CN106062170B

CN106062170B - 用于收集靶材料的仪器、***和方法

Info

Publication number: CN106062170B
Application number: CN201580011850.4A
Authority: CN
Inventors: L·尤伦; D·E·坎普顿; J·J·诺德伯格; S·卡雷; J·E·伦特
Original assignee: Rarecyte Inc
Current assignee: Rarecyte Inc
Priority date: 2014-02-04
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: EP3102665A4; WO2015119863A1; CN111139175A; CN106062170A; EP3102665A1

Abstract

本公开内容涉及用于从悬浮液中回收靶材料的仪器、***和方法。***包括多个加工容器和收集器。收集器将来自悬浮液的靶材料的部分用漏斗注入通过插管且进入加工容器内。序贯密度分级是通过逐步或序贯过程将样品分成级分或将样品级分分成亚级分，使得每个步骤或顺序导致来自先前和后续步骤或顺序的不同级分或亚级分的收集或分开。换言之，序贯密度分级通过一系列步骤提供了群体的各个亚群或群体亚群的各个亚亚群。

Description

用于收集靶材料的仪器、***和方法

与相关申请的交叉参考

本申请要求于2014年2月4日提交的美国专利临时申请号 61/935,457的利益，并且本申请也是于2014年9月24日提交的美国专利申请号14/495,449的部分继续申请，所述美国专利申请号 14/495,449是于2013年11月26日提交的美国专利申请号 14/090,337的部分继续申请，所述美国专利申请号14/090,337要求于2012年11月30日提交的美国专利临时申请号61/732,029；于2012 年12月21日提交的美国专利临时申请号61/745,094；于2013年3 月15日提交的美国专利临时申请号61/791,883；于2013年5月1日提交的美国专利临时申请号61/818,301；和于2013年8月26日提交的美国专利临时申请号61/869,866的利益；并且本申请也是于2014 年5月1日提交的美国专利申请号14/266,939的部分继续申请，所述美国专利申请号14/266,939要求于2013年5月1日提交的美国专利临时申请号61/818,301，于2013年8月26日提交的美国专利临时申请号61/869,866，和于2014年2月4日提交的美国专利临时申请号 61/935,457的利益。

技术领域

本公开内容一般涉及基于密度的流体分开，且特别涉及从悬浮液中回收靶材料。

背景

悬浮液通常包括难以检测、提取和分离用于分析的目的材料。例如，全血是材料在流体中的悬浮液。材料包括在称为血浆的蛋白质流体中的数十亿红细胞和白细胞以及血小板。就异常生物或细胞的存在对全血进行常规检查，所述异常生物或细胞例如卵子、胎儿细胞、内皮细胞、寄生虫、细菌和炎症细胞、以及病毒包括HIV、巨细胞病毒、丙型肝炎病毒和EB病毒。目前，从业者、研究者和用血样工作的那些人尝试分开、分离且提取外周血样品的某些组分用于检查。用于分析血样的通常技术包括以下步骤:将血膜涂片在载玻片上，并且以这样的方式染色膜，使得某些组分能够通过亮视野显微镜检查术进行检查。

另一方面，在悬浮液中以极低浓度出现的目的材料难以(如果不是不可能的话)使用许多现有技术进行检测且分析。考虑例如循环肿瘤细胞(“CTC”)，其是已从肿瘤脱离、在血流中循环，并且可以视为在不同组织中的另外肿瘤的后续生长的种子的癌细胞(即转移)。准确检测且分析CTC的能力是肿瘤学家和癌症研究者特别感兴趣的。然而，CTC以极低数目出现在外周血样品中。例如，含有少至5个CTC 的外周血样品的7.5ml样品视为对于癌症患者的诊断和治疗是临床上相关的。换言之，检测7.5ml血样中的5个CTC等价于检测约100 亿个红细胞和白细胞的背景中的1CTC，这使用血膜分析是极其耗时、昂贵和难以实现的。

因此，从业者、研究者和用悬浮液工作的那些人继续寻求就罕见目的材料的存在或不存在而准确分析悬浮液的***和方法。

附图描述

图1A-1B显示了示例收集器。

图2A-2B显示了示例收集器。

图2C-2D显示了示例收集器。

图3A-3B显示了示例收集器-加工容器***。

图4A-4B显示了示例收集器-遮蓬(canopy)***。

图5A-5B显示了示例密封环。

图5C-5D显示了示例密封环。

图5E-5F显示了示例密封环。

图5G显示了示例密封环。

图6显示了用于回收靶材料的示例方法的流程图。

图7A-7B显示了示例浮子和主要容器***。

图8显示了已经历基于密度的分开的示例浮子和主要容器***。

图9显示了形成密封的示例密封环以及示例浮子和主要容器系统。

图10A-10G显示了回收靶材料的示例***。

详述

本公开内容涉及用于从悬浮液中回收靶材料的仪器、***和方法。 ***包括多个加工容器和收集器。收集器将来自悬浮液的靶材料的部分用漏斗注入加工容器内。序贯密度分级是通过逐步或序贯过程将样品分成级分或将样品级分分成亚级分，使得每个步骤或顺序导致来自先前和相继步骤或顺序的不同级分或亚级分的收集或分开。换言之，序贯密度分级通过一系列步骤提供了群体的各个亚群或群体亚群的各个亚亚群(sub-sub-population)。

收集器

图1A显示了收集器100的等距视图。图1B显示了沿图1A中所示的线I-I获取的收集器100的横截面视图。点划线102代表收集器100 的中心或最高对称轴。收集器100可以具有这样的尺寸和形状，以适配在含有或能够容纳悬浮液的主要容器内，所述悬浮液被怀疑包括靶材料。收集器100将来自悬浮液的靶材料用漏斗通过插管106注入且进入加工容器(未示出)内，以位于腔108内。收集器100包括主体 104，其包括第一端部110和第二端部112。密封可以在第二端部112 和主要容器的内壁之间形成，以在离心前、离心期间和离心后维持流体紧密的密封接合，并且抑制悬浮液的任何部分位于主要容器的内壁和收集器100的主体104之间，或在主要容器的内壁和收集器100的主体104之间流动。密封可以通过下述来形成：干涉配合、润滑脂(例如真空润滑脂)、粘合剂、环氧树脂、通过粘结(例如通过热粘结)、通过焊接(例如通过超声波焊接)、通过夹紧(例如用环或夹具)、适配在第二端部112和主要容器的内壁之间的***件(例如O形环或套环)等等。主体104可以是任何适当形状，包括但不限于圆柱形、三角形、正方形、矩形等等。收集器100还包括内部漏斗114，其为凹形开口。漏斗114可以从第二端部112朝向插管106逐渐变细。漏斗114将来自低于第二端部112的靶材料引导到插管106内，所述插管106与漏斗114的顶点连接且流体连通。漏斗114的顶点具有比漏斗114的口部更小的直径。漏斗114通过逐渐变细的壁形成，所述逐渐变细的壁可以是笔直的、曲线的、弓形的等等。漏斗114可以是任何适当形状，包括但不限于管形、球形、圆顶形、圆锥形、矩形、金字塔形等等。此外，漏斗114的最外部直径或边缘可以与主要容器的内壁连续连通或恒定接触(即齐平)，使得在收集器100的第二端部 112和主要容器的内壁之间不存在无效空间。

插管106例如管或针包括但不限于非取芯针，从漏斗114的顶点延伸且进入腔108内。在图1的例子中，腔108是从第一端部110延伸进入主体104内的凹形开口，并且可以接受且支持加工容器(未示出)。腔108可以是任何适当的深度，以接受且支持加工容器(未示出)。插管106可以延伸任何适当的距离进入腔108内，以便穿透加工容器(未示出)的基部，或***加工容器内。插管106可以包括平坦尖端、斜切尖端、尖锐尖端或锥形尖端。此外，腔108可以是任何适当的形状，包括但不限于管形、球形、圆顶形、圆锥形、矩形、金字塔形等等。腔108可以是带螺纹的，以接合加工容器的带螺纹部分 (未示出)。

收集器100还可以包括保持器(未示出)，以阻止收集器100相对于主要容器滑动，从而使收集器100保持在主要容器内的预定高度处。保持器(未示出)可以是从第一端部110径向延伸的肩部、夹具、延伸超出圆柱形主体104的圆周的环形突起、止动器等等。

图2A显示了收集器200的等距视图。图2B显示了沿图2A中所示的线II-II获取的收集器200的横截面视图。点划线202代表收集器 200的中心或最高对称轴。收集器200类似于收集器100，除了收集器 200包括比收集器100的主体更细长的主体204，以便容纳加工容器(未示出)的更大部分之外。主体204包括第一端部206和第二端部208。密封可以在第二端部208和主要容器的内壁之间形成，以在离心前、离心期间和离心后维持流体紧密的密封接合，并且抑制悬浮液的任何部分在主要容器的内壁和收集器200的主体204之间流动。密封可以通过下述来形成：干涉配合、润滑脂(例如真空润滑脂)、粘合剂、环氧树脂、粘结(例如热粘结)、通过焊接(例如通过超声波焊接)、夹紧(例如用环或夹具)、适配在第二端部208和主要容器的内壁之间的***件(例如O形环或套环)等等。

第一端部206包括尺寸为接受且容纳加工容器(未示出)的至少一部分的腔212。腔212可以具有加工容器(未示出)可以安置在其上的锥形或阶梯状底部端部220。第一端部206还可以包括至少一个切口(cut-out)210，以允许加工容器(未示出)的适当抓握用于插入和取出。收集器200将来自悬浮液的靶材料用漏斗通过插管214注入第二端部208处的内部漏斗222内，且进入位于腔212内的加工容器(未示出)内。插管214可以安置在架224上，使得插管214的内部孔与漏斗222的内壁齐平，如图2B中所示。

收集器200可以包括肩部216，所述肩部216在主体204周围圆周延伸。肩部216可以长于主要容器的内径，以便安置在主要容器的开放端部上，并且在对主要容器和肩部216的外部施加锁定环(未示出)后，以抑制收集器200相对于主要容器的移动。锁定环(未示出) 沿肩部216对主要容器施加压力。锁定环可以是两片环、在主要容器的整个圆周周围包裹的一片环、或在主要容器的小于整个圆周周围包裹的一片环，例如二分之一(1/2)、八分之五(5/8)、三分之二(2/3)、四分之三(3/4)、八分之七(7/8)等等。备选地，肩部216可以适配在主要容器内。备选地，肩部216可以是夹具，使得肩部216可以包括主要容器可以***其内的卡锁，以抑制收集器200相对于主要容器的移动。备选地，肩部216可以与主要容器的内部形成干涉配合，密封环可以置于其周围。

如图2A中所示，收集器200可以包括至少一个窗口218，以通过主体204的内壁进入(access)腔212。至少一个窗口218允许操作者证实加工容器(未示出)在腔212内的适当放置。至少一个窗口218 还允许从插管214中除去流体，以流出收集器200且进入在收集器200 和主要容器(未示出)之间形成，并且在第二端部208和主要容器的内壁之间的密封上方的空间内。

图2C显示了收集器230的等距视图。图2D显示了沿图2C中所示的线III-III获取的收集器230的横截面视图。收集器230类似于收集器200，除了收集器230包括主体238，所述主体238包括延伸远离第一端部232的延长部分234和至少暂时密封延长部分234内的开口 240的盖236。开口240可以在第一端部232处与腔212流体连通。盖 236可以是可去除、可穿透和可再密封的(例如铰链盖)，或可穿透和不可再密封的(例如箔盖)。延长部分234可以具有当穿透时接受盖236的尺寸，使得盖236的一部分无法在第一端部232处延伸进入腔212内。应指出收集器230不包括至少一个切口210。

主体可以由各种不同材料组成，所述各种不同材料包括但不限于陶瓷；金属；有机或无机材料；和塑料材料例如聚甲醛聚苯乙烯、丙烯腈丁二烯苯乙烯(“ABS”)共聚物、芳族聚碳酸酯、芳族聚酯、羧甲基纤维素、乙基纤维素、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、尼龙、聚缩醛、聚乙酸酯、聚丙烯腈及其他腈树脂、聚丙烯腈-氯乙烯共聚物、聚酰胺、芳族聚酰胺(“聚芳族酰胺”)、聚酰胺-酰亚胺、聚芳酯、聚芳撑氧化物、聚芳硫醚、聚芳基砜、聚苯并咪唑、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚碳酸酯、聚酯、聚酯酰亚胺、聚醚砜、聚醚酰亚胺、聚醚酮、聚醚醚酮、聚对苯二甲酸乙酯、聚酰亚胺、聚甲基丙烯酸酯、聚烯烃(例如聚乙烯、聚丙烯)、聚异分体(polyallomers)、聚噁二唑、聚对二甲苯、聚苯醚(PPO)、改性PPO、聚苯乙烯、聚砜、含氟聚合物例如聚四氟乙烯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯乙酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯基卤化物例如聚氯乙烯、聚氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、聚偏二氯乙烯、特种聚合物、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、丙烯腈丁二烯-苯乙烯共聚物、丁基橡胶、乙烯丙烯二烯单体；及其组合。

插管可以由各种不同材料组成，所述各种不同材料包括但不限于陶瓷；金属；有机或无机材料；和塑料材料例如聚丙烯、丙烯酸、聚碳酸酯等等；及其组合。插管可以具有沿插管纵轴的尖端。

收集器-加工容器***

图3A显示了示例收集器200和加工容器302的分解视图。图3B 显示了沿图3A中所示的线IV-IV获取的，在收集容器200的第一端部 206处***腔212内的加工容器302的横截面视图。收集器200和加工容器302形成收集器-加工容器***300。加工容器302可以是Eppendorf管、注射器或试管，并且具有闭合端部304和开放端部306。开放端部306具有接受帽308的尺寸。帽308可以由可再密封橡胶或其他合适的可再密封材料组成，所述可再密封材料可以用针或其他尖锐器具反复刺穿，以接近加工容器302内部中贮存的内容物，并且当针或器具去除时再密封。备选地，加工容器302还可以具有接受帽的尺寸的两个开放端部。加工容器302可以具有朝向开放端部306加宽或变窄的锥形几何形状；加工容器302可以具有大致圆柱形的几何形状；或者，加工容器302可以具有在第一区段中大致圆柱形的几何形状和在第二区段中圆锥形的几何形状，其中第一区段和第二区段彼此连接且连续。尽管加工容器302的至少一个区段具有圆形横截面，但在其他实施方案中，至少一个区段可以具有椭圆形、正方形、三角形、矩形、八边形或任何其他合适的横截面形状。加工容器302可以由透明、半透明、不透明、或半透性材料例如塑料或另一种合适材料组成。加工容器包括中心轴314，当***腔212内时，所述中心轴314与收集器200的中心轴202同轴。加工容器302还可以包括在闭合端部304 处的塞310，以允许靶材料的引入或使靶材料与置换流体312交换。闭合端部304可以是带螺纹的，以提供与收集器200的带螺纹腔212 的螺纹连接。加工容器302可以由玻璃、塑料或其他合适材料组成。

塞310可以由可再密封橡胶或其他合适的可再密封材料组成，所述可再密封材料可以用针或其他尖锐器具反复刺穿，以接近加工容器 302内部的内容物或允许内容物引入加工容器302内，并且当针或器具去除时再密封。塞310可以***加工容器302内，使得密封例如通过干涉配合维持在塞310和加工容器302之间。备选地，塞310可以使用加热液体橡胶在加工容器302的闭合端部304中形成，所述加热液体橡胶可以在加温或热时成形且当橡胶冷却时硬化。粘合剂可以用于将塞310附接至加工容器的内壁，可以是基于聚合物的粘合剂、环氧树脂、接触粘合剂或者用于粘结或产生热粘结的任何其他合适的材料。备选地，塞310可以被射到加工容器302内。备选地，塞310可以与加工容器302热粘结。

在图3B的例子中，插管214具有锥形尖端，其穿透塞310且延伸进入加工容器302的内部腔，其中插管214的柄不延伸进入加工容器 302的内部腔。如下文更详细地说明的，加工容器302的内部腔容纳靶材料。插管214可以由可再密封套筒(未示出)覆盖，以阻止靶材料流出，除非加工容器302在腔212内至允许插管214正好穿透加工容器302的深度。可再密封套筒(未示出)覆盖插管214，是弹簧弹性的，可以***管214穿透，并且由能够经受住重复刺穿同时仍维持密封的弹性体材料制成。

如图3A-3B中所示，在***收集器200内之前，加工容器302可以装载有置换流体312。置换流体312置换靶材料，使得当收集器200 和加工容器302***包括靶材料主要容器(未示出)内，并且收集器、加工容器和主要容器经历离心时，置换流体312流出加工容器302且进入主要容器内，并且通过置换例如通过浮力置换(即，使材料向上提升)，推动靶材料通过插管214且进入加工容器302内。

置换流体312具有比悬浮液的靶材料的密度更大的密度(密度可以大于悬浮液级分的子集或所有悬浮液级分的密度)，并且就悬浮材料而言是惰性的。置换流体312在悬浮流体中可以是能混溶的或不能混溶的。合适的置换流体的例子包括但不限于涂布有聚乙烯吡咯烷酮的胶体氧化硅粒子溶液(例如Percoll)、多糖溶液(例如Ficoll)、碘克沙醇(例如OptiPrep)、有机溶剂、液体蜡、油、气体及其组合；橄榄油、矿物油、硅氧烷油、浸油、矿物油、石蜡油、硅油、氟硅氧烷、全氟萘烷、全氟全氢菲、全氟辛烷基溴化物及其组合；有机溶剂如1,4-二噁烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁醇、环己酮、二氯甲烷、叔戊醇、甲基叔丁基醚、乙酸丁酯、己醇、硝基苯、甲苯、辛醇、辛烷、碳酸丙烯酯、环丁砜和离子液体；基于聚合物的溶液；表面活性剂；全氟酮例如全氟环戊酮和全氟环己酮、氟化酮、氢氟醚、氢氟烃、全氟化碳、全氟聚醚、硅和基于硅的液体例如苯甲基硅氧烷；及其组合。

加工容器302还可以包括加工溶液(未示出)，以在靶材料进入加工容器302时，实现对靶材料的转化。加工溶液(未示出)可以是防腐剂、细胞粘附溶液、染料等等。与置换流体312不同，大多数(如果并非全部)加工溶液(未示出)在离心后保留在加工容器302内，从而以一种方式或另一种方式(即防腐、增加粘附特性等等)实现对靶材料的转化。加工溶液(未示出)可以作为液体或外壳中包含的液体引入。外壳可以溶解于水溶液而不是置换流体312中(例如凝胶帽)；或外壳可以是易破的，使得当加工容器302在涡旋混合器中振荡时，外壳破裂。另外，可以使用超过一种加工溶液。

加工容器302可以包括柔性帽，其可以被推动以将由其的预定体积分配到基质例如载玻片或孔板上。帽308可以是柔性的，或帽308 可以被去除，并且将柔性帽***开放端部306内。备选地，加工容器 302可以附接至分配器(即在积聚靶材料后)，或可以包括分配器，所述分配器能够将预定体积的靶材料从加工容器302分配到另一种基质例如显微镜载玻片上。分配器可以重复刺穿可再密封帽308，或压缩加工容器302内的材料，以抽取且分配预定体积的靶材料到基质上。备选地，帽308可以被去除，并且分配器(未示出)可以直接***加工容器302内，以分配血沉棕黄层-加工溶液混合物。

收集器-遮蓬***

图4A显示了示例收集器200和遮蓬402的分解视图。图4B显示了沿图4A中所示的线V-V获取的，***收集器200的腔212内的加工容器402的横截面视图。收集器200和遮蓬402形成收集器-遮蓬*** 400。遮蓬402类似于加工容器302，除了遮蓬具有第二开放端部404 之外。当收集器-遮蓬***400***主要容器内时，在主要容器内的一些流体例如一部分悬浮液、一部分悬浮液级分、一部分清洁流体等等，可以通过插管214排出。遮蓬402抑制可以通过插管214排出的主要容器中的一部分流体逃出收集器200的第一端部206的开口。已通过遮蓬402阻断的排出流体流出第二开放端部404，且流出窗口218。虚线406显示当流体通过插管214排出时的流体流动，并且通过遮蓬402 保留。

备选地，当使用收集器230时，收集器230的盖236抑制可以通过插管214排出的主要容器中的一部分流体逃出收集器200的第一端部206的开口，其方式类似于遮蓬402的那种。

密封环

图5A显示了密封环500的等距视图。图5B显示了密封环500的自顶而下视图。点划线502代表密封环500的中心或最高对称轴。密封环500包括内壁504、外壁506和腔508。在图5B中，R_IW代表从密封环500的中心到内壁504的径向距离，并且R_OW代表从密封环500的中心到外壁506的径向距离。密封环500配置为适配在主要容器例如管周围。腔508具有接受主要容器的大小和形状。密封环500可以旋紧，使得通过在外壁506周围圆周施加导向密封环500的中心轴502 的大致均匀的径向力，例如通过夹具产生的径向力，腔508的大小以及内壁和外壁504和506的半径减少。当密封环500在主要容器周围旋紧时，施加于密封环500的均匀力施加于主要容器，从而促使主要容器收缩。当径向力从密封环500去除时，密封环500在主要容器周围保持旋紧且处于张力中。

密封环可以是任何形状，包括但不限于圆形、三角形或多面体。图5C显示了密封环510的等距视图。图5D显示了密封环510的自顶而下视图。密封环510类似于密封环500，除了密封环510是多面体之外。点划线512代表密封环510的中心或最高对称轴。密封环510包括内壁514、外壁516和腔518。密封环可以由金属例如黄铜、聚合物或其组合组成。

备选地，如图5E中所示，密封环520可以由压电材料组成。图 5F显示了密封环520的自顶而下视图。点划线522代表密封环520的中心或最高对称轴。密封环520可以经由第一导线524和第二导线526 联接至电势源528，例如电池。电势源528产生促使密封环520拧紧 (即密封环520半径减少)的机械应力。密封环520包括内壁530、外壁532和腔534。在图5F中，R_IW代表从密封环520的中心到内壁 530的径向距离，并且R_OW代表从密封环520的中心到外壁532的径向距离。备选地，密封环520可以处于天然拧紧状态。当施加电势时，密封环520扩张。备选地，密封环的一部分可以由压电材料组成，使得压电部分充当驱动器，以促使密封环的其他部分拧紧且对主要容器施加基本上均匀的圆周压力，从而使主要容器收缩以形成密封。

图5G显示了密封环540的等距视图。密封环包括调整机构548，以调整内径R_ID。可折叠环包括第一端部542和第二端部546，所述第一端部542和第二端部546通过带部分544连接。第一端部542和第二端部546包括调整机构548的互补部分。调整机构548包括但不限于棘轮、榫槽、棘爪等等。

密封环还可以包括热敏元件，例如加热线。热敏元件可以软化主要容器用于收缩。备选地，热敏元件可以熔融主要容器，以提供更粘附的密封。备选地，热敏元件可以促使密封环压缩，从而在主要容器和浮子之间形成密封。

序贯密度分级法

序贯密度分级是通过逐步或序贯过程将样品分成级分或样品级分分成亚级分，使得每个步骤或顺序导致来自先前和相继步骤或顺序的不同级分或亚级分的收集或分开。换言之，序贯密度分级通过一系列步骤提供了群体的各个亚群或群体亚群的各个亚亚群。例如，血沉棕黄层是全血样品的级分。血沉棕黄层级分可以进一步分解成亚级分，包括但不限于网织红细胞、粒细胞、淋巴细胞/单核细胞和血小板。这些亚级分可以通过执行序贯密度分级各个获得。

为方便起见，该方法参考抗凝全血的示例悬浮液进行描述。但下文描述的方法没有旨在在其应用范围内进行如此限制。在实践中，该方法可以用于任何种类的悬浮液。例如，样品悬浮液可以是尿液、血液、骨髓、囊液、腹水、粪便、***、脑脊髓液、***抽吸液、唾液、羊水、***分泌物、粘膜分泌物、房水、玻璃体液、呕吐物以及任何其他生理流体或半固体。还应该理解的是靶材料可以是样品悬浮液的级分，例如血沉棕黄层、细胞例如卵子、有核红细胞、胎儿DNA、胎儿RNA等等、或循环肿瘤细胞(“CTC”)、循环内皮细胞、免疫细胞(即初始或记忆B细胞或者初始或记忆T细胞)、囊泡、脂质体、蛋白质、核酸、生物分子、具有封闭膜的天然存在或人工制备的微观单元、寄生虫(例如螺旋体，例如引起莱姆病的布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；疟疾(malayria)诱导剂)、微生物、病毒或炎症细胞。备选地，样品可以是生物固体例如组织，在加入主要容器之前或之后，所述生物固体已例如通过胶原酶进行分解。

图6显示了使用序贯密度分级用于回收靶材料的示例方法的流程图。在方框602中，获得悬浮液例如抗凝全血。在方框604中，将全血加入主要容器例如试管中。浮子也可以加入主要容器中。为方便起见，该方法就浮子而言进行描述，但下文所述的方法没有旨在在其应用中进行如此限制，并且可以无需浮子而执行。

图7A显示了示例主要容器和浮子***700的等距视图。***700 包括主要容器702和悬浮于全血706内的浮子704。在图7A的例子中，主要容器702具有圆形横截面、第一开放端部710和第二闭合端部708。开放端部710具有接受帽712的尺寸。主要容器还可以具有接受帽的尺寸的两个开放端部，例如图7B所示的示例管和可分开的浮子系统720。***720类似于***700，除了主要容器702替换为主要容器 722之外，所述主要容器722包括配置为分别接受帽712和帽728的两个开放端部724和726。主要容器702和722具有大致圆柱形的几何形状，但还可以具有朝向开放端部710和724分别加宽、变窄或其组合的锥形几何形状。尽管主要容器702和722具有圆形横截面，但在其他实施方案中，主要容器702和722可以具有椭圆形、正方形、三角形、矩形、八边形或基本上延伸管长度的任何其他合适的横截面形状。主要容器702和722可以由透明、半透明、不透明、或半透性材料例如塑料或另一种合适材料组成。主要容器702和722各自分别包括中心轴718和730。主要容器702还可以包括在闭合端部708处的隔膜714，如在放大视图716中可见的，以允许流体、悬浮液或悬浮级分的去除，无论是用注射器、泵、通过引流等等。主要容器702 可以具有内壁和第一直径。

隔膜714可以由可再密封橡胶或其他合适的可再密封材料组成，所述可再密封材料可以用针或其他尖锐器具反复刺穿，以进入主要容器702内部的内容物，并且当针或器具去除时再密封。隔膜714可以 ***主要容器702内，使得密封例如通过干涉配合维持在隔膜714和主要容器702之间。备选地，隔膜714可以使用加热液体橡胶在管的开口和/或底部内部中形成，所述加热液体橡胶可以在加温或热时成形且当橡胶冷却时硬化。粘合剂可以用于将隔膜714附接至开口和管内部的壁，并且可以是基于聚合物的粘合剂、环氧树脂、接触粘合剂或者用于将橡胶粘结至塑料或产生热粘结的任何其他合适的材料。备选地，隔膜714可以与主要容器702热粘结。

浮子704包括主体、两个泪滴形端帽、以及在主体上径向间隔开且轴向取向的支撑构件。备选地，浮子704可以不包括任何支撑构件。备选地，浮子704可以包括支撑构件，其不接合主要容器702的内壁。

在备选实施方案中，支撑构件数目、支撑构件间隔和支撑构件厚度可以各自独立地改变。支撑构件还可以被破坏或分段。主体具有这样的尺寸，以具有小于主要容器702的内径的外径，从而限定在主体的外表面和主要容器702的内壁之间的流体滞留通道。支撑构件之间的主体表面可以是平坦的、弯曲的或具有另一种合适的几何形状。支撑构件和主体可以是单一结构，或可以是分开结构。

实施方案包括用于浮子端帽的其他类型的几何学形状。顶部端帽可以是泪滴形、圆顶形、圆锥形或任何其他适当的形状。底部端帽可以是泪滴形、圆顶形、圆锥形或任何其他适当的形状。在其他实施方案中，浮子704的主体可以包括各种不同支撑结构用于分开样品、支撑管壁、或在离心期间将悬浮流体导向浮子周围。实施方案没有旨在限制于这些例子。主体可以包括提供用于管的支撑的许多突起。在备选实施方案中，突起数目和模式可以改变。主体可以包括单一连续的螺旋结构或肩部，其在主体周围螺旋，产生螺旋通道。在其他实施方案中，螺旋肩部可以是圆润的或破碎的或分段的，以允许流体在螺旋肩部的相邻转角之间流动。在各种实施方案中，螺旋肩部间隔和肋厚度可以独立地改变。在另一实施方案中，主体可以包括从主体径向且在主体周围圆周延伸的支撑构件。在另一个实施方案中，支撑构件可以是锥形的。

浮子704可以由各种不同材料组成，所述各种不同材料包括但不限于金属；有机或无机材料；含铁塑料；烧结金属；机械加工的金属；塑胶材料及其组合。主要容器702可以具有内壁和第一直径。浮子704 可以通过干涉配合在主要容器702内被捕获，使得在离心时，管内壁扩张以允许浮子704的轴向移动。当离心停止时，内壁降回到第一直径，以诱导干涉配合。备选地，内壁可以不扩张，并且干涉配合可以在浮子704和主要容器702之间不出现，使得浮子在离心前、离心期间或离心后在管内自由移动。浮子的端帽可以通过机械加工、注塑成形、添加剂技术等等制造为主体的一部分，从而成为一个单一结构；或者，通过按压适配、粘合剂、螺钉、通过其将至少两片连在一起的任何其他适当的方法或其组合，端帽可以联接至主体。

帽712可以由各种不同材料组成，所述各种不同材料包括但不限于有机或无机材料；塑料材料；及其组合。

回到图6，在方框606中，主要容器、浮子和全血经历例如通过离心基于密度的分开，从而允许全血基于密度沿管的轴向位置分成基于密度的级分。图8显示了已经历例如通过离心基于密度的分开的主要容器和浮子***700的等距视图。假设例如离心的全血包括三个级分。为方便起见，三个级分包括血浆、血沉棕黄层和红细胞。然而，当另一种悬浮液经历离心时，可以存在更多、更少或相同数目的级分，每个级分具有不同密度。如图8中所示，悬浮液经历基于密度沿管的长度分成三个级分的轴向分开，其中红细胞803位于底部，血浆801 位于顶部，并且血沉棕黄层802位于两者之间。浮子704可以具有任何适当密度，以在级分之一内沉降。浮子704的密度可以这样选择，使得浮子704扩张，血沉棕黄层802在浮子的主体和主要容器的内壁之间。血沉棕黄层802可以截留在浮子704和主要容器702之间的区域内。

至少一种划分流体(delineation fluid)(未示出)可以用于提供靶材料和在靶材料上方和/或下方的任何非靶材料之间的进一步分开。至少一种划分流体(未示出)可以具有大于或小于靶材料的密度。例如，当期望进一步分开血沉棕黄层802和红细胞803时，划分流体可以具有大于血沉棕黄层802和小于红细胞803的密度。至少一种划分流体(未示出)可以是与悬浮流体能混溶或不能混溶的，并且就悬浮材料而言是惰性的。至少一种划分流体(未示出)还可以提供其中密封主要容器702的区域，因为在血沉棕黄层802和红细胞803之间存在更大的划分和分开。无论是否使用浮子均可以使用至少一种划分流体(未示出)。合适的划分流体的例子包括但不限于涂布有聚乙烯吡咯烷酮的胶体氧化硅粒子溶液(例如Percoll)、多糖溶液(例如 Ficoll)、碘克沙醇(例如OptiPrep)、氯化铯、蔗糖、基于糖的溶液、基于聚合物的溶液、表面活性剂、有机溶剂、液体蜡、油、气体及其组合；橄榄油、矿物油、硅氧烷油、浸油、矿物油、石蜡油、硅油、氟硅氧烷、全氟萘烷、全氟全氢菲、全氟辛烷基溴化物及其组合；有机溶剂如1,4-二噁烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁醇、环己酮、二氯甲烷、叔戊醇、甲基叔丁基醚、乙酸丁酯、己醇、硝基苯、甲苯、辛醇、辛烷、碳酸丙烯酯、环丁砜和离子液体；基于聚合物的溶液；表面活性剂；全氟酮例如全氟环戊酮和全氟环己酮、氟化酮、氢氟醚、氢氟烃、全氟化碳、全氟聚醚、硅和基于硅的液体例如苯甲基硅氧烷；及其组合。

图9显示了形成为阻止流体在主要容器内向上或向下移动的密封。密封还抑制浮子移动。密封环500对主要容器702施加圆周或径向力，从而促使主要容器702针对浮子704向内折叠。放大视图902 显示了在浮子和主要容器***700周围拧紧的密封环500。已置于血沉棕黄层802和红细胞803的界面处的密封环500促使主要容器702 向内折叠，直至密封在主要容器702和浮子704之间形成。密封环500 的外壁可以与主要容器702的外壁齐平；密封环500的外壁可以延伸越过主要容器702的外壁；或者，主要容器702的外壁可以延伸越过密封环500的外壁。密封环500保持拧紧以维持密封，这阻止流体在任何方向移动越过密封。密封环500还可以保持在张力状态。备选地，密封环500可以过度拧紧，并且随后去除对密封环500施加的力。密封环500可以略微扩张，尽管仍保持收缩。

为了应用密封环500且从而形成密封，夹具可以用于将针对主要容器702的中心轴的力圆周施加于密封环500以及浮子和主要容器系统700。在浮子和主要容器***700已经历例如通过离心基于密封的分开后，将密封环500置于浮子和主要容器***700周围。密封环500 以及浮子和主要容器***700随后置于夹具内。夹具可以包括架以针对主要容器702支撑密封环500。夹具的操作可以是自动化的或可以手动执行。备选地，夹具可以形成浮子704和主要容器702之间的密封，而无需包括密封环500。备选地，例如通过超声波焊接；或通过施加热或温度梯度以使主要容器702与浮子704变形和/或熔融，密封可以在浮子704和主要容器702之间形成。为方便起见，该方法就浮子和主要容器之间的密封而言进行描述，但下文描述的方法没有旨在在其应用中进行如此限制，并且可以无需密封而执行。

当夹具的操作是自动化的时，发动机促使夹头包括夹头指或压力构件平移，以促使夹头指的压缩。发动机可以通过柄例如凸轮柄和一个或多个齿轮而联接至夹头或压力构件。基底接合且容纳物体。当夹头通过发动机驱动时，压力构件保持静止。当压力构件通过发动机驱动时，夹头保持静止。夹具可以包括脱离器，以便促使压力构件滑出夹头指904，从而去除夹紧力。

备选地，夹具可以是但不限于夹头夹具、O型环、管夹具、软管夹具、弹簧夹具、皮带夹具、或纽带如扎带。夹具可以无需密封环而使用，以提供浮子和管之间的密封。

如图10A中所示，血浆801可以例如通过移液、抽吸、倾倒等等从主要容器702中取出。回到图6，在方框608中，清洁流体可以连同收集器-遮蓬***一起加入主要容器中。图10B-10C显示了加入主要容器702中的清洁流体1002，其具有大于至少血沉棕黄层802的密度 (即，例如，可以具有大于血沉棕黄层但小于红细胞的密度，或可以具有大于血沉棕黄层和红细胞两者的密度)。备选地，血浆801可以保留在主要容器702中。当血浆801保留在主要容器702中时，血浆 801的密度可以例如通过碘克沙醇或任何适当物质改变，以改变级分密度，从而充当清洁流体。因此，当血浆801保留在主要容器702中并且密度改变时，可以不需要清洁流体。

如图10D中所示，收集器-遮蓬***400随后加入主要容器702 中。收集器200的第二端部208与主要容器702的内壁形成密封1008，以阻止流体在离心前、离心期间和离心后在收集器200周围流动。密封1008可以在第二端部208和主要容器的内壁之间形成，以在离心前、离心期间和离心后维持流体紧密的密封接合，并且抑制悬浮液的任何部分位于主要容器的内部和收集器200的主体204之间，或在主要容器的内部和收集器200的主体204之间流动。密封可以通过下述来形成：干涉配合、润滑脂(例如真空润滑脂)、粘合剂、环氧树脂、热粘结、超声波焊接、夹紧(例如用环或夹具)、适配在第二端部208 和主要容器的内壁之间的***件等等。锁定环1004可以置于收集器 200的肩部216和主要容器702的开放端部710之上，以抑制收集器 200相对于主要容器702的平移。当***收集器-遮蓬***400时，主要容器702中的清洁流体1002的一部分可以通过插管214排出，并且由遮蓬402停止。如沿线VI-VI获取的通过放大视图1006中的虚线 406所见的，排出的流体可以通过窗口218流出且进入主要容器702 内，尽管保持在第二端部208和主要容器702的内壁之间的密封上方。

在方框610中，执行序贯密度分级。方框610还是序贯密度分级步骤的快照。如图10E中可见的，在方框612中，将包括第n种置换流体的第n个加工容器***收集器内，使得n大于或等于第一(即第二、第三、第四等等)。其为沿线VII-VII获取的横截面的放大视图1010显示了在加工容器302中的置换流体312，以及主要容器702中的清洁流体1002和血沉棕黄层802。

回到图6，在方框614中，将***离心以收集级分或亚级分，并且取出第n个加工容器。在方框616中，操作者确定是否获得所需级分或亚级分。当获得所需级分或亚级分时，过程可以如方框618中所示停止，尽管过程可以继续直至获得所有级分或亚级分。当仍未获得所需级分或亚级分时，过程在方框612处重新开始。加工容器还可以包括加工溶液，以实现对各自亚级分的改变。取决于需要分开和收集的级分或亚级分数目，可以使用两种或更多种加工容器和各自置换流体。每种相继置换流体比先前置换流体密度更大。类似地，每个相继级分或亚级分比先前级分或亚级分密度更大。一旦收集，就可以分析连续亚级分，例如用于诊断、预后、研究目的，以测定组分特征(即完全血细胞计数)，这些特征如何随着时间变化等等。

图10F显示了经历离心的收集器-加工容器***300和主要容器 702。其为沿线VIII-VIII获取的横截面视图的放大视图1012显示了主要容器702和加工容器302之间的流体交换的快照。随着具有大于血沉棕黄层802的密度的清洁流体1002在主要容器702中向下移动，血沉棕黄层802从浮子704中清除。随着具有大于血沉棕黄层802的第一亚级分1014但小于清洁流体1002和血沉棕黄层802的剩余部分的密度的置换流体312从加工容器302流动到主要容器702内，第一亚级分1014在主要容器702内向上移动通过漏斗222和遮蓬214，且进入加工容器302内。如图10G中可见，第一亚级分1014在加工容器 302中，而置换流体312和清洁流体1002在主要容器702中。

包括第一亚级分1014的加工容器302随后可以从收集器200中取出，以经历进一步加工、分析、贮存等等。在取出加工容器302后，可以加入加工溶液，尽管加工溶液可以在靶材料回收之前已经存在于加工容器中。加工容器可以例如通过涡旋混合器进行振荡。已在振荡前以液体形式、在可溶解外壳或在易碎外壳中加入的加工溶液(未示出)，随后可以与血沉棕黄层混合，以实现转化且形成血沉棕黄层- 加工溶液混合物。血沉棕黄层-加工溶液混合物随后可以分配到基质例如显微镜载玻片上。

后续加工容器和置换流体可以用于收集血沉棕黄层802的另外亚级分，直至所有亚级分被收集或直至所需亚级分被收集。尽管序贯密度分级描述为用浮子和密封环执行，但序贯密度分级可以无需浮子、密封环或两者而执行。下文是用于执行序贯密度分级的示例方法：

1.将血液和浮子加入管中。

2.离心以实现血液的基于密度的分开(即血浆、血沉棕黄层和红细胞)。

3.在浮子的底部端部处将密封环应用于管和浮子周围；夹紧。

4.取出血浆。

5.加入其具有的密度大于靶材料密度的清洁流体。

6.***收集器-加工容器***，第一加工容器包括具有第一密度的第一置换流体。

7.再离心。

8.取出第一加工容器，其目前包括比第一置换流体密度更小的血沉棕黄层的第一亚级分。

9.将第二加工容器***收集器内，所述第二加工容器包括具有第二密度的第二置换流体，所述第二密度大于第一置换流体且小于清洁流体。

10.再离心。

11.取出第二加工容器，其目前包括比第二置换流体密度更小且比第一置换流体和第一亚级分两者密度更大的血沉棕黄层的第二亚级分。

12.使用相继密度更大的置换流体重复步骤9-11，以便收集相继密度更大的亚级分，直至获得所有所需亚级分。

靶材料可以使用任何适当的分析方法或技术进行分析，尽管更具体而言，细胞外和细胞内分析包括细胞内蛋白标记；显色染色；分子分析；基因组分析或核酸分析，包括但不限于基因组测序、DNA阵列、表达阵列、蛋白质阵列和DNA杂交阵列；原位杂交(“ISH”—用于分析DNA和/或RNA例如基因拷贝数变化的工具)；聚合酶链反应 (“PCR”)；逆转录PCR；或分支DNA(“bDNA”—用于分析DNA 和/或RNA例如mRNA表达水平的工具)分析。这些技术可以需要在分析之前的靶材料固定、渗透化处理和分离。可以被标记的细胞内蛋白质中的一些包括但不限于细胞角蛋白(“CK”)、肌动蛋白、Arp2/3、冠蛋白、肌营养不良蛋白、FtsZ、肌球蛋白、血影蛋白、微管蛋白、胶原、组织蛋白酶D、ALDH、PBGD、Akt1、Akt2、c-myc、胱天蛋白酶、存活蛋白、p27^kip、FOXC2、BRAF、磷酸-Akt1和2、磷酸-Erk1/2、Erk1/2、 P38MAPK、波形蛋白、ER、PgR、PI3K、pFAK、KRAS、ALKH1、Twist1、 Snail1、ZEB1、纤连蛋白、Slug、Ki-67、M30、MAGEA3、磷酸化受体激酶、改性组蛋白、染色质相关蛋白和MAGE。为了固定、渗透化处理或标记，可以使用固定剂(例如甲醛、***、甲醇、丙酮、多聚甲醛或戊二醛)、去污剂(例如皂苷、聚氧乙烯、毛地黄皂苷、辛基 β-葡糖苷、辛基β-硫代葡糖苷、1-S-辛基β-D-硫代吡喃葡糖苷、聚山梨醇酯20、CHAPS、CHAPSO、(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇或辛基酚环氧乙烷)、或标记剂(例如荧光标记抗体、酶缀合抗体、 Pap染剂、吉姆萨染剂、或苏木精和伊红染剂)。

在收集后，还可以使靶材料成像。为了成像，含有荧光探针的溶液可以用于标记靶材料，从而提供用于例如通过成像鉴定和表征的荧光信号。在悬浮液加入容器之前，在悬浮液加入容器之后但在离心之前，或在悬浮液已经历离心之后，含有荧光探针的溶液可以加入悬浮液中。荧光探针包括与配体结合的荧光分子。靶材料可以具有许多不同类型的表面标记物。每类表面标记物是能够附接特定配体例如抗体的分子，例如抗原。因此，通过使附接至特定表面标记物的配体与特定荧光分子缀合，配体可以用于分类靶材料且测定悬浮液中存在的靶材料的特定类型。合适荧光分子的例子包括但不限于量子点；商购可得的染料，例如荧光素、Hoechst、FITC(“异硫氰酸荧光素”)、R- 藻红蛋白(“PE”)、德克萨斯红、别藻蓝蛋白、Cy5、Cy7、级联蓝、 DAPI(“4',6-二脒基-2-苯基吲哚”)和TRITC(“四甲基罗丹明异硫氰酸酯”)；染料组合例如CY5PE、CY7APC和CY7PE；以及合成分子例如自装配核酸结构。可以使用许多溶液，使得每种溶液包括与不同配体结合的不同类型的荧光分子。

当收集靶材料且在非靶材料内混合时，靶材料或非靶材料的密度可以增加(例如通过将重量(weight)附接至靶材料或非靶材料，或通过具有靶材料或非靶材料吸附或摄入重量)，或可以减少(例如通过将浮标附接至靶材料或非靶材料，或通过具有靶材料或非靶材料吸附或摄入浮标)。重量或浮标可以与配体结合。靶材料可以具有许多不同类型的表面标记物。每类表面标记物是能够附接特定配体例如抗体的分子，例如抗原。因此，配体可以选择为特异性附接至靶材料或非靶材料。合适重量和/或浮标的例子包括但不限于由金属、玻璃、陶瓷、塑料或其组合组成的珠。在收集步骤和密度改变步骤后，可以执行第二轮序贯密度分级，从而获得更纯的靶材料或靶材料的各种组分。

用于说明目的的前述说明书使用特定命名法，以提供公开内容的彻底理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，具体实践本文描述的***和方法的细节不是必需的。具体实施方案的前述描述作为例子呈现，用于举例说明和描述的目的。它们没有旨在是所述精确形式的彻底描述或使本公开内容限制于所述精确形式。考虑到上文教导，许多修饰和变动是可能的。显示且描述了实施方案，以便最佳说明本公开内容的原理和实践应用，从而允许本领域技术人员最佳利用本公开内容和各个实施方案，具有如适合于考虑的特定用途的各种修饰。预期本公开内容的范围通过所附权利要求书及其等价物进行限定。

Claims

1.一种用于从样品中收集靶材料的方法，所述方法包括下述步骤：

使含有所述样品的主要容器离心，以实现血液的基于密度的分开；

将收集器***含有所述样品的主要容器的开放端部内；

将第n个加工容器***所述收集器内的腔内，

将第n种置换流体加入所述第n个加工容器中，所述第n种置换流体具有大于所述样品级分的第n种亚级分的密度，所述第n种亚级分包括所述靶材料的至少一部分；和

使所述主要容器、所述收集器和所述第n个加工容器离心，所述第n种置换流体经由所述收集器的插管流动到所述主要容器内，以将所述第n种亚级分经由所述收集器的插管从所述主要容器置换到所述第n个加工容器内，

其中所述样品级分是所述样品的一部分，和

其中所述级分的亚级分是所述样品的一部分中的一部分。

2.权利要求1所述的方法，其中重复将第n个加工容器***、将第n种置换流体加入所述第n个加工容器中和使所述主要容器、所述收集器和所述第n个加工容器离心的步骤,直至从所述样品中获得所有所需亚级分，其中每种相继置换流体具有大于每种先前置换流体的密度。

3.权利要求2所述的方法，其中n大于或等于2。

4.权利要求2所述的方法，其中所述亚级分中的至少一种包括所述靶材料。

5.权利要求3所述的方法，其中所述亚级分中的至少一种不包括所述靶材料。

6.权利要求2所述的方法，其中所述级分是血沉棕黄层，并且其中所述亚级分是所述血沉棕黄层的不同部分。

7.权利要求2所述的方法，其中所述置换流体选自：涂布有聚乙烯吡咯烷酮的胶体氧化硅粒子的溶液、多糖溶液、有机溶剂、液体蜡、气体、离子液体、基于聚合物的溶液、表面活性剂、氢氟烃、全氟化碳、基于硅的液体及其组合。

8.权利要求2所述的方法，其中所述置换流体无一与其他置换流体中的任一种混合。

9.权利要求1所述的方法，其中所述第n种亚级分包括所述靶材料。

10.权利要求1所述的方法，其进一步包括在离心前将浮子加入所述主要容器中。

11.权利要求10所述的方法，其进一步包括通过在离心后夹紧在所述浮子和主要容器之间形成密封。

12.权利要求1所述的方法，其中所述靶材料包括有核红细胞、白细胞、循环肿瘤细胞、螺旋体、疟疾诱导剂或免疫细胞。

13.权利要求1所述的方法，其进一步包括在收集后使所述靶材料成像的步骤。

14.权利要求1所述的方法，其中所述靶材料在收集后经历分子分析。

15.权利要求1所述的方法，其中至少一种分析物从所述靶材料中分离。

16.权利要求2所述的方法，其中所述置换流体是油。

17.权利要求16所述的方法，其中所述油选自橄榄油、矿物油、硅氧烷油、浸油、石蜡油和硅油。

18.权利要求7所述的方法，其中所述有机溶剂选自碘克沙醇、1,4-二噁烷、乙腈、乙酸乙酯、叔丁醇、环己酮、二氯甲烷、叔戊醇、甲基叔丁基醚、乙酸丁酯、己醇、硝基苯、甲苯、辛醇、辛烷、碳酸丙二醇酯和环丁砜。

19.权利要求7所述的方法，其中所述全氟化碳选自全氟萘烷、全氟全氢菲、全氟辛烷基溴化物、全氟酮、全氟环戊酮、全氟聚醚和全氟环己酮。

20.权利要求2所述的方法，其中所述置换流体选自氟化酮和氢氟醚。

21.权利要求7所述的方法，其中所述基于硅的液体选自氟硅氧烷、硅氧烷和苯甲基硅氧烷。