CN106039403B - 具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片 - Google Patents

具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片，解决角膜供体缺乏的技术问题。包括：制备胶原溶胀液；基于所述胶原溶胀液，制备胶原膜；在无菌条件下，以3D打印或涂覆的方式在所述胶原膜表面增加表面功能化改性物质，以形成具有生物活性的角膜修复植片。该表面功能化改性物质为由病患自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质为材料制备而成细微颗粒，能够改善高强度胶原膜的生物、生物稳定性，改善了角膜的生理功能，使改性后的胶原膜植入病患眼镜后具有良好的透明性和含水率，在临床上可以更快的恢复透明性，具备良好的生物相容性能，为角膜移植受体的角膜细胞培养提供了良好的支架。

Description

具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片
技术领域
本发明属于组织工程技术领域，具体地说，是涉及一种具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和使用所述制备方法制备的具有生物活性的角膜修复植片。
背景技术
角膜为与眼球前壁，是一种透明组织，主要行使屏障和屈光功能。
由于角膜直接与外界接触，极易受到机械外伤、热灼伤、酸碱侵蚀等，从而引起角膜疾病的发生，严重者甚至失明。现在角膜盲在全球已经是第二位的致盲眼病，全球每年大约有上千万人因角膜疾病而失明，这其中80%可以通过角膜移植手术脱盲。
但是，角膜盲却因为缺乏角膜供体而无法通过角膜移植手术脱盲。
发明内容
本申请提供了一种具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片，解决角膜供体缺乏的技术问题。
为解决上述技术问题，本申请采用以下技术方案予以实现：
提出一种具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：制备胶原溶胀液；基于所述胶原溶胀液，制备胶原膜；在无菌条件下，以3D打印或涂覆的方式在所述胶原膜表面增加表面功能化改性物质，以形成具有生物活性的角膜修复植片。
进一步的，所述制备胶原溶胀液，具体为：在动物结蹄组织中用蛋白酶消化法提取胶原蛋白；将提取的胶原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶胀，并混匀离心除去杂质，得到胶原溶胀液。
进一步的，所述在动物结蹄组织中用蛋白酶消化法提取胶原蛋白，具体为：在所述动物结蹄组织中按重量加入蛋白酶溶液；搅拌后置于恒温环境中进行设定时间的蛋白酶解反应，期间定时搅拌；在设定时间后终止酶解反应；将终止酶解反应的动物结蹄组织使用蒸馏水冲洗并干燥得到胶原蛋白。
进一步的，所述制备胶原膜，具体为：将所述胶原溶胀液通过饱和无机盐溶液盐析浓缩，得到胶原悬浮溶液；将所述胶原悬浮溶液进行离心和分离沉淀，得到胶原凝胶；将所述胶原凝胶置入模具后，低温冷冻进行冷冻干燥；将冻干的所述胶原凝胶置于两个聚四氟乙烯平板之间用平滑物体压平整成为致密胶原层；将所述压平整的致密胶原层进行交联处理得到胶原膜。
进一步的，所述表面功能化改性物质的制备步骤包括：将病患自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质在无菌条件下在培养皿内切碎，转移至消毒好的玻璃器皿中，增加胶原酶；将增加了胶原酶的所述切碎的角膜基质充分剪碎后，在微粒化装置内制备成均匀的细微颗粒；将所述细微颗粒离心、收集后，加入生物蛋白胶，形成所述表面功能化改性物质。
进一步的，所述蛋白酶为浓度为0.01%-0.5%的无花果蛋白酶。
进一步的，所述交联处理中使用的交联溶液为戊二醛溶液、EDC溶液、谷氨酰胺转氨酶溶液或环氧烷基溶液；所述交联溶液的质量浓度为1.5%-25%。
进一步的，所述细微颗粒直径为100-300微米。
进一步的，所述生物蛋白胶的主要成分为纤维蛋白、凝血酶和钙离子溶液。
提出一种具有生物活性的角膜修复植片，按照所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法制备而成。
与现有技术相比，本申请的优点和积极效果是：本申请提出的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法和角膜修复植片，在提取了胶原溶胀液制备出胶原膜后，采用3D打印或涂覆的方式在胶原膜表面增加表面功能化改性物质，该表面功能化改性物质为由病患自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质为材料制备而成细微颗粒，其在胶原膜表面对胶原膜进行表面功能改性，能够改善高强度胶原膜的物理、生物稳定性，具有更高的吸水性、复水和保水性，改善了角膜的生理功能，使改性后的胶原膜植入病患眼镜后具有良好的透明性和含水率，在临床上可以更快的恢复透明性，具备良好的生物相容性能，为角膜移植受体的角膜细胞培养提供了良好的支架。在胶原膜制备过程中，通过盐析、干燥和交联等步骤，制得的胶原膜强度高于传统的胶原蛋白膜，吸水后可自由弯曲和折叠，使得角膜修复植片具有良好的力学和机械性能。由此，能够为角膜受体提供角膜细胞生长基质实现角膜重建，解决了角膜供体缺乏的技术问题，角膜盲患者能够基于本案提供的角膜修复植片通过角膜移植手术脱盲。
结合附图阅读本申请实施方式的详细描述后，本申请的其他特点和优点将变得更加清楚。
附图说明
图1 为本申请提出的具有生物活性的角膜修复植片的方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式作进一步详细地说明。
本发明旨在提供一种具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，以及使用所述制备方法制备的具有生物活性的角膜修复植片，制备的角膜修复植片是针对角膜盲患者眼角膜细胞生存繁殖的支架材料，力学强度高于传统的胶原蛋白膜，采用患者自体角膜基质制备的细微颗粒对胶原蛋白膜进行表面功能改性，能够改善高强度胶原膜的物理、生物稳定性，也改善了角膜的生理功能，使改性后的胶原膜在临床上可以更快恢复透明性。
本发明提出的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤S11：制备胶原溶胀液。
具体的，在动物结蹄组织中用蛋白酶消化法提取出胶原蛋白；然后将提取的胶原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶胀，并混匀离心除去杂质，得到胶原溶胀液，放入4℃环境下保存备用。
步骤S12：基于胶原溶胀液，制备胶原膜。
具体的，将胶原溶胀液通过饱和无机盐溶液盐析浓缩，得到胶原悬浮溶液；将胶原悬浮溶液进行离心和分离沉淀，得到含水率小于10%的胶原凝胶；将胶原凝胶置入模具中，低温冷冻后进行冷冻干燥；将冻干的就按凝胶置于两个聚四氟乙烯平板之间用锟子等平滑物体压平整成为致密胶原层；最后将致密胶原层进行交联处理得到胶原膜。
其中，饱和无机盐溶液中的无机盐可以为钠盐、钾盐、钙盐或镁盐。
在交联处理中使用的交联溶液为戊二醛溶液、EDC溶液、谷氨酰胺转氨酶溶液或环氧烷基溶液；交联溶液的质量浓度为1.5%-25%。
步骤S13：在无菌条件下，以3D打印或涂覆的方式在所述胶原膜表面增加表面功能化改性物质，以形成具有生物活性的角膜修复植片。
该表面功能化改性物质的制备步骤如下：将病患自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质在无菌条件下在培养皿内切碎，转移至消毒好的玻璃器皿中，增加胶原酶；将增加了胶原酶的所述切碎的角膜基质充分剪碎后，在微粒化装置内制备成均匀的细微颗粒；将所述细微颗粒离心、收集后，加入生物蛋白胶，形成所述表面功能化改性物质。
这其中，细微颗粒直径需要在100微米至300微米之间；生物蛋白胶的主要成分为纤维蛋白、凝血酶和钙离子溶液等。
上述，本发明提出的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法中，在提取了胶原溶胀液制备出胶原膜后，采用3D打印或涂覆的方式在胶原膜表面增加表面功能化改性物质，该表面功能化改性物质为由病患自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质为材料制备而成细微颗粒，其在胶原膜表面对胶原膜进行表面功能改性，能够改善高强度胶原膜的物理、生物稳定性，具有更高的吸水性、复水和保水性，改善了角膜的生理功能，使改性后的胶原膜植入病患眼镜后具有良好的透明性和含水率，在临床上可以更快的恢复透明性，具备良好的生物相容性能为角膜移植受体的角膜细胞培养提供良好的支架。在胶原膜制备过程中，通过盐析、干燥和交联等步骤，制得的胶原膜强度高于传统的胶原蛋白膜，吸水后可自由弯曲和折叠，使得角膜修复植片具有良好的力学和机械性能。由此，能够为角膜受体提供角膜细胞生长基质实现角膜重建，解决了角膜供体缺乏的技术问题，角膜盲患者能够基于本案提供的角膜修复植片通过角膜移植手术脱盲。
基于提出的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，本发明还提出一种使用所述制备方法制备的具有生物活性的角膜修复植片。
下面以一个具体的实施例详细说明使用上述的制备方法制备具有生物活性的角膜修复植片的过程：
1、采用新鲜牛腱为原材料，于去离子水中充分清洗，并去除周围组织以及筋膜，暴露牛腱，进一步洗涤后在冷柜中充分冷冻。
去除牛腱用切片机横向切片，厚度约1毫米，称重后移入合适容器，按重量加入浓度为0.1%的无花果蛋白酶溶液进行酶处理，充分搅拌后置于37±1°的恒温箱内进行设定时间的蛋白酶解反应，反应期间定时搅拌。
在设定时间结束后加入过量的过氧化氢终止酶解反应，并将终止酶解反应的牛腱组织使用蒸馏水冲洗3-4次后干燥得到胶原蛋白。
将得到的胶原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶胀，混匀离心除去杂质，得到5g/L的胶原溶胀液。
2、将浓度为5g/L的胶原溶胀液与饱和氯化钾溶液混合，不断搅拌，使得胶原逐渐从胶原溶胀液中沉淀出来。并将该溶液以12000转/分的转速离心分离，清去上清液，收集沉淀的胶原，再挤压脱水，最终得到固含量约为50mg/L的胶原凝胶。
将胶原凝胶倾入模具中，低温冷冻后进行冷冻干燥。
将冻干的胶原凝胶置于两个聚四氟乙烯平板之间用锟子等平滑物体压平整使之成为致密胶原层。
将致密胶原层放入5%EDC溶液中交联12小时之后，漂洗去除交联剂，晾干得到胶原膜。
得到的胶原膜强度高于传统的胶原蛋白膜，吸收后可自由弯曲和折叠，具有良好的力学和机械性能。
3、将患者自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质在无菌条件下在培养皿中切碎，转移至消毒好的玻璃瓶内，加入胶原酶，充分剪碎，在微粒化装置中将其制备成均匀的细微颗粒，颗粒直径在100-300微米，离心，收集，加入生物蛋白胶，在无菌条件下将微组织化的角膜材料使用3D打印技术附在胶原膜表面，实现对胶原膜的功能改性；能够改善高强度胶原膜的物理、生物稳定性，具有更高的吸水性、复水和保水性，改善了角膜的生理功能，使改性后的胶原膜植入病患眼镜后具有良好的透明性和含水率，在临床上可以更快的恢复透明性，具备良好的生物相容性能，为角膜移植受体的角膜细胞培养提供了良好的支架。
上述本发明提出的制备方法采用的工艺步骤不影响胶原本身的分子结构和特性，保持了胶原特有的结构特性，提高了胶原膜的力学性能，吸水后可自由弯曲和折叠。利用自体角膜基质制备的细微颗粒改性后使胶原膜具有良好的物理、生物稳定性，以及具有更高的吸水性、复水和保水性，植入后具有很好的透明性和含水率，可快速恢复透明性，为角膜受体提供角膜细胞生长基质来实现角膜重建。
应该指出的是，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备胶原溶胀液；
基于所述胶原溶胀液，制备胶原膜；
在无菌条件下，以3D打印或涂覆的方式在所述胶原膜表面增加表面功能化改性物质，以形成具有生物活性的角膜修复植片；
所述表面功能化改性物质的制备步骤包括：
将病患自体的去除病变部分的含活性细胞的角膜基质在无菌条件下在培养皿内切碎，转移至消毒好的玻璃器皿中，增加胶原酶；
将增加了胶原酶的所述切碎的角膜基质充分剪碎后，在微粒化装置内制备成均匀的细微颗粒；
将所述细微颗粒离心、收集后，加入生物蛋白胶，形成所述表面功能化改性物质。
2.根据权利要求1所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述制备胶原溶胀液，具体为：
在动物结蹄组织中用蛋白酶消化法提取胶原蛋白；
将提取的胶原蛋白使用0.3%-0.5%的丙二酸溶液溶胀，并混匀离心除去杂质，得到胶原溶胀液。
3.根据权利要求2所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述在动物结蹄组织中用蛋白酶消化法提取胶原蛋白，具体为：
在所述动物结蹄组织中按重量加入蛋白酶溶液；
搅拌后置于恒温环境中进行设定时间的蛋白酶解反应，期间定时搅拌；
在设定时间后终止酶解反应；
将终止酶解反应的动物结蹄组织使用蒸馏水冲洗并干燥得到胶原蛋白。
4.根据权利要求1所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述制备胶原膜，具体为：
将所述胶原溶胀液通过饱和无机盐溶液盐析浓缩，得到胶原悬浮溶液；
将所述胶原悬浮溶液进行离心和分离沉淀，得到胶原凝胶；
将所述胶原凝胶置入模具后，低温冷冻进行冷冻干燥；
将冻干的所述胶原凝胶置于两个聚四氟乙烯平板之间用平滑物体压平整成为致密胶原层；
将所述压平整的致密胶原层进行交联处理得到胶原膜。
5.根据权利要求2所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为浓度为0.01%-0.5%的无花果蛋白酶。
6.根据权利要求4所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述交联处理中使用的交联溶液为戊二醛溶液、EDC溶液、谷氨酰胺转氨酶溶液或环氧烷基溶液；所述交联溶液的质量浓度为1.5%-25%。
7.根据权利要求1所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述细微颗粒直径为100-300微米。
8.根据权利要求1所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法，其特征在于，所述生物蛋白胶的主要成分为纤维蛋白、凝血酶和钙离子溶液。
9.一种具有生物活性的角膜修复植片，其特征在于，按照如权利要求1-8任一项所述的具有生物活性的角膜修复植片的制备方法制备而成。
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