectin(Invitrogen)
方法:
(1)利用昆虫细胞制备重组杆状病毒
①取对数生长期的sf9细胞,使用台盼蓝染色法染色。当存活率在98%(即98%以上的细胞没有被台盼蓝染色)时,取sf9细胞加入6孔板中,让每孔中细胞总数约1.0×107个,体积约为2ml。将6孔板放入27℃培养箱中静置贴壁1h。
②取测序阳性的质粒6μl与2μl BacVector-3000杆状病毒DNA混合,孵育5min。取10μl Cellfectin转染试剂与100μl无双抗SF900昆虫培养基混合均匀。将上述两种混合液混合均匀,孵育30min。
③sf9细胞贴壁后,弃去原培养基,换成无双抗sf900培养基,并加入步骤2中的混合液。放入27℃培养箱中静置培养6h。
④6h后,将六孔板中的无双抗培养基替换成有双抗的sf900培养基。继续在27℃培养箱中静置培养。
⑤7d后,收获每孔的上清液,即为对应质粒的P1病毒。P1病毒滴度低,主要用于扩增P2病毒或者储存于-80℃冰箱中保存。
⑥将P1病毒按1∶1000的体积比感染对数生长期的sf9细胞。让细胞在27℃培养箱中继续振摇培养。
⑦感染约4d左右,当观察到细胞已经生长停滞,细胞变大,并且约半数细胞崩解后,收获细胞的上清,即得P2病毒,保存于4℃中以备使用。
⑧如有需要,可以利用P2病毒按照步骤6,7来制备大批量的P3病毒。
(2)利用哺乳动物细胞表达蛋白
此步骤将利用人胚胎肾细胞,即HEK293细胞表达蛋白。
①将HEK293细胞培养至密度约为3.0×106个/ml,并用台盼蓝染色法确保细胞存活率在90%以上。
②将P2或P3病毒适量的加入HEK293细胞中,72h后,离心弃去细胞,收集上清培养基。使用切向流超滤***对培养基进行浓缩并不断加入HBS缓冲液,使目的蛋白的环境从DMEM培养基交换到HBS缓冲液。
③将交换浓缩之后的目的蛋白溶液使用高速离心机,13000g离心20min,以清除溶液中的细胞碎片。
(3)利用亲和层析提取目的蛋白
此步骤利用设计蛋白时C末端加入的6个组氨酸标签(-HHHHHH),采用Ni-NTA琼脂糖凝胶颗粒为固定相,对目的蛋白进行洗脱提纯。
①将适量偶联Ni-NTA的琼脂糖凝胶颗粒加到高速离心后的蛋白溶液中,4℃孵育1~2h。
②用含有20mM咪唑的清洗缓冲液清洗Ni-NTA琼脂糖凝胶颗粒,以洗去不与Ni-NTA络合的非目的蛋白。
③使用含有40mM以及300mM咪唑的洗脱缓冲液对Ni-NTA琼脂糖凝胶颗粒进行洗脱,收集洗脱液,置于4℃冰箱保存。
(4)利用SDS-PAGE检测目的蛋白
此步骤利用不同分子量的蛋白在SDS-PAGE蛋白电泳中前进的距离不同,从而鉴定洗脱的蛋白是否为目的蛋白。
①取5μl经亲和层析纯化的蛋白样品加入5×上样缓冲液,混匀,95℃加热5min,蛋白充分变性后,于室温冷却。
②用微量加样器定量吸取经SDS变性的蛋白样品,加入电泳胶的加样孔中。
③设置电压140V,电泳时间约90min,待电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘时,停止电泳。
④小心取下凝胶,放入盛有考马斯亮蓝R-250染色液的器皿中,盖好皿盖,在摇床上于室温染色过夜。
⑤将凝胶移入盛有脱色液的器皿中,于室温下在水平振荡摇床上振荡脱色,直至凝胶背景干净透明,蛋白条带显色良好为止。
⑥依据蛋白Marker的指示,鉴定所得蛋白是否为目的蛋白。
结果:
native IL-34和S98C IL-34表达成功,单体分子量为25KD,符合预期,SDS-PAGE结果参见图2。
3.蛋白纯化鉴定
材料:
0.22μm滤膜(PALL)
超滤离心管(截留分子量为10000)(Merk)
GE AKTA FPLC蛋白纯化***
GE superdex-200分析筛凝胶层析柱
方法:
(1)经过SDS-PAGE的鉴定后,将相同的蛋白合并。使用截留分子量为10000的超滤离心管将目的蛋白进行适当浓缩,以减少分子筛***的上样次数。
(2)将浓缩好的蛋白样品用高速冷冻离心机离心,离心参数为4℃,13000rpm,离心时间为10min。
(3)准备分子筛纯化***的流动相。所有用于分子筛纯化***的超纯水、缓冲液、以及储存液(20%乙醇),用孔径为0.22μm的滤膜过滤,然后用真空泵抽气10min,以排尽液体内的气体。
(4)将GE superdex-200分析筛柱连接上纯化***后,设置***流速为0.5ml/min,压力上限为1.5MPa,使用超纯水冲洗一个柱体积,再使用HBS洗脱缓冲液平衡一个柱体积。
(5)蛋白样品上样前,先使用HBS缓冲液清洗上样环,上样后,让***开始洗脱,设置接样体积为1ml、洗脱体积为1.2个柱体积。
(6)将收集到的纯化液按进行SDS-PAGE实验,鉴定蛋白是否纯化成功。
结果:
native IL-34和突变体S98C IL-34均能经过分子筛纯化***纯化,洗脱峰集中于15~17ml,参见图3。
4.S98C IL-34蛋白晶体结构测定
材料:
结晶条件筛选试剂盒:包括Hampton、Wizard、Proplex、Memstart、Memsys这五个商用筛选试剂盒。每个试剂盒包含96种筛选条件。
用于配置结晶条件优化的各类试剂:
NaCl(Sigma-Aldrich),Na-Citrate(Sigma-Aldrich),LiSO4(aladdin),Na2HPO4(国药集团),KH2PO4(国药集团),PEG系列(Sigma-Aldrich),CHES(Sigma-Aldrich),Tris(Genview),(NH4)2SO4(Alfa Aesar),NaAc(Amresco),MgCl2(Sigma-Aldrich),CaCl2(国药集团)。
方法及结果:
使用结晶条件筛选试剂盒,用座滴法在20℃筛选S98C IL-34的结晶条件。待S98CIL-34结晶后,按照筛选的结晶条件进行优化,优化的结晶条件如表6,S98C IL-34的蛋白质晶体如图4。
表6 6017晶体的优化条件
晶体衍射数据的收集工作在北京高能物理所同步辐射装置(BSRF)完成。用HKL2000软件处理衍射数据,用CCP4软件解析晶体结构。得到S98C IL-34的晶体结构与native IL-34的结构没有明显差异(图5)。Fo-Fc差值电子密度图表明S98C IL-34的第98号残基已经突变成半胱氨酸,并与第168号半胱氨酸残基形成二硫键(图6)。
5.同步辐射光源圆二色谱法(CD)测量热稳定性
仪器和材料:
(1)仪器
同步辐射圆二色谱所使用的仪器位于BSRF的4B8真空紫外光束线(BSRF 4B8 VUVbeamline),该束线能提供125~360nm的真空紫外和紫外光、4~90℃的温度范围用于圆二色谱测试。
实验站提供的石英样品池包括不同的光程:0.01mm,0.1mm,0.2mm,1mm。其中光程1mm的样品池,容积为350μL。光程0.1mm的样品池,容积约为数十微升。实验中,我们使用的是光程为0.1mm的样品池。
实验站圆二色谱仪器的控制采集软件为BSRF 4B8 VUV Station。通过软件的控制界面,可以直接选择圆二色谱扫描的起始与终止波长,扫描波长的间隔,每次扫描的次数以及恒温时间等,因此可以通过控制软件来设置参数进行自动的连续变温实验。
(2)实验样品
实验为表达的native IL-34和S98C IL-34重组蛋白。
样品准备时将PBS中原来的NaCl更换成NaF,以减少Cl-对于圆二色谱的干扰。
方法:
(1)装样
实验中使用的样品池光程为0.1mm。
样品池由两片圆形石英玻璃叠合而成。两片石英玻璃在盖合时,标记的区域严格贴合在一起。在装样完毕,两片样品池玻璃按标定位置叠合并严格确认没有气泡后,将样品池装入样品架。
样品池装入样品架时,样品池的叠合点对应样品架的外侧凹槽。然后将组装好的样品架放入样品室,之后盖上样品室的保温罩,并合上样品室的盖子。
(2)光谱测量
实验中的溶液组分为native IL-34和S98C IL-34的浓度分别为80μM,变性剂盐酸胍的浓度为1M,溶液缓冲体系为PBS,PBS中的NaCl被替换成NaF。
变温过程中,设置10个温度点,分别为:25℃,35℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃,70℃,75℃,80℃,到达最高温度点载返回25℃的最低点进行一次测量。每个温度点恒温时间为5分钟,让蛋白充分加热。每次测量的波长范围为200nm~260nm,扫描间隔为1nm,每个温度点测量三次。
结果:
同步辐射圆二色谱仪器记录同一个温度所有三次测量的读数,因此同一个温度下会有三组实验数据,实验得到的原始数据图像见图7和图8。
选取原始数据中的222nm的椭圆率计算出的去折叠成分FU为因变量(等式A),温度为自变量,使用二态转化平衡公式(Jackson.et al.Biochemistry.1991;Nicholson.etal.Biochemistry.1996;等式B)来拟合native IL-34和S98C IL-34的Tm。
其中,[θ]N为起始温度时蛋白处于100%折叠状态下的CD值,[θ]为不同温度下的CD值,[θ]D为蛋白已经100%变性去折叠的CD值。
其中,R为理想气体常数,R=1.987cal/(K·mol),T为蛋白质所处的温度,Tm为蛋白质在热变性过程中的melting temperature,ΔHm为温度处在Tm时蛋白质的焓变。
表7 native IL-34和S98C IL-34的二态转化方程的求解结果
拟合结果如表7,拟合曲线参见图9。
根据拟合计算结果,native IL-34的Tm为50.9℃,S98C IL-34的Tm为58.5℃,S98CIL-34的Tm相比native IL-34提高了7.6℃,说明本实施例的突变体S98C IL-34的热稳定性优于native IL-34。
6.细胞增殖实验
材料:
M-NFS-60细胞
用于M-NFS-60细胞复苏以及传代的rhCSF-1购自Gibco以及义翘神州。使用的培养基配方为:
PRMI 1640培养基(Gibco)
10%胎牛血清(Gibco)
100U/ml penicillin&streptomycin(Gibco)
60ng/ml rhCSF-1
方法:
(1)用含rhCSF-1的培养基悬浮培养M-NFS-60细胞至对数期,再在无rhCSF-1培养基中饥饿24小时;
(2)将细胞按照每孔0.1×106个加入到96孔全不透光白板中;细胞分为四组,只加PBS为阴性对照组,rhCSF-1为阳性对照组,实验组为native IL-34、S98C IL-34两组。加入蛋白的浓度梯度为:
10-3,10-2,10-1,100,101,102,103,104,105(ng/ml)
(3)将细胞放入37℃二氧化碳培养箱悬浮培养;3d后使用CellTiter-Glo试剂盒处理细胞,并使用Flexstation荧光测量仪测量相对荧光读值(relative light units,RLU)。
细胞样品的RLU分别对rhCSF-1、native IL-34、S98C IL-34的剂量依赖关系曲线如图10所示;推算出三者促细胞增殖的EC50值如表8所示。
表8
其中,native IL-34、S98C IL-34的EC50浓度分别为1066ng/ml和973ng/ml说明S98C IL-34和native IL-34促M-NFS-60细胞增殖的能力相近。
7.S98C IL-34和native IL-34激活CSF-1R能力的对比
材料:
此步骤中用于转染表达全长CSF-1R的宿主细胞为HEK293细胞。
一抗为兔源CSF-1R抗体(anti-CSF-1R),兔源磷酸化CSF-1R抗体(anti-phosphoCSF-1R-Tyr723),均购自CST。
二抗为山羊抗兔IgG抗体(碧云天)。
细胞裂解液(碧云天)
方法:
(1)取37℃二氧化碳培养箱中正常生长的HEK293细胞,等量分入六孔板中,每孔细胞数为1.0×106。在每孔中加入等量且适量的CSF-1R杆状病毒。
(2)72h后使用无血清DMEM将每孔细胞洗细胞两遍,并将细胞置于无血清DMEM中饥饿16h。
(3)将细胞分为三组:实验组为native IL-34和S98C IL-34,每孔加入蛋白至其终浓度为5μg/ml;阴性对照组细胞中仅加入PBS。
(4)5min后将细胞离心,并用4℃ PBS洗三遍,然后在裂解液冰上裂解30min。
(5)取细胞裂解液于Nanodrop蛋白定量仪上定量,确保每个上样孔的蛋白量相同,然后进行SDS-PAGE电泳。
(6)SDS-PAGE结束后,对电泳胶进行Western blot处理。其中一抗(anti-CSF-1R和anti-phosphoCSF-1R-Tyr723)稀释度为1∶1000,孵育2h;二抗稀释度为1∶2000,孵育时间为50min。然后进行曝光处理,收集图像结果。
结果:
图11以及图12表明S98C IL-34和native IL-34突变体激活CSF-1R自磷酸化的能力没有明显差异,从而说明S98C IL-34与native IL-34具有相近的生物学活性。
8.S98C IL-34分子内部二硫键Cys98-C168的保守性分析
如图13的灰色区域所示,人源IL-34(Uniprot ID:Q6ZMJ4)的Ser98和Cys168在其他物种的IL-34(小鼠Q8R1R4、牛A6QL48、大鼠Q4KM46、斑马鱼L8AZT5、黑猩猩H2QBG6、猫M3XD55、大熊猫G1L622)中绝对保守。在其他物种IL-34中与人源IL-34的98和168号残基同源的位置上引入二硫键,以提高其热稳定性的做法,视为与在S98C IL-34分子内部引入二硫键Cys98-C168提高热稳定性的原理相同,属于本发明的保护范围。
虽然结合了附图描述了本发明的实施方式,但是对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些也应视为属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种提高白细胞介素IL-34热稳定性的方法,其特征在于:所述方法通过对人源IL-34进行氨基酸定点突变,将人源IL-34的98号丝氨酸突变成半胱氨酸,即S98C IL-34,S98CIL-34的氨基酸序列如下:
2.一种提高白细胞介素IL-34热稳定性的方法,其特征在于:所述方法通过杆状病毒-哺乳动物细胞表达***制备IL-34突变体,在本方法中,将GenBank ID:NM_152456的表达蛋白质的IL-34 cDNA中编码98号丝氨酸的密码子agc,采用基因定点突变为编码半胱氨酸的密码子tgt;将突变后的S98C IL-34 cDNA克隆至转移载体BacMam,获得的转移质粒与BacVector-3000杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞,以制备S98C IL-34的重组杆状病毒;再使用重组杆状病毒转导HEK 293细胞表达S98C IL-34。
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