CN106066317A - 光斩波器在延迟发光测量***中的使用方法 - Google Patents

Abstract

一种将斩光器应用于光致发光测量的方法，可以用于延迟发光的测量，测量中有两条光路：光路一是激发光照射样品的光路；光路二是探测器探测样品发光的光路；该方法利用反光镜或者棱镜将其中一条或者两条光路反射或折射，使两条光路都通过同一个斩光器。这样就实现了同一个斩光器在测量中同时对激发光和被测样品的发光进行斩光，因而可以探测样品的延迟发光和激发态寿命。该方法可以用于光谱仪和荧光成像装置，并可以搭配任意的稳态光源使用，且无需再配备脉冲发生器、延迟发生器和快门附件等，简化了仪器装置并降低了成本。该方法也可以搭配大功率的近红外激光器，用于上转化材料或近红外发射材料的时间分辨的成像。

Description

光斩波器在延迟发光测量***中的使用方法

技术领域

本发明涉及光学斩波器的使用方法，该方法可以运用到瞬态光谱仪和时间分辨的成像设备中。属于光学仪器制造领域。

背景技术

在光致发光现象中，分子受光照激发跃迁到激发态，激发态的分子可通过释放光子回到基态，即分子的荧光或磷光。分子的激发态存在寿命，即激发态的分子要在过一段时间之后才释放光子回到基态，且不同分子的激发态寿命各不不同，分子激发态寿命越长，其发光持续时间越长。通常情况下，分子的荧光寿命在纳秒级，磷光寿命可以达到微秒级以上。延迟荧光分子，其寿命也可以达到微秒级甚至毫秒级。近些年发展的一些磷光分子，寿命可以达到秒级。此外一些无机纳米材料，其寿命在毫秒级以上。这些长寿命的发光统称为延迟发光，也被称为辉光。

在荧光和磷光的测量中，一般需要构建两个光路：光路一是激发光照射样品的光路，即从光源发出的光经过透镜、光栅等部件后会聚到样品上，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测器探测样品发光的光路，即样品发光经过透镜、光栅等部件后到达探测器。在稳态的测量过程中，光路一和光路二同时打开，即激发光一直照射样品的条件下测量，这种方式可以获得样品发光光谱和强度的信息，但是不能得到样品激发态寿命的信息。

随着科学的发展，分子的激发态研究在基础科学和检测应用中越来约重要。为了获得分子激发态寿命的信息和时间分辨的光谱，人们发展了瞬态光谱仪。瞬态光谱仪，包括瞬态吸收和瞬态荧光光谱仪，在光物理光化学的研究中有重要应用。（参考专利公开说明书CN201310392018.6、CN200510092520.0、CN201180017387.6、CN201110005032.7等。）为了实现时间分辨的测量，可采用脉冲光源激发样品，同时利用具有高时间分辨率的光电倍增管、单光子计数器或具有门控功能的CCD测量其延迟的吸收或者发光信号，以获得分子激发态的寿命等信息。然而为了实现高的时间分辨率，这类光谱仪通常需配备价格昂贵的脉冲激光器和CCD。而且激光器是单一波长，不能实现全波段的测量。配置不同波长的激光器可以部分解决这个问题，然而却导致仪器的成本大大增加。为了降低成本，人们将光斩波器应用到瞬态光谱的测量中。

光斩波器简称斩光器，可以把连续光源发出的光，调制成脉冲或交变的光信号。（参考专利公开说明书CN200710025960.3、CN201310342971.X、CN200410093016.8，中国专利申请号201520771676.0等。）传统斩光器主要部件之一是斩光盘，也叫斩光片，斩光盘上分布着几个或多个通光孔，通常这些通光孔以轴心为中心成中心对称分布。当电机控制斩光盘，在一定转速下，连续光源经过斩光盘上的通光孔后，即被调制成一定频率的周期性脉冲光。

在一些应用中，可在光谱仪的激发光的光路后加一个斩光器，这样就将稳态的光源变成了模拟的瞬态光源，同时在探测器的前面再加一个斩光器，用来调节延迟时间和快门时间，以实现时间分辨的测量。同样的方案可以用于时间分辨的荧光显微镜的设计。（参考文献Anal. Chem. 2011, 83, 2294-2300。）并在生物成像领域中有重要应用。

然而在上述解决方法中，需要对两个斩光器进行协同控制，或者协同控制脉冲光源和斩光器，由于现有的斩光器一般采用电机机械调制，其精度受电机转速影响较大，其调制出的脉冲光源本身带有一定的时间误差，加上要对两个斩光器同步控制，必然使误差加大，降低了整体测量的时间分辨率。提高单个斩光器的精度可以提高整体测量的时间精度，但是斩光器的成本随之增加。

发明内容

为了解决上述问题，并降低散射光干扰，本发明发展了传统斩光器的用法，通过构建测量光路，使同一个斩光器在测量中同时对激发光和被测样品的发光进行斩光，即实现两次斩光，从而实现脉冲信号发生和延迟探测的协同控制。由于只使用一个斩光器，因而相对于协同控制两个斩光器，极大提高了时间精度，并降低了光谱仪的成本。

该发明所用的斩光器采用电机调制，与一般的斩光器一样，含有一个斩光盘，斩光盘上分布有通光孔。当斩光盘位于光路上时，斩光盘转动即可使光路反复于开和关的状态。当通光孔转到光路上时，即光路打开，反之，光路关闭。

本发明的用法是：将一个斩光器应用于一个光致发光测量***中，其中有两条光路：光路一是激发光照射样品的光路，其目的是使样品中的分子受光照激发；光路二是探测器探测样品发光的光路，即样品发光到达探测器。利用反光镜或者棱镜将其中一条或者两条光路反射或折射，使两条光路都通过这个斩光器的斩光盘，但是经过斩光盘上的不同位置。

这样就实现了同一个斩光器在测量中同时对激发光和被测样品的发光进行斩光：对光路一的斩光相当于把稳态光源转变成脉冲光源；对光路二的斩光相当于探测器快门的开合。由于两条光路经过斩光盘的位置不同，因而两次斩光存在时间差，因而该测量***可以探测样品的延迟发光和激发态寿命。

按照该方法将斩光器装载在荧光光谱仪中，构建合适的光路，可以实现样品延迟发光的测量。在这样的荧光光谱仪中，其含有光源、样品架或样品室、探测器等一般稳态荧光仪的基本零部件，还含有一个斩光器及几个棱镜或者反光镜。此外，该荧光仪的光路为：光源发出的光经过斩光器的斩光盘，作为激发光照射样品，然后样品的光经过棱镜或者反光镜的反射再次经过斩光盘，到达探测器。

在光路上，还可以搭配光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜和反光镜以改变光路的方向。只要测量中，光源照射样品之前先经过了斩光器，样品的发光经过斩光器后再到达探测器，则测量延迟发光的原理都是一样。

延迟发光的测量中，当光源通过斩光盘的通光孔照射到样品上的时候，斩光盘的另外一部分正好挡住了样品到探测器的光路；当斩光盘转动使光源到样品的光路被挡住的时候，斩光盘上的通光孔正好也绕轴转过了一个角度，使得样品的发光可以通过该通光孔到达探测器，相当于快门开启并收集光信号。由于一次照射所收集的信号较弱，可以使斩光盘匀速转动，反复上述测量过程，并累积多次测量的信号，以获得理想的信号强度。

除了光谱的测量之外，本方法还可以用于荧光成像装置，用于时间分辨的成像。在这样的装置中，其含有光源、样品架或样品室、照相机或探测器等一般稳态成像装置的基本零部件，还含有一个斩光器及几个棱镜或者反光镜。该成像装置的光路为：光源发出的光经过斩光器的斩光盘，作为激发光照射样品，然后样品的光经过棱镜或者反光镜的反射再次经过斩光盘，到达探测器。

在光路上，还可以搭配光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜和反光镜以改变光路的方向。只要测量中，光源照射样品之前先经过了斩光器，样品的发光经过斩光器后到达照相机或探测器，则时间分辨的成像的原理都是一样。

该装置用于时间分辨的成像（时间门的成像，又或者延迟成像），其原理与前面延迟发光的测量的原理一致，都是通过一个斩光器对光源和样品发光同时进行斩光：对光源斩光，可以将光源转化为脉冲光源；对样品发光斩光，相当于控制延迟时间和快门时间。由于两次斩光是由一个斩光盘进行，放置好样品的位置，使入射光和出射光不在同一时间经过通光孔，即可以确保两次斩光在时间上完全错开。因而在这个方法中，即使电机转速稍有不稳定，使频率出现偏差，进行多次测量也不会出现漏光现象，即完全排除了背景散射光的干扰。相对于分别使用两个斩光器控制脉冲光和快门，极大提高了检测的信噪比。此外，由于该方法将快门控制与斩光控制同步，因而在延迟光谱及时间分辨的成像应用中，无需再配备脉冲发生器、延迟发生器和快门附件等，简化了仪器装置并降低了成本。

从该测试的原理可知，该光谱仪可以搭配任意的稳态光源使用，如汞灯、氙灯等，相对于使用单一波长的脉冲激光器，其激发波长可以使用光栅调节，范围覆盖广，可以测试不同激发波长的物质，大大降低了成本。该方法也可以搭配大功率的近红外激光器，如980nm、808nm等，可以用于上转化材料或近红外发射材料的时间分辨的成像。

附图说明

图1为延迟光谱测量装置结构示意图，101为斩光盘，102为通光孔，103为转动轴，104为样品池，105为反射棱镜。

图2为斩光盘延迟测量的原理，201为斩光盘，202为通光孔。

图3为延迟成像装置结构示意图，301为斩光盘，302为通光孔，303为透镜，304为反光镜，305为二向色镜，306为样品室，307为样品，308为透镜，309为探测器。

图4为延迟成像的显微镜结构示意图，401为斩光盘，402为通光孔，403为反光镜，404为滤镜，405为二向色镜，406为物镜，407为样品架，408为样品，409为滤镜。

图5为延迟成像的显微镜结构示意图，501为斩光盘，502为通光孔，503为滤镜，504为二向色镜，505为物镜，506为样品架，507为样品，508为滤镜，509为探测器。

图6为延迟成像的倒置显微镜结构示意图，601为斩光盘，602为通光孔，603为滤光镜，604为样品架，605为样品，606为物镜，607为反光镜，608为滤光镜，609为反光镜，610为透镜，611为探测器。

具体实施方式

为了说明本发明的原理以及其优势，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。 在实际应用中，可以根据具体情况实施最合适的方案。

实施实例1 ，斩光器用于荧光光谱仪测量延迟发光。

如图1所示，为测量光路示意图，斩光盘101上含有一个扇形通光孔102，激发光通过斩光盘照射到样品池104上，样品受激发后发出荧光或者磷光，其中一部分荧光或者磷光经过全反射棱镜105的反射后再次经过斩光盘101，之后被探测器检测。

在这个光路中，激发光经过斩光盘的位置与棱镜反射出的样品光经过斩光盘位置不同。该装置测量延迟发光的原理如图2所示，假设激发光经过点A，样品发光经过点B到达探测器，斩光盘201顺时针匀速转动，相应的，通光孔202绕轴顺时针转动，会依此经过A、B点所在的位置。

从时间t1到t5为一个周期，根据通光孔转到的位置不同，大致分为激发、延迟、测量、关闭四个状态。在t1到t2的时间段内，处于激发状态，此时A点位于通光孔范围内，即激发光可通过斩光盘201上的通光孔202照射样品，此时样品虽然发光，但是B点被斩光盘截断，光不能通过，因而探测器检测不到信号。斩光盘201顺时针转动，在t2到t3的时间段内，处于延迟状态，A、B点均不在通光孔范围内，激发光照射不到样品，但是样品还没有立即回到基态，继续辐射发光，当斩光盘继续顺时针转动，在t3到t4的时间段内，处于测量状态，B点落在通光孔范围内，相当于快门打开，即此时样品的发光可以被探测器检测到，当斩光盘继续顺时针转动，在t4到t5的时间段内，处于关闭状态，A、B点均不在通光孔范围内，样品虽然继续辐射发光，但是激发态基本衰减完毕，且不被探测器所检测。

在上述过程中，激发光、样品发光、快门的状态随时间变化如图2所示，t1和t5的时间差为周期时间，等于是斩光盘斩光的周期，t1和t2的时间差为脉冲光照的时间，等于斩光盘斩光所得脉冲光的脉宽，t2和t3的时间差为延迟时间，跟A、B两点的位置，以及脉宽有关，在脉宽不变的条件下，改变A、B两点的位置，可以改变延迟时间，t3和t4的时间差为快门时间，即测量时间，等于斩光盘斩光所得脉冲光的脉宽，即等于t1和t2的时间差。

从上述过程可知，脉冲、延迟、快门均由一个斩光盘控制，多周期测量的过程中，即使斩光盘转速不稳，而使频率有所抖动，只要确定A、B两点的位置，可以确保脉冲、延迟、快门依此发生，使样品散射光被阻挡在外，降低了非延迟发光的干扰。

从该原理可知，该方法不限于使用图1中的单孔斩光盘，多孔斩光盘也可以达到同样的测量效果。

假设一个斩光盘斩光的频率为2.5 kHz，脉冲占空比为0.25，则周期为0.4ms，脉宽和快门时间为0.1ms，入射光和出射光位置不同，延迟时间在0.2ms以内不等，可以很容易测量寿命在0.1ms以上的样品。

这些样品有磷光金属配合物，长寿命的延迟荧光分子，稀土纳米材料等。

要测量寿命更短的样品，可以提高斩光器的频率，或者使用更高灵敏度的探测器。

如果斩光器斩光频率为250 kHz，脉冲占空比为0.25，则周期为4 μs，脉宽和快门时间为1 μs，入射光和出射光位置不同，延迟时间在2 μs以内不等，可以测量寿命在1 μs以上的样品。

按照上述配置，可以实现现有大多数延迟荧光分子的延迟发光的测量。

在上述光路中，还可以增加透镜，使激发光集中于样品上，或者使样品发光集中到探测器上，以增强信号强度。

该方法可以搭配任意的稳态光源使用，也可以搭配大功率激光器，用于上转换发光的时间分辨光谱的测量。

实施实例2 ，斩光器用于延迟发光的成像。

成像设备的结构示意图如附图3所示，激发光经过斩光盘301转变为脉冲光源，再经过透镜303，经过反光镜304反射，再经过二向色镜305反射照射样品室306中的样品307，样品发光依此经过二向色镜305、透镜308，再经过斩光盘301后到达探测器309。

斩光盘转动过程中，激发光必须经过斩光盘301的通光孔302才能照射样品，样品发光也必须经过通光孔302才能到达探测器，但是这两次光经过通光孔的时间不同，存在先后次序，因而探测器可以可以拍摄样品的延迟发光照片。延迟测量的原理与实施实例1相同。

实施实例3 ，斩光器用于延迟发光的显微成像。

显微镜构造示意图如图4所示，激发光通过斩光盘401，被反光镜403反射后再经过滤镜404，再经过二向色镜405反射后经过物镜406，照射样品架407上的样品408，样品发光依次经过物镜406、二向色镜405、滤镜409，再次经过斩光片401到达探测器。

当通光孔402位于反光镜403上方时，激发光才能通过，当通光孔402位于滤镜409上方时，样品发光才能到达探测器。由于通光孔402不能同时位于反光镜403和滤镜409上方，当斩光片401转动时，通光孔402可交替位于在二者上方，在一次测量中，激发光先通过通光孔激发样品，然后是样品发光被探测，即达到激发之后延迟成像的目的。

在一般显微镜中，常用的入射光和出射光垂直的光路设计，在这种显微镜上，可以将斩光片设计为锥型，如图5所示，斩光盘501为锥型，上面分布通光孔502，该斩光盘转动时，可以同时对相互垂直的两条光路斩光，因而可以用来构造图5所示的显微成像装置。

激发光依次通过斩光盘501，滤镜503，经过二向色镜504反射后，再经过物镜505，照射样品架506上的样品507，样品发光依次经过物镜505、二向色镜504、滤镜508，再次经过斩光盘501到达探测器509。与图4中的装置类似，同一个斩光盘同时对激发光和样品发光进行斩光，因而其延迟成像的原理与图4中的装置一样。

实施实例4 ，斩光器用于延迟发光的倒置显微镜。

显微镜构造示意图如图4所示，激发光依次通过斩光片601，滤镜603，照射样品架604上的样品605，样品发光经过其下方的物镜606后，经过反光镜607的反射，再经过滤镜608，再被反光镜609反射后经过透镜610，再次经过斩光片601到达探测器611。

当通光孔602位于滤镜603上方时，激发光才能通过，当通光孔602位于透镜610上方时，样品发光才能到达探测器。由于通光孔602不能同时位于滤镜603和透镜610上方，当斩光片601转动时，通光孔602可交替位于在二者上方，在一次测量中，激发光先通过通光孔激发样品，然后是样品发光被探测，即达到激发之后延迟成像的目的。

相对于一般的稳态显微镜的同类设备，实例3和实例4中的装置仅仅多装载了一个斩光器和少数镜片，相对于其它时间分辨的显微镜，该装置不需要专门的脉冲光源，也不需要延迟控制器、带有门控功能的CCD探测器，因而成本低廉。此外，可以搭配各种稳态光源，包括氙灯汞灯LED，大功率近红外光源，用于上转换的时间分辨成像。

此外，实例1到实例4中的所有装置中，棱镜与反光镜可以互相代替，可达到类似的技术效果。可以使用其它孔数的斩光盘，以改变斩光频率。还可以根据被测物发光的性质，在光路上添加光栅、透镜、滤光片、分光片、衰减片等，还可以增加二向色镜、棱镜和反光镜以改变光路的方向，以增强检测的信噪比。

Claims (7)

1.一种将斩光器应用于光致发光测量的方法，可以用于延迟发光的测量，其特征在于：

所用的斩光器采用电机调制，含有一个斩光盘，斩光盘上分布有通光孔；

测量中有两条光路：光路一是激发光照射样品的光路，光路二是探测器探测样品发光的光路；

利用反光镜或者棱镜将其中一条或者两条光路反射或折射，使两条光路都通过这个斩光器的斩光盘，但是经过斩光盘上的不同位置；

这样就实现了同一个斩光器在测量中同时对激发光和被测样品的发光进行斩光，由于两条光路经过斩光盘的位置不同，因而两次斩光存在时间差，因而该测量***可以探测样品的延迟发光和激发态寿命。

2.如权利要求1所述的方法用于延迟发光的测量***中，该***含有光源、样品架或样品室、探测器，还含有一个斩光器及几个棱镜或者反光镜；

其特征在于：***中存在两条光路：光路一是激发光照射样品的光路，光路二是探测器探测样品发光的光路；

激发光通过斩光盘照射到样品上，样品受激发后发出荧光或者磷光，其中一部分荧光或者磷光经过棱镜或反光镜的反射后再次经过斩光盘，之后被探测器检测。

3.如权利要求1所述的方法用于延迟发光的成像***中，其特征在于：

激发光经过斩光盘301转变为脉冲光源，再经过透镜303，经过反光镜304反射，再经过二向色镜305反射照射样品室306中的样品307，样品发光依此经过二向色镜305、透镜308，再经过斩光盘301后到达探测器；

其中，激发光和样品发光通过通光孔302的时间不同，存在先后次序，因而探测器可以可以拍摄样品的延迟发光照片。

4.如权利要求1所述的方法用于延迟发光的显微成像，其特征在于：

激发光通过斩光盘401，被反光镜403反射后再经过滤镜404，再经过二向色镜405反射后经过物镜406，照射样品架407上的样品408，样品发光依次经过物镜406、二向色镜405、滤镜409，再次经过斩光片401到达探测器；

其中，激发光和样品发光不能同时通过斩光盘401上的通光孔402，存在先后次序，因而探测器可以可以拍摄样品的延迟发光照片。

5.如权利要求1所述的方法用于延迟发光的显微成像，其特征在于：

激发光依次通过斩光盘501，滤镜503，经过二向色镜504反射后，再经过物镜505，照射样品架506上的样品507，样品发光依次经过物镜505、二向色镜504、滤镜508，再次经过斩光盘501到达探测器；

其中，所用的斩光盘501为锥型，上面分布通光孔502，该斩光盘转动时，可以同时对相互垂直的两条光路斩光。

6.如权利要求1所述的方法用于倒置显微镜中，其特征在于：

激发光依次通过斩光片601，滤镜603，照射样品架604上的样品605，样品发光经过其下方的物镜606后，经过反光镜607的反射，再经过滤镜608，再被反光镜609反射后经过透镜610，再次经过斩光片601到达探测器；

其中，激发光和样品发光不能同时通过斩光盘的通光孔，存在先后次序，因而探测器可以可以拍摄样品的延迟发光照片。

7.如权利要求1-6所述的方法用于相关仪器的制造和使用。