CN106084017B - 一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法 - Google Patents

一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括：定点突变詹氏甲烷球菌的酪氨酸‑tRNA合成酶获得MjpPpaRS基因，将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS；将重组质粒pIVEX2.4c‑MjpPpaRS和pUC‑MjtRNA转化至大肠杆菌BL21，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；以pIVEX2.4c‑AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变；向无细胞表达体系中添加去污剂可溶表达编入pPpa的AQPZ蛋白，利用亲和层析纯化获得定点编入pPpa的AQPZ蛋白。本发明利用大肠杆菌无细胞体系生产编入pPpa的AQPZ蛋白并利用亲和层析纯化获得该目标蛋白，非天然氨基酸的嵌入使得该水通道蛋白与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。

Description

一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的 方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法。
背景技术
生物体由64个密码子来编码20种天然氨基酸和3个终止信号。由于20种天然氨基酸所含的功能基团有限，无法满足生物科学、化学研究和应用中对蛋白质结构和功能的需求。基因编码非天然氨基酸技术已可将70多种非天然氨基酸成功编码蛋白质，某些非天然氨基酸的加入可增强蛋白性能、稳定蛋白结构、甚至产生新的功能。这些UAAs含有酰胺基、硝基、磷酸根、磺酸酮基、醛基、叠氮、炔基和烯基等多样性功能基团，可进行多种修饰反应，如光化学、糖基化和荧光显色等反应，从而使得基因编入非天然氨基酸技术被广泛应用。
无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外***。相对于体内表达体系，大肠杆菌无细胞体系可以很好的解决膜蛋白表达引起的细胞毒性问题。
大肠杆菌水通道蛋白Z(AQPZ)属于水通道蛋白中的orthodox aquaporin亚族，透水性和选择性都非常高。由于AQPZ来自于大肠杆菌，相对于来源于哺乳动物细胞的水通道蛋白更易于在大肠杆菌中进行表达，因此对AQPZ的制备和膜过滤应用研究受到更为广泛关注。传统生物仿生膜以流动镶嵌模式将AQPZ嵌入两亲性双嵌段聚合物或天然磷脂双分子层中，但这种以疏水作用嵌入的水通道蛋白较易流失，从而影响整个膜的使用性能与寿命。本专利将非天然氨基酸基因编入AQPZ水通道蛋白，为含水通道蛋白的生物仿生膜制备提供蛋白基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：
(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得MjpPpaRS基因(SEQ NO.1)，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得重组质粒p15a-MjpPpaRS；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA。
(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；
(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；
(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；
(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4c-AqpZTAG加入步骤(2)获得的大肠杆菌无细胞体系中表达；
(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。
本发明在水通道蛋白AQPZ中定点基因编入非天然氨基酸pPpa，打破水通道蛋白在天然氨基酸的局限，为多样的生物仿生膜制备方法提供更为丰富蛋白基础，扩宽思路。因编入pPpa的AQPZ蛋白的高疏水性会对大肠杆菌细胞产生的毒害作用，导致编入pPpa的AQPZ蛋白在大肠杆菌体内难以表达，利用大肠杆菌无细胞体系开放性的特点可有效避免目标蛋白对宿主细胞的损害；通过向大肠杆菌无细胞体系中添加去污剂，提高目标蛋白的可溶性表达效率，利用pIVEX2.4c-AqpZTAG所带的6his亲和标签，可以高效的利用亲和层析纯化编入pPpa的AQPZ蛋白重组蛋白，为制备高稳定性的生物仿生膜提供了蛋白基础。
附图说明
图1：载体pIVEX2.4c-AqpZTAG结构示意图。
图2：无细胞体系表达pPpa编入的AQPZ的电泳图；
Lane 1：蛋白markers；Lane 2：不添加pPpa的表达沉淀；Lane 3：不添加pPpa的表达上清；Lane 4：添加pPpa沉淀；Lane 5：添加pPpa上清；Lane 6：阴性对照沉淀；Lane 7：阴性对照上清；Lane 8：加pPpa和pIVEX2.4c-MjpPpaRS沉淀；Lane 9：加pPpa和pIVEX2.4c-MjpPpaRS上清。
图3：停留光谱光散射测定AQPZ和P-AQPZ的透水效率。
具体实施方式
本发明的转化细胞通过公知的氯化钙法制得。上述载体通过公知的热击法导入感受态细胞。无细胞体系是以外源mRNA或DNA为模板，在抽提物的酶系中补充底物和能量来合成蛋白质的体外***。本发明所涉及的无细胞体系是按实例中所描述的方法制备。蛋白中含有6his亲和标签，可使用亲和层析进行纯化。基于以上原理，一种利用大肠杆菌无细胞体系在水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法包括以下步骤：
(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得MjpPpaRS基因(SEQ NO.1)，使其可催化非天然氨基酸对丙炔氧基-L-苯丙氨酸(p-propargyloxyphenylalanine,pPpa)合成对应氨酰tRNA，获得重组质粒p15a-MjpPpaRS；将MjtRNA的基因(SEQ NO.2)克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA。
(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转化大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；
(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，得到重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；
(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；AqpZTAG的基因序列见SEQ NO.3。
(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4c-AqpZTAG加入步骤(3)获得的大肠杆菌无细胞体系中表达；
(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1，MjpPpaRS基因的获得，包括以下步骤：
1.以p15a-MjtyrRS为模板，利用RS F2/RS R4和RS F4/RS R2两对引物通过PCR扩增获得两个DNA片段，将这两个DNA片段同源重组得到含三个位点突变(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala)的氨酰tRNA合成酶质粒。以上述突变质粒为模板，利用RS F1/RS R3和RS F3/RS R1两对引物，进行第二轮突变获得包含5个位点(Tyr32Ala/Glu107Pro/Leu162Ala/Phe110Ala/Asp158Ala)突变的M.jannaschii tyrosyl-tRNA synthetase(TyrRS)，突变后的氨酰tRNA合成酶命名为MjpPpaRS，获得p15a-MjpPpaRS质粒。引物基因序列如表1所示。
表1突变所用引物
2.PCR反应条件为：PCR条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，70℃延伸5min，循环数为32个，70℃延伸10min。最后4℃降温至冷却取出。
实施例2，大肠杆菌无细胞体系抽提物的制备，包括以下步骤：
1.将重组载体p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转化大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子；
2.从平板上挑取重组大肠杆菌BL21(DE3)/p15a-MjpPpaRS/pUC-MjtRNA单菌落接种于5mL LB培养基中，加入终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素(Amp)。37℃摇床200rpm培养过夜。
3.将步骤2培养后的全部种子液分别转接至两瓶500mL的无细胞发酵培养基中，加入终浓度为50μg/mL的Amp。
4.37℃，200rpm培养至菌浓OD600至0.8-1之间时，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导，直至菌浓OD600达到3-4，即可收菌。
5.将步骤4获得的两种菌液分别倒入500mL离心瓶后，4℃，6000g离心30min收集菌体，倒去上清。
6.用预冷的Buffer 1(10mM Tris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁，1mMDTT，7mMβ-ME)重悬菌体，每1g菌体加入16.6mL Buffer 1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。
7.重悬后，4℃，5000g离心20min，倒去上清。
8.用预冷的Buffer 1重悬菌体，每1g菌体加入6.6mL Buffer 1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。
9.重悬后，4℃，5000g离心20min，倒去上清。
10.用预冷的Buffer 2(10mM Tris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁，1mMDTT)重悬菌体，每1g菌体加入1.3mL Buffer 1。用手摇或振荡离心瓶，整个过程在冰上进行。
11.用高压细胞破碎仪6000psi破碎菌体细胞。
12.破胞液在4℃，30000g离心30min，将上清转移至新的离心管，再次4℃，30000g离心30min，取上清(抽提物)。
13.转移上清至15mL离心管，用孵育缓冲液(300mM Tris-乙酸(pH7.6)，10mM乙酸镁，10mM ATP，80mM磷酸烯醇丙酮酸，5mM DTT，40μM Amino Acid mix(5mM of each aminoacid)，8U/mL丙酮酸激酶)在37℃黑暗环境中孵育90min。每10mL抽提物加入1mL孵育缓冲液。
14.将孵育后的抽提物装入5kDa的透析袋中，在预冷的Buffer 3(10mM Tris-乙酸(pH8.2)，60mM乙酸钾，14mM乙酸镁)中4℃透析1h，更换Buffer 3，4℃透析过夜。抽提物和Buffer 3的体积比为1:100。
15.转移抽提物至15mL离心管，4℃，4,000g离心10min。分装上清至0.5mL离心管，每管200μL，液氮预冷后放入-80℃冰箱保存。
实施例3，重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS的制备，包括以下步骤：
无细胞表达载体pIVEX2.4c和p15a-MjpPpaRS分别用限制性内切酶NcoI和BamHI在37℃酶切4h，切胶回收的酶切产物在16℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。采用NcoI和BamHI双酶切和测序鉴定转化子，获得构建成功的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS。
实施例4，质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG的制备，包括以下步骤：
对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，从而获得蛋白AqpZTAG。以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，用引物aqpz32-36-F/aqpz32-36-R和aqpz48-F/aqpz48-R进行两轮全质粒PCR后获得pIVEX2.4c-AqpZTAG，所用引物见表1，获得质粒示意图如图1。
实施例5，含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白的无细胞体系表达，包括以下步骤：
1.用实施例2所制备的大肠杆菌无细胞体系抽提物制备大肠杆菌无细胞表达体系，体系中的各组分名称及用量如表2所示。
表2大肠杆菌无细胞表达体系组分表
组分 体积(μL)
E.coli BL21(DE3)MjTyrRS/MjtRNA抽提物/E.coli BL21(DE3)抽提物 16
E coli BL21(DE3)抽提物 8
Energy Mix(EM 3.2×) 16
Amino Acid Mix(25mM) 4
pIVEX2.4c-AqpZTAG 4
Creatine kinase 1
Brij 78 1
Total 50
表2中Energy Mix(3.2×)的配制方法如表3所示。
表3Energy Mix(3.2×)成分表
组分 储液 终浓度 体积(μL)
DTT 1000mM 1.7mM 19.7
NTPs 30mM 1.2mM 464
cAMP 100mM 0.65mM 75.4
Creatine phosphate 3000mM 80mM 309.3
tRNA(E.coli) 87.5mg/mL 0.175g/L 23.2
K-Glutamate 4000mM 200mM 580
PEG 8000 30％ 2％ 773.3
EM Buffer 10× 1160
ddH<sub>2</sub>O 220
Total 3,625
表3中EM Buffer(10×)的配制方法如表4所示。
表4EM Buffer(10×)成分表
2. 50μL大肠杆菌无细胞表达体系在37℃恒温金属浴中以400rpm振荡反应4h后，12,000g离心2min，分离反应液上清和沉淀。
3.用水和5×蛋白电泳上样缓冲液将50μL上清稀释7.5倍，沉淀用300μL水和75μL5×蛋白电泳上样液重悬，12％SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。
4.将pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒添加入无细胞表达体系中，提高MjpPpaRS在无细胞表达体系中的含量以提高P-AQPZ的表达量。从图2可以看出，在50μL无细胞体系中加入5μLpIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒，P-AQPZ表达量最高可达到48mg/L，是不添加pIVEX2.4c-MjpPpaRS质粒时的4倍。
实施例6，含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白的亲和层析纯化，包括以下步骤：
1.配制亲和层析纯化所需的缓冲液：
上样缓冲液：20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCL，20mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。
清洗缓冲液：20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCL，70mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。
洗脱缓冲液：20mmol/L Tris，0.5mol/L NaCL，500mmol/L咪唑，0.05％Brij78，pH7.4。
2.分别吸取2mL左右保存在20％乙醇中的Ni2+-NTA琼脂糖凝胶，加入2个10mL离心管，500g低速离心5min，吸出上清。
3.加入5-6mL ddH2O，颠倒离心管3-5min，500g离心5min后，吸出上清。重复该步骤3次。
4.加入5-6mL上样缓冲液，在摇床中低速孵育平衡柱子10min，500g离心5min后，吸出上清。重复该步骤2次，得到平衡的Ni2+-NTA琼脂糖凝胶。
5.实施例5步骤2所制备的4mL无细胞反应液上清(添加去污剂为Brij78(0.5％))与本实施例中步骤1中的上样缓冲液按体积比1:3混合。混合均匀后，分别吸取8mL混合液加入到步骤4得到的平衡的Ni2+-NTA琼脂糖凝胶中，4℃摇床振荡孵育2h。
6.孵育结束后，500g离心5min吸出的上清。加入8mL清洗缓冲液清洗杂蛋白，4℃摇床振荡孵育5min，500g离心5min吸出的上清，重复该步骤3次。
7.加入4mL洗脱缓冲液，4℃摇床振荡孵育1h后，500g离心5min，吸出的上清即为纯化后的非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白液。
实施例7，含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白滤水功能检测，包括以下步骤：
1.含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白脂蛋白体的制备
含非天然氨基酸pPpa的AQPZ蛋白，蛋白溶液终浓度为100μg/mL，1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)脂质体溶液终浓度为4mg/mL，Triton X-100终浓度为0.25％(m/v)。25℃、120rpm下震荡30min后以0.2g/mL加入SM-2生物珠继续震荡2h。吸取上清超速离心(300,000g、15min、4℃)，沉淀用MOPS-KOH缓冲液(100mM,pH7.5)洗涤一遍后，再次用MOPS-KOH缓冲液(100mM,pH7.5)重悬得到A含非天然氨基酸pPpa的AQPZ脂蛋白体。
2.含非天然氨基酸pPpa的AQPZ脂蛋白体的透水功能分析
分别制备AQPZ和P-AQPZ蛋白脂质体后采用停留光谱(SFM-300，BioLogic)测量脂蛋白体的透水功能。P-AQPZ脂蛋白体的Pf值计算为3.42×10-4m/s；AQPZ脂蛋白体的Pf值计算为1.23×10-4m/s；空脂质体的Pf值为Pf＝5.01×10-5m/s。AQPZ和P-AQPZ脂蛋白体的透水速率明显比空脂质体大，而且P-AQPZ脂蛋白体比AQPZ脂蛋白体的透水速率更高，表明所制备的P-AQPZ具有明显的滤水活性，且相较于AQPZ活性提高显著。非天然氨基酸的嵌入使水通道蛋白的与磷脂的亲和性增强，使得相同的条件下水通道蛋白的嵌入后更稳定。
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tttaacccgg cggtcactat tggtttatgg gctggcggac gttttccggc aaaagaagtc 300
gttggctacg taattgccca ggttgtcggc ggtattgttg cagcggcgct gctgtattta 360
attgccagtg gtaaaacggg ttttgacgcg gcagccagcg gttttgcttc taacggttat 420
ggcgagcatt caccaggcgg ttattccatg ctttccgcgc tggtagttga actggtattg 480
agtgcaggtt tcctgttggt gatccacggc gcaaccgaca aattcgcgcc ggcaggtttt 540
gcgccgatcg ctattggtct ggccttaacc ctgattcact taattagtat tccggtgact 600
aacacttctg ttaacccggc gcgcagcacc gcggttgcta tcttccaggg cggctgggca 660
ttagaacaac tgtggttctt ctgggtggtg ccaattgtcg gcggcattat cggtggtctg 720
atttaccgga ccctgctgga aaagcgtgat taa 753
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctgagcgag acgaaatacg cgatcgctg 29
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagcgatcgc gtatttcgtc tcgctcag 28
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aaatctgctg ccataggttt tgaaccaagt gg 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaatctgctg ccataggttt tgaaccaagt gg 32
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtttatggaa gtccattcca gtttgataag gattatac 38
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtataatcct tatcaaactg gaatggactt ccataaac 38
<210> 10
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
caggttaatg ctattcatta tgcaggcgtt gatgttgcag ttggagg 47
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cctccaactg caacatcaac gcctgcataa tgaatagcat taacctg 47
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttagtggct tgtttagggt ggctgtggta gtgctg 36
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cagcactacc acagccaccc taaacaagcc actaag 36
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtactggccg caggctagcc ggaattaggc attg 34
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
caatgcctaa ttccggctag cctgcggcca gtac 34

Claims (1)

1.一种大肠杆菌水通道蛋白AQPZ中整合非天然氨基酸pPpa的方法，包括以下步骤：
(1)定点突变詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的酪氨酸-tRNA合成酶(tyrosyl-tRNA synthetase,TyrRS)，获得具有5个突变位点的MjpPpaRS基因，所述MjpPpaRS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其突变位点为Tyr32Ala、Glu107Pro、Leu162Ala、Phe110Ala、Asp158Ala，构建获得p15a-MjpPpaRS质粒；将MjtRNA基因克隆至质粒pUC19，获得质粒pUC-MjtRNA，所述MjtRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2；
(2)将步骤(1)得到的质粒p15a-MjpPpaRS和pUC-MjtRNA同时转至大肠杆菌BL21(DE3)中，选取阳性转化子，发酵后制成大肠杆菌无细胞抽提物，建立无细胞表达体系；
(3)将MjpPpaRS基因克隆到pIVEX2.4c质粒上，获得重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS；
(4)以pIVEX2.4c-AqpZ为模板，对AQPZ的F10、F13和F17三个位点进行琥珀突变，得到重组质粒pIVEX2.4c-AqpZTAG；
(5)将步骤(3)得到的重组质粒pIVEX2.4c-MjpPpaRS和步骤(4)得到的载体pIVEX2.4cAqpZTAG加入步骤(2)获得的大肠杆菌无细胞体系中进行表达；
(6)利用亲和层析分离纯化编入pPpa的AQPZ蛋白，并检测其滤水功能。
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