CN106039304B - 一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗 - Google Patents

一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原是由保藏编号为CCTCC M 2016098的X33‑VP2菌株表达的猪细小病毒VP2蛋白；保藏编号为CGMCC No.8503的猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。本发明的猪细小病毒、猪流行性腹泻和大肠埃希氏菌三联疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种疾病，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。

Description

一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗。
背景技术
猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一，可导致母猪流产、早产、产死胎、木乃伊胎、弱仔及母猪不育和新生仔猪大量死亡。我国自20世纪80年代后相继从各地分离到PPV，经调查发现一些猪群中该病的血清学阳性率可达85％以上。PPV常呈隐性感染存在，尤其是低剂量持续感染的现象经常发生。该病毒除引起母猪的繁殖障碍，还可与其他病原体协同作用引起多种疾病，给养猪业造成很大的经济损失。猪细小病毒血清型单一、具有较高的免疫原性，疫苗接种是控制PPV感染的有效措施。
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻和食欲下降为基本特征，本病对不同年龄的猪均易感，尤其哺乳仔猪危害最严重，是一种高度接触性传染病。该病于1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。近几年，全国猪流行性腹泻呈爆发流行，给养殖业造成了巨大的经济损失。该病感染目前还没有有效的治疗方法，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，国外主要是韩国的弱毒苗，国内主要是哈兽研研制的猪传染性胃肠炎等疫苗，但临床应用效果不佳。
另外，仔猪黄痢是由特定O抗原型的致病性大肠埃希氏菌(E.coli)引起的初生仔猪的以下痢为特征的传染病。该病主要导致1周龄内(主要是1～3日龄)仔猪发病，以排出黄色水样粪便和渐进性死亡为特征，是影响规模化种猪场和农村散养猪仔猪成活率的重要疾病。但目前市场上并没有有效的预防猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗，从而弥补现有技术的不足。
本发明的猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联疫苗，包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原包含有猪细小病毒VP2蛋白、猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原。
其中猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,表达猪细小病毒VP2蛋白的巴斯德毕赤酵母菌X33-VP2(Pichia pastoris X33-VP2),已经于2016年3月9日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016098。
所述的猪流行性腹泻病毒，实施例优选为猪流行性腹泻病毒SD10株(猪流行性腹泻病毒Porcine Epidemic Diarrhea Virus),于2013年11月08日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.8503。
所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶佐剂。
上述的三联疫苗中猪细小病毒VP2蛋白含量≥150μg/ml、猪流行性腹泻病毒含量≥106.0TCID50/ml，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位/ml、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml。
本发明的猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种疾病，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。
附图说明
图1是本发明实施例猪细小病毒VP2蛋白基因PCR的扩增鉴定图，
图2是本发明的VP2蛋白的blast比较图；
图3是本发明实施例重组菌发酵诱导表达产物SDS-PAGE电泳检定图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行具体说明。
实施例1：猪细小病毒(PPV)VP2基因的筛选
2010年在山东省多个养殖场出现了猪细小病毒病的症状，而发病个体猪之前已经注射了已有的细小病毒疫苗，推测感染的病毒发生了变异；因此从发病个体中进行猪细小病毒的筛选；最终筛选出了猪细小病毒PPV1。
为验证筛选的病毒的抗原性，使用了包含筛选的PPV1毒株在内的5个不同来源的病毒株作为抗原制备疫苗，免疫SPF猪后用筛选的病毒液进行攻毒实验，结果表明相比于其它猪细小病毒疫苗，其本身制备的疫苗具有更好的免疫效果(p＜0.05)，因此确定其发生了遗传上的变异。
根据猪细小病毒VP2蛋白的抗原特性和氨基酸序列，设计合成一对引物,primer1:5'-GCGGTACCATGTCTGAAAATGTTGAAGAAC-3',含KpnI位点；
primer 2:5'-GCGGCCGCCTAATATAATTTTCTTGGAAT-3'，含NotI位点。取PPV株病毒基因作为模板，PCR扩增目的片段，产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆pMD18-T-VP2，经序列测定(图1为猪细小病毒VP2基因PCR的扩增鉴定图)；其核苷酸序列为SEQ IDNO:2，编码的蛋白的序列为SEQ ID NO:1。与NCBI中公开的猪细小病毒VP2基因相比，最高的同源性为96％；在存在579氨基酸的情况下，表明本发明的猪细小病毒VP2蛋白与已公开的蛋白存在不少于23个氨基酸的差异(图2)。
实施例2：重组猪细小病毒VP2蛋白的制备
包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组VP2蛋白的诱导和提取纯化。具体如下：将阳性克隆质粒pMD18-T-VP2和表达载体pPICZα载体分别用KpnI和NotI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约1.7kb和3.3kb片段,在16℃定向连接构建pPICZα-VP2表达载体，经酶切鉴定正确后；将质粒线性化后，电转化入毕赤酵母感受态细胞，构建毕赤酵母表达菌株X33-VP2，并提取表达菌株X33-VP2基因组，使用引物primer 1和primer 2进行PCR鉴定正确,于2016年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016098；进行诱导表达，挑取含X33-VP2的单克隆菌落接种于BMGY液体培养基,30℃振荡培养过夜，离心收集菌体，用适量的BMMY悬浮后，加入0.55％甲醇，30℃诱导96小时。4℃,9000rpm离心5min，保留上清液，加入40％的硫酸铵沉淀后，12000rpm离心5min收集蛋白沉淀，用PBS重溶蛋白。加入蛋白电泳上样缓冲液，沸水煮8分钟后，用12％的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图3是重组菌发酵诱导表达产物的SDS-PAGE电泳检定图,图中1、2、为VP2蛋白表达产物沉淀，M为分子量标准蛋白质)。
将生产猪细小病毒VP2蛋白的毕赤酵母表达菌株X33-VP2株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016098。
1.制苗用菌液的制备 将X33-VP2菌种接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基，选取典型菌落2～3个混合于少量YPD液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时，经镜检后，置2～8℃保存，作为二级种子。
2.制苗用蛋白的制备 按发酵罐容积60％(V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入YNB和生物素，接种猪细小病毒VP2蛋白生产用毕赤酵母X33-VP2二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。
3.灭活 将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
4.半成品检验
(1)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
(2)蛋白含量测定 按Bradford法检测蛋白含量。
(3)灭活检验 将灭活后的蛋白液取少量接种YPD固体培养基，置于置30℃继续培养72小时。观察无菌落生长，判灭活检验合格。
实施例3：亚单位灭活疫苗的制备
经过检验合格后的半成品VP2蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。
(1)油相制备 取兽用白油95份，硬脂酸铝1份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加司本－80 5份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。
(2)水相制备 将猪细小病毒VP2蛋白使用生理盐水稀释成150μg/0.1ml。取灭菌后的5份吐温-80，加入配液罐中，同时加入制苗用蛋白液95份，搅拌20～30min，使吐温-80完全溶解。
(3)乳化 取油相2份放于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
疫苗成品检验
(1)性状
外观 疫苗应为乳白色乳剂，无杂质并且外包装应合格。
剂型 为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性 吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相应不超过0.5ml。
黏度 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(2)装量检查 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(3)无菌检验 按现行《中国兽药典》附录进行，应符合规定。
(4)安全检验 用50日龄仔猪5只，每只颈部皮下注射疫苗1.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况。应不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。
(5)效力检验 初产母猪5只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄初产母猪作为不免疫作对照。母猪配种后，怀孕至38-40天时攻毒，结果从接种亚单位疫苗的母猪的血浆中没有分离到病毒，而对照母猪的血浆中则分离到病毒。攻毒40天后宰杀，接种母猪共怀65头胎猪，从它们的脏器中均没有分离到病毒，而对照母猪共怀60头胎猪，其中有31头的脏器分离到病毒。结果表明，用猪细小病毒VP2蛋白亚单位疫苗免疫母猪能够抵抗病毒的攻击，不出现临床症状，胎猪病毒分离均为阴性。对照组，出现轻微的临床症状，胎猪病毒分离阳性率超过50％，表明猪细小病毒亚单位灭活疫苗能够提供有效的保护。
本发明的三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
实施例4、三联疫苗的制备
(1)制苗用猪流行性腹泻病毒抗原的制备 制备Vero细胞单层，取猪流行性腹泻病毒SD10株按1％接种量接种到Vero细胞单层，置37℃吸附1.5小时，加含2％新生牛血清MEM维持液继续培养；接毒后，当细胞病变达75％以上时收获病毒液，反复冻融3次；
(2)取冻融后的病毒液测定病毒含量，每0.1ml病毒含量不低于105.0TCID50；将检验合格的细胞毒液置于灭菌容器内，加入10％***溶液至终浓度为0.2％，37℃灭活18小时；
(3)制苗用纤毛抗原的制备 按发酵罐容积70％(V/V)加入Minca液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至35～37℃，按3％(V/V)向发酵罐中加入培养物，调节培养温度至37℃，调节融氧浓度至35％，培养5～7小时分别制备含K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83549菌株的菌液、含K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83644菌株的菌液和含987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌C83710菌株的菌液。
(4)各菌株发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌泥按0.1g/ml比例重新悬浮于生理盐水中。采用剪切机对在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25分钟分别进行各纤毛抗原的提取；
(5)按每1ml成品苗中，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位，配制混合纤毛液；
(6)制苗用猪细小病毒VP2蛋白的制备 将生产猪细小病毒VP2蛋白的毕赤酵母表达菌株X33-VP2株(于2016年3月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016098的X33-VP2菌株)接种于含博莱霉素的YPD液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时。然后划线接种于加有博莱霉素的YPD固体培养基，选取典型菌落2～3个混合于少量YPD液体培养基中，置30℃摇床中振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于BMGY液体培养基中，30℃振荡培养16～18小时，经镜检后，置2～8℃保存，作为二级种子。
(7)按发酵罐容积60％(V/V)加入BMGY不完全液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌30分钟，待培养基温度降至32℃，加入YNB和生物素，接种(6)中制备的猪细小病毒VP2蛋白生产用毕赤酵母二级种子X33-VP2(保藏编号为CCTCC M2016098)，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度30℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养24小时后的菌液补加甲醇,甲醇的补加速度为2ml/h/L诱导表达培养，按照以上发酵控制参数及工艺诱导表达120小时；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的上清，加入硫酸铵沉淀蛋白后，按12000r/min离心30分钟收获沉淀，加入适量的生理盐水溶解蛋白沉淀。
(8)灭活 将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的病毒未能接触灭活剂。37℃灭活16小时后取出，置2～8℃保存。
(9)按每1ml成品苗中，猪细小病毒VP2蛋白含量≥150μg，配制蛋白抗原。
(10)将(2)中的病毒液、(5)中的纤毛溶液和(8)中的蛋白溶液按比例混合后，与疫苗佐剂混合制备成疫苗。
实施例2、三联灭活疫苗的检验
(1)性状 静置后，上层为淡红色澄明液体，下层为黄白色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。
(2)无菌检验 按照《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，3批活疫苗均无菌生长。
(3)安全检验 用14日龄未吃初乳仔猪20头，随机分成4组，每组5头，第1、2、3组分别颈部肌肉注射猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联灭活疫苗各4ml/头，观察14日，注射疫苗组的15头猪均健活，未见异常反应发生，对照组仔猪未见异常。
表1疫苗性状、无菌检验、安全检验和甲醛残留量检测结果
Figure BDA0001002756320000071
Figure BDA0001002756320000081
(4)效力检验
4.1猪细小病毒部分 初产母猪5只，每只颈部皮下注射疫苗，0.5ml/只，另取5只同日龄初产母猪作为不免疫作对照。母猪配种后，怀孕至38-40天时攻毒，结果从接种亚单位疫苗的母猪的血浆中没有分离到病毒，而对照母猪的血浆中则分离到病毒。攻毒40天后宰杀，接种母猪共怀65头胎猪，从它们的脏器中均没有分离到病毒，而对照母猪共怀60头胎猪，其中有31头的脏器分离到病毒。结果表明，用猪细小病毒VP2蛋白亚单位疫苗免疫母猪能够抵抗病毒的攻击，不出现临床症状，胎猪病毒分离均为阴性。对照组，出现轻微的临床症状，胎猪病毒分离阳性率超过50％，表明猪细小病毒亚单位灭活疫苗能够提供有效的保护。
4.2猪流行性腹泻疫苗部分 用8头猪流行性腹泻抗体阴性、抗原阴产前30-45日龄妊娠母猪，随机分成4组，每组2头，第1、2、3组分别颈部肌肉注射猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联灭活疫苗201501、201502、201503批，2头不注射作为对照组，每组各取5-7日龄未吃初乳仔猪5头，口服猪流行性腹泻强毒5ml/头，观察临床表现，根据发病结果判定疫苗的保护力。攻毒结果表明，免疫组分别4/5、5/5、5/5保护，对照组4/5发病。
4.3大肠埃希氏杆菌疫苗部分的效力检验 取成品疫苗5～10ml，于－20℃反复冻融8次，以3000r/min离心15min，取管底析出的水相测定K88、K99、987P三种纤毛的抗原单位，以析出的水相中，K88纤毛抗原≥300个抗原单位/ml、K99纤毛抗原≥150个抗原单位/ml、987P纤毛抗原≥150个抗原单位/ml判为疫苗效力检验合格。
(5)甲醛残留量检测 3批灭活疫苗的检测结果分别为0.096％、0.087％、0.091％，均低于兽用生物制品通则的规定(0.2％)。
本发明的猪细小病毒、猪流行性腹泻、大肠埃希氏菌三联灭活疫苗免疫原性好，免疫后抗体产生快，产生的抗体滴度高且维持时间长，保存期长，免疫剂量小，选用的佐剂易于注射，可一针防治三种疾病，在配种前进行免疫注射可使怀孕母猪所产仔猪获得较好的被动免疫，使仔猪产生坚强的免疫力，能够抵抗强毒的攻击，提高仔猪的存活率。而且，对比实验表明，用目前市场上出售的猪细小病疫苗进行免疫，再用本发明筛选的PPV1株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明的三联疫苗的效果；推测是由于PPV1株的VP2蛋白疫苗发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
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Claims (3)

1.一种三联疫苗，其特征在于，所述的疫苗包含有抗原和疫苗佐剂，其中抗原包含有猪细小病毒VP2蛋白、猪流行性腹泻病毒和大肠埃希氏菌K88、K99、987P的纤毛抗原；
所述的猪细小病毒VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，
所述的猪细小病毒VP2蛋白是由保藏编号为CCTCC NO:M 2016098的巴斯德毕赤酵母菌表达制备的；
所述的猪流行性腹泻病毒的保藏编号为CGMCC No.8503。
2.如权利要求1所述的三联疫苗，其特征在于，所述的疫苗佐剂为氢氧化铝胶佐剂。
3.如权利要求1所述的三联疫苗，其特征在于，所述的疫苗中猪细小病毒VP2蛋白含量≥150μg/ml、猪流行性腹泻病毒含量≥106.0TCID50/ml，K88纤毛抗原含量≥100个抗原单位/ml、K99纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml、987P纤毛抗原含量≥50个抗原单位/ml。
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